残留溶剂方法学验证方案

阿莫西林残留溶剂分析方法验证方案

文件编号： VP-01-06-00-041

方案起草

部 门 质量管理部 签名 日期 方案审核

部门 质量管理部 质量管理部 签名 日期 方案批准

质量受权人签名

批准日期 生效日期： 年 月 日

1、概述

在阿莫西林制备工艺中，使用了甲醇与丙酮两种对人体具有危害的二类溶剂，我公司为了确保阿莫西林原料中甲醇与丙酮的残留在国家要求范围内，开发了阿莫西林胶囊中甲醇与丙酮残留的检测方法，按照《中国药典》2015年版的要求对此检测方法进行方法学验证。 2、验证目的

证明本方法能满足阿莫西林原料中甲醇与丙酮的残留溶剂测定，确保阿莫西林原料中甲醇与丙酮的残留溶剂检测方法准确、重现并耐用，检测结果数据真实可靠。 3、验证范围

本验证方案适用于阿莫西林中甲醇与丙酮的残留溶剂检验方法验证。 4、确认小组成员及职责

姓 名 袁家勇 吴涛 彭雪梅 张海 李树冰 部门及职务 质量负责人 质量 QA QC QC 验证小组中职务及职责 组长：验证方案的批准实施、验证报告的批准。 副组长：负责起草、组织实施验证方案，完成验证报告。 组员：负责审核验证方案及实施过程的监督和检查。 组员：执行验证方案，样品的质量检验及记录的填写。 组员：执行验证方案，样品的质量检验及记录的填写。 5、验证前的风险评估

5.1验证小组人员按照《质量风险管理规程》，对分析方法进行了风险评估，确定了需进行方法确认的项目。

5.1.1严重性（S）： 危害可能产生后果的程度。严重程度分为五个等级。

级 别 第五级 级别描述 非常严重 评定标准 可能导致检测结果不准确或不可靠，直接影响产品质量。 可能导致检测结果产生重大偏差，对产品质量有较大影响。 可能导致检测结果产生偏差，对产品质量有一定影响。 可能导致检测结果产生偏差，但在可接受范围。 对检测结果无影响或影响可以忽略。 赋分值 5 第四级 严重 4 第三级 中等 3 第二级 第一级 轻微 可忽略 2 1 5.1.2可能性（P）：影响检测结果的事件发生的可能性频率或概率，建立以下五个等级：

级 别 第五级 第四级 第三级 第二级 第一级 级别描述 很高 高 中等 低 稀少 评定标准 难控制，非常有可能发生 较难控制，很有可能发生 可以控制，可能发生 容易控制，不太可能发生 很容易控制，发生的几率极低 赋分值 5 4 3 2 1 5.1.3可检测性（D）： 检测到异常情况存在的能力的程度，定义如下：

级 别 第五级 第四级 级别描述 几乎不可能 微小 评定标准 没有已知的控制方法能找出异常情况或现行控制方法找出异常情况的可能性很微小。 现行控制方法找出异常情况的可能性很小。 赋分值 5 4 第三级 第二级 第一级 中等 高 很高 现行控制方法找出异常情况的可能性中等。 现行控制方法找出异常情况的可能性高。 现行控制方法找出异常情况的可能性很高，几乎肯定能找出异常情况。 3 2 1 5.2风险优先数量等级判定（RPN） 5.2.1风险等级判定标准的确定

RPN是事件发生的严重程度、可能性和可探测性三者乘积，用来衡量可能的仪器缺陷，以便采取可能的预防措施。

RPN = Severity(严重程度)×Possibility(发生的可能性)×Detection(可探测性)

风险得分 RPN≤8 9≤RPN≤36 37≤RPN≤125 5.2.2风险评价和处理

风险得分 低风险 风险级别 低风险 中风险 高风险 风险接受及控制措施 风险可接受，无需采取额外的风险控制措施 要求采用控制措施，通过提高可检测性及（或）降低风险产生中风险 的可能性来降低最终风险水平，所采用的措施可以是规程或者是技术措施，但均应经过验证。 高风险 风险不可以接受，需采取风险控制/降低措施 注：当RPN≤8，但严重性S为5时，仍需按中等以上风险进行后续控制。

