肿瘤耐药性
1 肿瘤耐药性机理
化学疗法是治疗癌症的首选方法，由于肿瘤出现的耐药性了最终治疗效果。肿瘤对化疗药物的耐药性可以分为两大类：内在的或获得性的耐药性。内在的耐药性是肿瘤在接受化学药物治疗之前已预先存在抗药性中介因子，导致肿瘤细胞的化学治疗失效。获得性的耐药性是最初治疗敏感的肿瘤在治疗期间出现突变现象和各种适应性反应，化疗药物再次治疗时难以发挥作用，从而导致治疗失效和肿瘤难以被治愈。研究耐药性的机理发现，肿瘤细胞主要通过降低药物在细胞内的富集量、降低药物的生物活性、破损DNA的自修复机制和抑制凋亡过程来实现对化疗药物的耐药性和抑制自身凋亡(Figure1-5)。
Figure 1-5．This cartoon summarizes many ofthe ways in which cultured cancer cells have been shown to become resistant to cytotoxic anticancer drugs．The effiux pumps shown schematically at the plasma membrane include MDR 1，MRP family members，and MXR(ABC G2)，which is presumed to function as a dimer．
1.1降低药物在细胞内的富集量
肿瘤细胞通过降低对化疗药物的摄取和提高对胞内药物的排出，来减少药物在细胞内的富集量和作用量，从而产生耐药性。水溶性药物以扩散、受体或转运蛋白介导的主动运输或内吞作用方式进入细胞，而耐药性癌细胞常表现出药物受体或转运蛋白变性，抑制了药物被肿瘤细胞摄取。例如，化疗药物顺铂通过细胞膜表达的铜转运蛋白介导的方式进入细胞，而对顺铂显示耐药性的肿瘤细胞内铜转运蛋白的表达量远低于非耐药性的肿瘤细胞，从而导致顺铂药物难被耐药性肿瘤细胞摄取。只有少量的抗癌药物通过内吞作用进入细胞，例如抗毒素以受体介导的内吞方式被细胞摄取，癌细胞的变性则会导致内吞作用的缺失，从而产生耐药性。
多种细胞膜转运蛋白具有促进细胞外排化疗药物的能力，常与化学治疗的耐药性有关。作为跨膜蛋白质的一种，具有ATP能量依赖性的转运蛋白质家族主要调节多种结构和作用机理不相关化疗药物的血浆膜通量。转运蛋白质家族有49个成员，目前研究发现只有MDRl(P-糖蛋白和ABCBl)、MRP1和BCRP三种蛋白与耐药性有关系。它们均具有广泛、重叠的底物特异性，促进细胞排出各种疏水性化合物，其中包括大部分癌症化疗药物如紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。
1.2降低药物的活性
耐药性机理的另一重要部分是耐药性肿瘤细胞对药物的解毒作用，降低药物的生物活性。抗癌药物体内失活机理是相对复杂的，细胞可以改变药物、降解药物，或者通过药物和细胞内的分子或者蛋白质发生作用，降低药物的生物活性。
不同药物的胞内解毒机理不同，例如铂类药物被细胞内含巯基的物质(还原型谷胱甘肽
GSH、金属硫蛋白MT)解毒，这主要是因为GSH和MT能与活性的顺铂发生配位作用，生成非活性的铂类物质，进一步被泵出胞外。卡培他滨是抗代谢药物氟尿嘧啶的前药，能在细胞内胸苷磷酸化酶的作用下转化成活性药物，若编码胸苷磷酸化酶的基因被甲基化，将会导致酶失活和引起细胞对卡培他滨的抗药性。然而，这种表观遗传基因沉默具有肿瘤特异性，可以通过DNA甲基转移酶抑制剂来逆转。
1.3 破损DNA自修复机制
多数抗癌药物通过直接或间接的方式损伤DNA，促使细胞凋亡。例如铂类药物直接络合DNA，抑制DNA的转录和翻译；DNA拓扑异构酶抑制剂作为抗癌药物，抑制DNA拓扑异构酶的活性，间接影响遗传过程中DNA的断开和再连接。细胞对DNA损伤会做出修复或细胞凋亡的反应，癌细胞的DNA自修复能力影响损伤DNA类抗癌药物的治疗效果。一些化疗药物诱导DNA双链上的鸟嘌呤烷基化，6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)激活的DNA修复机制能修复烷基化的核苷酸，将烷基化鸟嘌呤转换回鸟嘌呤，抑制癌细胞凋亡。MGMT的过度表达已经被证明可以保护造血干细胞免受烷基化剂的影响；同时，许多肿瘤细胞也有较高水平的MGMT，促使肿瘤对烷基化抗癌药物产生耐药性。基于铂类药物的肿瘤化学治疗，顺铂引起的DNA双链损伤经核苷酸剪切修复和同源重组机制作用，能重新复制成完整的DNA双链，抑制细胞凋亡。
