实验一 粮食、水果和蔬菜中有机磷农药测定的气相色谱法
Experiment 1 Determination of Organophosphorus Pesticide Residues in
Foodstuff, Fruits and Vegetables by Gas Chromatographic Method 1.方法原理
样品中有机磷农药残留在加入无水硫酸钠后，用有乙酸乙酯提取、过滤、浓缩、定容，用气相色谱氮磷检测器(NPD)或火焰光度检测器(FPD)检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。 2.方法适用范围
本法规定了粮食(大米、小麦、玉米)、水果(苹果、梨、桃等)、蔬莱(黄瓜、大白菜、西红柿等)中速灭磷(mevinphos)、甲拌磷(phorate)、二嗪磷(diazinon)、异稻瘟净(iprobenfos)、甲基对硫磷(parathionmethyl)、杀螟硫磷(fenitrothion)、溴硫磷(bromophos )、水胺硫磷(isocarbophos)、稻丰散(phenthoate)、杀扑磷(methidathion)等多组分残留量的测定。 3.仪器与试剂 3.1 试剂
无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭容器中备有。 丙酮：分析纯，重蒸馏。 乙酸乙酯：分析纯，重蒸馏。
所需有机磷农药标准溶液：纯度≥98.0%。 3.2 仪器与设备
气相色谱仪：配FPD或NPD 高速组织捣碎机
微量注射器：5μL，10μL。 梨形瓶：200mL 具塞刻度试管：10mL。 鸡心瓶：100mL。 4. 样品处理步骤
4.1 提取和净化
称取试样25.0g置于组织捣碎机中，加入25.0g无水硫酸钠和50.0mL乙酸乙酯，高速匀浆3min，提取液经铺有无水硫酸钠的漏斗过滤，残渣用10mL乙酸乙酯洗涤2次，合并滤液于梨形瓶中，用旋转蒸发器在45℃水浴减压浓缩后定容至5.0mL，采用GC测定。在分流/不分流进样口的玻璃衬管中填入0.5cm高的石英棉，进样70次后，更换石英棉。
4.2 测定 4.2.1 色谱条件
(1) 色谱柱：BP-10石英毛细管柱(25m×0.22mm×0.35μm)
(2) 色谱柱温度：60℃(2min)→10℃/min→200℃(0.2min) →2℃/min→250℃ (3) 进样口温度：270℃ (4) 检测器温度：270℃
(5) 载气和尾吹气：N2≥99.99%，0.5mL/min，尾吹气：35mL/min (6) 氢气(FPD)：40mL/min；空气(FPD)：120mL/min (7) 进样方式：不分流进样 4.2.2 色谱测定
根据样品液中有机磷含量情况，选择峰高相近的标准工作液。标准工作液和样液中有机磷农药的响应值均应在仪器的检测线范围内。对标准工作液和样液等体积穿插进样测定。在上述条件下对硫磷保留时间约为28.54min。 4.2.3 空白试验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。 4.2.4 结果计算
X=
式中：X：试样中农药残留量，mg/kg
A(h)：被测农药的峰面积(峰高)
A(h)×cs×V
As(hs)×m
As(hs)：标准工作液中被测农药峰面积(峰高) cs：标准工作液中被测农药浓度，μg/mL V：样液最终定容体积，mL m：样品量，g
4.2.5 检测限和回收率
对硫磷检测限：0.01mg/kg；
对硫磷回收率：浓度在0.01～1.00mg/kg范围内，回收率为.0%～94.3%。
实验二 畜产品中氯霉素残留的ELISA检测
Experiment 2 Determination of Chloramphenicol Residue in Animal
By-Products by ELISA 1.方法原理
采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预先包被氯霉素抗体，样品中残留的氯霉素和酶标氯霉素抗原竞争微孔条上预包被的抗体，经3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)底物显色，样品吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可计算样品中氯霉素的含量。 2.方法适用范围
可定性、定量检测动物组织(含水产品)、牛奶、蜂蜜、饲料、鸡蛋等样品中氯霉素的残留量。 3.仪器与试剂 3.1 试剂
乙酸乙酯、正己烷、氯化钠、去离子水，以上试剂均为分析纯。氯霉素检测试剂盒(商品) 3.2 仪器与设备
酶标仪、离心机、水浴锅、天平、旋转蒸发仪、微量移液器等 3.3 试剂配制
按试剂盒说明配制 4. 样品处理步骤
