附件1：
CFU平板计数操作规范
1. 准备工作
1.1培养皿：培养皿用洗洁精洗涤，然后清水反复冲洗干净，确保无洗洁精残留，晾干。用双层报纸包好，121℃，30min高压灭菌，冷却干燥后备用。
1.2蒸馏水、刻度吸管（10mL、5 mL、1 mL）、18×180试管、涂布器等所需物品报纸包好后，121℃，30min高压灭菌，冷却干燥后备用。
1.3培养基的配制（北京陆桥CM107营养琼脂）。
1.3.1确保配制时容器清洗干净。
1.3.2培养基各成分称量准确无误。
1.3.3培养基配制日期、名称、配制人员等标示清楚。
1.4倒平板
1.4.1火焰保护操作，确保无菌。
1.4.2每个平皿中培养基的量为20mL。
1.4.1倒完后置超净台上，开风机吹30min，（禁止开紫外灯），待平板凝固后用灭菌报纸包好倒置于恒温培养箱中37℃空培24h。
1.4.1空培结束后，将平板置于冰箱内保存，待用。
2. 平板计数
2.1样品的制备
2.1.1液体样品的制备：从发酵罐中取100mL发酵液于250 mL高型烧杯中，置于磁力搅拌器上搅拌2min，搅拌状态下，取专用的10 mL刻度吸管沿烧杯壁插入烧杯至50 mL刻度线处，润洗3遍后吸取发酵液10 mL置于的无菌含50个玻璃珠的500 mL三角瓶中，吹洗3次，200rpm摇床振荡处理30min，既得10-1稀释液。
2.1.2固体样品的制备：准确称取样品1.000g于含50个玻璃珠的500 mL三角瓶中，加无菌水100 mL，200rpm摇床振荡处理2h，即得10-2稀释液。
2.2操作步骤
2.2.1根据样品菌数选择合适的稀释度，确定稀释用试管的数量。
2.2.2每支试管用10 mL刻度吸管加入9 mL无菌水。
2.2.3事先将1 mL移液管装于调好的移液器上，将制备好的样品置于漩涡振荡器振荡2min（准确计时），振荡完成后立即将1 mL刻度吸管插入试管中部，润洗3次后吸取稀释液1 mL于9 mL无菌水试管中，即得10-2或10-3稀释液.
2.2.4更换刻度吸管，同样操作制成10 mL 倍梯度的稀释液，直至最后的稀释度。
2.2.5涂布：取最后稀释度开始涂布。样品重新振荡1min（准确计时）立即用1 mL刻度吸管插入试管中部，润洗3次后吸取稀释液1 mL，在火焰保护下将刻度吸管管尖靠于打开的培养基上，各放0.1 mL样品于五个平板中，剩余部分打回试管。取涂布器均匀涂布30s，至样品完全渗入培养基（涂布过程中培养基有涩感）。
2.2.6同样操作共做3个连续的稀释度（稀释度由高到低），不同稀释度更换刻度吸管和涂布器。
2.2.7涂布完的培养皿做好标示（样品名称、稀释度、操作人）。
3.样品培养：将上述培养皿用报纸包好（减少水分蒸发，并防止污染），倒置于恒温培养箱中，选择样品所需培养温度培养至所需时间，可以计数。
4．菌落计数
4.1通过菌落识别结合镜检，确定有效菌。
4.2以出现20－300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计有效活菌数目。当只有一个稀释度，其有效菌平均菌落数在20－300之间时，则以该菌落数计算。若有两个稀释度，其有效菌平均菌落数均在20－300之间时，应按两则菌落总数之比值（稀释度大的菌落总数×10与稀释度小的菌落总数之比）决定，若其比值小于等于2，应计算两者的平均值；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。准确计数有效菌落数和杂菌数，每个稀释度5个培养皿菌落数之和为该稀释度有效菌落总数。
4.3计算
CFU = 菌落数的平均值/10-n/0.1