5.3风险分析

风险项目 可能的失败模式 潜在影响 S P D RPN 风险级别 建议采取措施 专属性 不具有专属性 不能有效分离 3 3 3 27 中 首次使用前对专属性进行验证 对分析方法的定定量限与检测限 定量限、检测限高 甲醇或丙酮无法被检出 3 3 3 27 中 量限、检测限进行验证 精密度 不同时间或人员测定的精密度差 结果不一致 3 3 3 27 中 首次使用前对精密度进行验证 首次使用前对准确度进行验证 首次使用前对线性进行验证 首次使用前对范围进行验证 首次使用前对耐用性进行验证 准确度 回收率低 结果不准确 3 3 3 27 中 线性 线性差 结果不准确 浓度超过范围后结果不3 3 3 27 中 范围 范围窄 准确 参数微小变化对结果影3 3 3 27 中 耐用性 耐用性差 响较大 3 3 3 27 中 6、验证前的准备 6.1人员培训

在本方案实施前，已对方案实施过程中涉及人员进行培训，以保证方案顺利实施，做好培训记录，培训记录见表1。

表1 训确认表

文件名称 阿莫西林残留溶剂分析方法验证方案 结论 检查人/日期 复核人/日期 培训人 参加培训人员 溯源资料 7、验证内容

7.1验证项目及可接受标准

验证项目 可接受标准 溶剂空白应不干扰甲醇和丙酮的检测。 专属性 甲醇和丙酮与相邻峰之间的分离度≥1.5 样品加入试验：不干扰残留溶剂测定，溶剂峰分离度≥1.5 对照溶液连续进样6次的峰面积的RSD≤10% 系统适用性 理论塔板数≥2000 残留溶剂峰分离度≥1.5 定量限 检测限 线性及范围 准确度 精密度 耐用性 符合S/N=10±1的要求 符合S/N=3±1的要求 相关系数R2≥0.99 回收率均在80%～120%，且RSD不得大于10%。 重复性与中间精密度各6份供试品测得的结果RSD均不得大于10.0%，共计12份结果的RSD不得大于15%。 各考察色谱条件下，各项改变测试结果均应满足系统适用性要求。 7.2仪器配置检查（见表2）

表2仪器配置表

名称 气相色谱仪 万分之一电子天平 十万分之一电子天平 检查人/日期 型号 复核人/日期 编号 7.3验证所用的试剂及样品(见表3)

表3验证所用试剂及样品

名称 丙酮 甲醇 N,N二甲基乙酰胺（DMAC） 规格 分析纯 色谱纯 分析纯 批号 供应商 阿莫西林 检查人/日期 复核人/日期 7.3实验条件：

检测器：FID（氢火焰离子化检测器） 色谱柱：WEL-624 30m×0.32mm×0.25um

升温程序：50℃，维持6min，60℃/min的速率升温至240℃，维持3分钟 进样口温度：200℃ 检测器温度：260℃ 载气：氮气 流速：2.98 ml/min

分流比1:1 进样方式：顶空进样，顶空瓶平衡温度80℃，平衡时间30min 7.4方法学验证 7.4.1专属性试验

7.4.1.1目的：确定所需测定的目标溶剂可以很好的分离，并且不会受到来自溶媒及可能出现的杂质的干扰。 7.4.1.2溶液的配制

7.4.1.2.1空白溶剂：精密移取5mlDMAC置于20ml顶空瓶中，密封。

7.4.1.2.2甲醇贮备液：精密称取甲醇30mg，置于已有20mlDMAC的50ml量瓶中，加DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。

7.4.1.2.3甲醇定位溶液：精密量取甲醇储备液5ml置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

7.4.1.2.4丙酮贮备液：精密称取甲醇50mg，置于已有20mlDMAC的50ml量瓶中，加DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。

7.4.1.2.5丙酮定位溶液：精密量取丙酮储备液5ml置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

7.4.1.2.6对照溶液：精密量取甲醇贮备液5ml，丙酮储备液5ml置50ml量瓶中，用DMAC

稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

7.4.1.2.7样品溶液：取样品约0.1g，置于20ml顶空瓶中，精密加入5mlDMAC溶解，密封。密封，超声使其分散均匀，即得。

7.4.1.2.7样品-对照溶液：取样品约0.1g，置于20ml顶空瓶中，精密加入上述对照溶液5ml，密封，超声使其分散均匀，即得。 7.4.1.3测定

分别将上述空白溶剂、甲醇定位溶液、丙酮定位溶液、对照溶液、样品溶液、样品-对照溶液混合溶液各进样1针，记录色谱图。 7.4.1.4可接受标准：

￭ 空白溶剂色谱图中目标峰出峰位置附近无显著干扰峰；

￭ 对照溶液谱图中甲醇和丙酮目标峰与相邻峰的分离度应不小于1.5，理论塔板数≥5000； ￭ 样品中可能出现的杂质对溶剂测定无干扰。 7.4.1.5试验结果（见表4）