4.1 牛奶样品处理
(1) 室温4000rpm/min，离心15min，去上层脂肪(脱脂奶可省此步);
(2) 取4.0mL除去脂肪的牛奶于50.0mL离心管中，加入8.0mL乙酸乙酯，振荡混
匀1min；4000rpm/min，离心15min
(3) 移取上层乙酸乙酯4.0mL至另一玻璃试管中，于60℃氮气流下吹干； (4) 向玻璃试管中加入2.0mL正己烷，振荡混匀；
(5) 加入2.0mL稀释后的样品稀释液强烈振荡1min；室温4000rpm/min，离心5min；
(6) 取下层液70μL检测。 4.2 组织样品处理
(1) 称取2.0±0.05g去脂肪并匀浆样品于50.0mL离心管中，加入4%NaCl溶液
4.0mL，振荡均匀后，加入4.0mL乙酸乙酯振荡5min；
(2) 室温4000rpm/min，离心15min
(3) 移取上层乙酸乙酯1.0mL至另一玻璃试管中，于60℃氮气流下吹干； (4) 向玻璃试管中加入1.0mL正己烷，振荡混匀；
(5) 加入1.0mL稀释后的样品稀释液强烈振荡1min；室温4000rpm/min，离心
5min；
(6) 离心后，如下层液出现乳化现象，试管放入80℃水浴5min，再执行(2)操作； (7) 去上层正己烷，取下层液70μL检测。 4.3 蜂蜜
(1) 称取2.0±0.05g至离心管中，加入4.0mL去离子水振荡溶解；加入4.0mL乙酸
乙酯振荡5min；
(2) 室温4000rpm/min，离心15min
(3) 移取上层乙酸乙酯1.0mL至另一玻璃试管中，于60℃氮气流下吹干； (4) 加入0.5mL稀释后的样品稀释液强烈振荡混匀； (5) 取下70μL检测。 5. 检测
5.1 试剂盒使用前准备
(1) 所有试剂及酶标板条温度回升至室温(20～25℃) (2) 使用后试剂立即放回2～8℃
(3) 正确洗板操作是ELISA测定程序中的要点；
(4) 所有恒温孵育过程，避免光照，用盖板膜封住微孔板。 5.2 操作步骤
(1) 所需试剂冷藏取出，室温平衡30min以上；所有试剂用前混匀。 (2) 洗涤工作液使用前也需回温。
(3) 将样品/标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔和样品孔所在位置。 (4) 加标准品/样品：加标准品/样品70.0μL至对应孔，再加入氯霉素酶标物30μL/孔，轻轻振荡混匀，盖板膜盖板后置于25℃避光反应30min。
(5) 洗板：小心揭去盖板膜，将孔内溶液甩干，用洗涤工作液300μL/孔，充分
洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。
(6) 显色：加入底物A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，盖
板膜盖板后置于25℃避光反应15～20min。
(7) 测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定其吸光值(建议5min内完成)。 5.3 结果判定 5.3.1 估算法
用样品的平均吸光值与标准值比较即可得出其浓度范围。
例如：样品1吸光值为0.569，样品2吸光值为1.725，标准液吸光值依次为：2.523(0μg/L)、2.217(0.05μg/L)、1.566(0.15μg/L)、0.842(0.45μg/L)、0.387(1.35μg/L)、0.145(4.05μg/L)，则样品1浓度范围为0.45～1.35μg/L，样品2浓度范围为0.05～0.15μg/L。 5.3.2 定量分析
(1) 百分吸光率计算：标准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准液(0标准)的吸光度值，再乘以100%。
百分吸光度值(%)=
B
×100% B0
B:标准品或样品的平均吸光度值 B0: 0号标准品的平均吸光度值
(2) 标准曲线绘制和计算
以标准品百分吸光率值为纵坐标，以氯霉素标准品浓度(μg/L)的半对数为横坐标，绘制标准曲线。
以样品的平均吸光度值查曲线，计算相应浓度，乘以稀释倍数、体积后除以样品质量即为样品中氯霉素的残留量。 6. 注意事项
6.1 室温低于20℃或试剂及样品没有回温到室温(20～25℃)会导致所有标准的吸光值偏低。
6.2 每种试剂加入前应混匀。
6.3 反应终止液为2mol/L硫酸，避免接触皮肤。
6.4 试剂盒保存在2～8℃，不要冷冻，不用的酶标板应放入自封袋中密封。标准物质和无色发色剂对光敏感，避免直接暴露于光线下。 6.5 0标准的吸光度(450nm)值＜0.5，试剂可能变质。
6.6 加入底物15～20min后，若色浅，可适当延长时间至30min或更长，但不能超过40min。