表4专属性试验结果

出峰顺序 1 2 3 结论 试验人/日期 名称 保留时间 复核人/日期 分离度 理论塔板数 7.4.2系统适用性试验

7.4.2.1目的：确认用本仪器系统进行残留溶剂测定方法的验证符合要求。 7.4.2.2溶液的配制：

系统适用性溶液的配制： 取专属性项下对照溶液，作为系统适用性溶液。 7.4.2.3测定：取系统适用性溶液，连续进样6次，记录色谱图。 7.4.2.4可接受标准：

￭ 对照溶液连续6次进样所得图谱中目标峰峰面积RSD≤10%，保留时间的RSD≤1% ￭ 理论塔板数≥2000； ￭ 分离度≥1.5

7.4.2.5试验结果（见表5）

表5 系统适用性试验结果

序号 保留时间（min） 甲醇 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD（%） 结论 试验人/日期 丙酮 甲醇 峰面积 丙酮 复核人/日期 理论塔板数 甲醇 丙酮 分离度 甲醇 丙酮 7.4.3检测限

7.4.3.1目的：确定在本色谱条件下，被测溶剂可以被检出的最低浓度。 7.4.3.2溶液的配制

取专属性项下的甲醇定位溶液及丙酮定位溶液，用DMAC逐级稀释成一定浓度的溶液，精密移取5ml,置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，直到符合S/N=3±1的标准，该浓度的溶液即为检测限溶液，取此溶液5ml共3份，分别置于20ml顶空瓶中，密封。

7.4.3.3测定：取检测限溶液，顶空进样，共3次，记录色谱图，计算各溶剂的最小检测限。 7.4.3.3可接受标准：符合S/N=3±1 7.4.3.4试验结果（见表6）

表6检测限试验结果

残留溶剂名称 进样次数 1 甲醇 2 3 1 丙酮 2 3 结论 试验人/日期 S/N 复核人/日期 S/N平均值 检测限浓度(μg/ml) 相对样品限度(%) 7.4.4定量限

7.4.4.1目的：确定在本色谱条件下，被测溶剂可以被准确定量的最低浓度。 7.4.4.2溶液的配制

取专属性项下的甲醇定位溶液及丙酮定位溶液，用DMAC逐级稀释成一定浓度的溶液，精密移取5ml,置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，直到符合S/N=10±1的标准，该浓度的溶液即为定量限溶液，取此溶液5ml共5份，分别置于20ml顶空瓶中，密封。 7.4.4.3测定：取定量限溶液，顶空进样，平行操作共5次，记录色谱图，计算各溶剂的最小定量限。

7.4.4.3可接受标准：符合S/N=10±1，重复5份的峰面积RSD不大于10% 7.4.4.4试验结果（见表7）

表7定量限试验结果

残留溶剂名称 进样次数 1 2 甲醇 3 4 5 1 2 丙酮 3 4 5 结论 试验人/日期 峰面积 S/N 复核人/日期 S/N平均值 检测限浓度 相对样品测定限度 7.4.5线性与范围

7.4.5.1目的：测试在定量限至限度标准的120%范围内，待测溶剂的响应值与浓度之间的线性关系。

7.4.5.2溶液的配制：

定量限：取定量限项下的浓度及平均峰面积值进行计算。

线性贮备液：取专属性项下甲醇储备液、丙酮储备液作为线性储备液。

线性溶液1：分别精密量取甲醇储备液、丙酮储备液各2ml，置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀，即得（甲醇24ug/ml，丙酮40ug/ml）。

线性溶液2：分别精密量取甲醇储备液、丙酮储备液各3ml，置50ml量瓶中，用DMAC

稀释至刻度，摇匀，即得（甲醇36ug/ml，丙酮60ug/ml）。

线性溶液3：分别精密量取甲醇储备液、丙酮储备液各4ml，置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀，即得（甲醇48ug/ml，丙酮80ug/ml）。

线性溶液4：分别精密量取甲醇储备液、丙酮储备液各5ml，置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀，即得（甲醇60ug/ml，丙酮100ug/ml）。

线性溶液5：分别精密量取甲醇储备液、丙酮储备液各6ml，置50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度，摇匀，即得（甲醇72ug/ml，丙酮120ug/ml）。

7.4.5.3测定：精密量取各线性溶液5ml置于顶空瓶中，密封，顶空进样检测，记录色谱图，记录每个浓度点的峰面积。以浓度对峰面积做回归曲线，以二次回归得到回归方程及相关系数。

7.4.5.4可接受标准：线性相关系数R2不小于0.99。 7.4.5.5试验结果（见表8）

表8线性与范围试验结果

1 溶剂 项目 定量限 浓度（μg/ml） 峰面积 甲醇 回归方程 相关系数R2 浓度（μg/ml） 峰面积 丙酮 回归方程 相关系数R2 2 限度标准的40% 3 限度标准的60% 4 限度标准的80% 5 限度标准 6 限度标准的120% 结论 试验人/日期

复核人/日期 Excel绘制曲线并计算相关系数

7.4.6准确度

7.4.6.1目的：考察残留溶剂分析方法测定结果与真实值或参考值接近的程度。 7.4.6.2溶液的配制； 空白溶液：DMAC

对照贮备溶液①：精密称取甲醇30mg、丙酮50mg置于已加入20mlDMAC的50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度并摇匀，即得。

对照贮备溶液②：精密称取甲醇30mg、丙酮50mg置于已加入20mlDMAC的50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度并摇匀，即得。

对照溶液①：精密量取对照贮备溶液①5ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

对照溶液②：精密量取对照贮备溶液②5ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

供试品溶液：精密称取本品0.1g，置20ml顶空瓶中，精密加入DMAC5ml，密封，超声使其分散均匀，摇匀，平行配制2份。

80%对照溶液：精密量取对照贮备溶液①4ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。

120%对照溶液：精密量取对照贮备溶液①6ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。

80%准确度溶液的配制：精密称取本品0.1g，置20ml顶空瓶中，精密加入80%对照溶液5ml，作为80%回收溶液，密封，超声使其分散均匀，摇匀，平行配制3份。

100%准确度溶液的配制：精密称取本品0.1g，置20ml顶空瓶中，精密加入对照溶液①5ml，

作为100%回收溶液，密封，超声使其分散均匀，摇匀，平行配制3份。

120%准确度溶液的配制：精密称取本品0.1g，置20ml顶空瓶中，精密加入120%对照溶液5ml，作为120%回收溶液，密封，超声使其分散均匀，摇匀，平行配制3份。

7.4.6.3测定：取对照溶液①连续顶空进样5次，对照溶液②连续顶空进样2次，供试品溶液、80%准确度溶液、100%准确度溶液、120%准确度溶液顶空进样1次，记录色谱图，计算各浓度点的回收率。

计算公式： RfAu5WsCsRf1Rf2残留Rf100% Rf

Wu2AsVS

测得量＝RfAF5

回收率＝测得量-样品原有量100%

加入量 式中：Rf -----甲醇或丙酮的校正因子；

Rf1-----五针对照液①中甲醇或丙酮的校正因子的平均值； Rf2-----两针对照液②中甲醇或丙酮的校正因子的平均值； Rf-----对照液中甲醇或丙酮的校正因子的平均值； WS-----对照液中甲醇或丙酮的称样量，mg； Cs-----对照品的含量，%；

Vs-----对照品稀释倍数。

As-----对照液色谱图中甲醇或丙酮的峰面积。 Wu-----供试品的称样量，mg；

Au-----供试品色谱图中甲醇或丙酮的峰面积。 AF-----准确度溶液色谱图中甲醇或丙酮的峰面积。

7.4.6.4可接受标准：9份回收率均在80%～120%，且RSD不得大于10%。 7.4.6.5试验结果（见表9）：

表9 准确度试验结果

溶项目 剂 1 样品原有量（ug） 加入量（ug） 测得量（ug） 回收率（%） 2 平均回收率（%） RSD（%） 丙酮 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 结论 试验人/日期 复核人/日期 样品原有量（ug） 加入量（ug） 测得量（ug） 3 1 2 3 1 2 3 80%准确度溶液 100%准确度溶液 120%准确度溶液 甲醇 7.4.7精密度 7.4.7.1重复性

7.4.7.1.1目的：考察重复测定供试品中溶剂残留结果之间的接近程度。 7.4.7.1.2溶液配制：

对照溶液①：同7.4.6.2 对照溶液②：同7.4.6.2

供试品溶液：精密称取阿莫西林0.1g置20ml顶空瓶中，加5mlN，N-二甲基乙酰胺，密封，超声使其分散均匀，摇匀即得。平行制备6份。

7.4.7.1.3测定：取对照溶液①连续顶空进样5次，对照溶液②连续顶空进样2次，各供试品溶液顶空进样1次，记录色谱图。 7.4.7.2中间精密度

7.4.7.2.1目的：测定在同一实验室下的变异：不同时间，不同试验者测试结果的重现程度。 7.4.7.2.2溶液配制：

对照贮备溶液①：精密称取甲醇30mg、丙酮50mg置于已加入20mlDMAC的50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度并摇匀，即得。

对照贮备溶液②：精密称取甲醇30mg、丙酮50mg置于已加入20mlDMAC的50ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度并摇匀，即得。

对照溶液①：精密量取对照贮备溶液①5ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

对照溶液②：精密量取对照贮备溶液②5ml置50ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。

供试品溶液：精密称取本品0.1g，置20ml顶空瓶中，精密加入DMAC5ml，密封，超声使其分散均匀，摇匀，平行配制6份。

7.4.7.2.3测定：取对照溶液连续顶空进样6次，记录色谱图。

7.4.7.3可接受标准：重复性与中间精密度各6份供试品测得的结果RSD均不得大于10.0%，

共计12份结果的RSD不得大于15%。 7.4.7.4试验结果（见表10）

表10 精密度试验结果

测定次数 甲醇测试结果（%） 重复性 1 2 3 4 5 6 平均值（%） RSD（%） 12份平均值 12份RSD（%） 结论 试验人/日期 复核人/日期 中间精密度 丙酮测试结果（%） 重复性 中间精密度 7.4.8耐用性

7.4.8.1目的：验证在测定条件有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度。 7.4.8.2溶液配制：

对照贮备溶液：精密称取甲醇60mg、丙酮10mg置于已加入20mlDMAC的100ml量瓶中，用DMAC稀释至刻度并摇匀，

对照溶液：精密量取对照贮备溶液10ml置100ml量瓶中，以DMAC稀释至刻度，摇匀，即得。取5ml置于20ml顶空瓶中，密封。 7.4.8.3测定

7.4.8.3.1改变载气流速（±5%），其他条件不变。取对照溶液顶空进样6次，记录色谱图。

原载气流速：2.98ml/min，改变后载气流速：（1）2.83ml/min，（2）3.13ml/min 7.4.8.3.2改变柱温（±2%），其他条件不变。取对照溶液顶空进样6次，记录色谱图。

原初始柱温：50℃，改变后初始柱温：（1）49℃，（2）51℃

7.4.8.3.3改变顶空瓶平衡温度（±2%），其他条件不变。取对照溶液顶空进样6次，记录色谱图。

原顶空瓶平衡温度：80℃，改变后顶空瓶平衡温度：（1）78℃，（2）82℃ 7.4.8.4可接受标准：各项改变测试结果均应满足系统适用性要求。 ￭对照溶液连续6次进样所得图谱中目标峰峰面积RSD≤10%。 ￭ 理论塔板数≥2000； ￭ 分离度≥1.5

7.4.8.5试验结果（见表11）

表11耐用性试验结果

色谱条件 甲醇 2.83ml/min 载气 流速 3.13ml/min 柱温 峰面积 RSD 丙酮 RSD 理论塔板数 甲醇 丙酮 分离度 甲醇 丙酮 49℃ 平衡 温度 结论 试验人/日期 复核人/日期 51℃ 78℃ 82℃ 8、偏差/变更处理

验证过程中如果出现偏差和变更，应立即通知验证小组并对偏差和变更进行详细记录，分析偏差产生的根本原因、进行影响分析并提出解决方法。所有偏差和变更得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。原始的偏差处理单和变更处理单经过批准后必须附在最终的验证报告中。

9、拟定.再验证周期

发生下列情形之一时，需进行再验证

9.1 原辅料来源、生产工艺发生改变，必须再验证； 9.2 检查方法发生改变，必须再验证； 10、验证结果评价与结论

10.1 验证小组根据验证结果进行综合评价，做出确认是否符合要求的结论。

10.2验证结果的评价至少应包括：

验证过程是否产生变更和偏差，是否得到解决和批准； 验证是否有遗漏？确认记录是否完整？

验证过程中方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？

验证结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？