DNA损伤导致细胞周期阻滞，但细胞仍有时间来修复DNA损伤。对于某些癌症，肿瘤基因功能的改变会干扰细胞周期阻滞的调节，从而产生耐药性。例如，p53蛋白的突变影响细胞周期阻滞检查点，破坏DNA损伤诱导的细胞周期阻滞。p53蛋白也参与诱导细胞凋亡，它的突变经常与化疗药物的耐药性有关。
1.4抑制凋亡过程
细胞凋亡有两种既定的途径：一种由线粒体介导的内在途径，包括B细胞淋巴瘤-2(BCL-2)家族的蛋白质、caspase-9和Akt，以及一种与细胞表面的死亡受体有关的外在途径。内在和外在的途径都是通过激活下游的caspase-3蛋白，启动促凋亡过程，最终导致细胞凋亡。与细胞凋亡相关的蛋白变性或者过度表达将会导致细胞凋亡过程受阻，从而产生肿瘤化学治疗的耐药性。研究表明，BCL-2蛋白具有阻止线粒体释放细胞色素C和中断细胞凋亡信号的能力，过度表达抗凋亡BCL-2蛋白将导致白血病细胞和老鼠的胸腺细胞对化疗药物产生耐药眭。
2纳米药物载体用于克服肿瘤耐药性
为了克服肿瘤细胞出现的耐药性缺陷和有效治疗肿瘤，大量关于新药开发和以更有效的方式向肿瘤部位输送化疗药物的策略被提出。从药物输送的角度来看，将纳米粒子与药物结合可以改善肿瘤部位的药物输送和减少药物被泵出肿瘤细胞，最终提高抗癌药物在肿瘤细胞的作用量；将多种药物装载入纳米药物载体可以实现联合治疗，提高治疗效果；利用纳米药物输送体系靶向干细胞和阻止肿瘤细胞与周围环境的联系，可以有效抑制肿瘤的生长和克服耐药性缺陷。
2.1提高细胞内药物聚集
体外实验表明高浓度的抗癌药物能抑制耐药性癌细胞的增长，可以猜测任何耐药性的癌细胞都能被高浓度的药物杀死，实现肿瘤耐药性的逆转。由于抗癌药物对健康组织也会有损伤，了治疗时的药物剂量，因此药物在肿瘤部位的高浓度富集对克Nile瘤耐药性至关重要。肿瘤血管特有的多孔结构促使小分子和纳米粒子在血液循环过程中通过EPR效应可以泄露到肿瘤组织；而肿瘤组织缺少淋巴细胞，小分子和纳米粒子在到达肿瘤组织后又能在肿瘤组织富集。小分子药物在体内很快被代谢掉，循环时间较短，EPR效应对肿瘤
的治疗效果帮助不大。为了延长药物在机体的血液循环时间，纳米药物载体是合适的选择。
“”纳米药物载体不受肾脏过滤、血浆降解和网状内皮系统清除的影响，能延长装载药物的血液循环时间，实现肿瘤组织的被动靶向，同时减少被非作用位点细胞的摄取。将纳米粒子外层修饰亲水性的聚乙二醇形成“”纳米药物载体，可以避免纳米药物载体与血浆蛋白发生疏水性和静电相互作用，逃脱网状内皮系统的“监视”和清除。“”纳米药物载体的血液循环时间受PEG链的长度和PEG链在纳米粒子表面的密度影响，研究发现分子量为2．5 KDa的PEG链适合修饰纳米药物载体，显示最优的治疗效果；同时尺寸为50-150nm的纳米粒子更有利于在肿瘤组织部位富集。纳米药物输送体系通过被动靶向在肿瘤组织大量聚集，对克服肿瘤的药物耐药性具有重要意义。细胞外高浓度的抗癌药物增强了通过细胞膜的药物扩散，提高了耐药性肿瘤细胞对抗癌药物的摄取量；饱和了基于P糖蛋白(P—gP)的细胞内药物泵出，减少药物流出细胞；克服由于药物失活和药物的靶向性低引起的耐药性；克服由于凋亡过程缺失引起的耐药性。同时，纳米药物输送体系能在不产生明显毒副作用和风险的前提下提高给药剂量，为治疗耐药性肿瘤提供了可行性方法。例如，PEG修饰的脂质体负载DOX药物(Doxil)在体内的血液循环时间是DOX的300倍，在肿瘤组织的富集量提高了10-15倍，最终导致更好的肿瘤治疗效果，能抑制耐药性肿瘤的生长。
对于血管化的肿瘤，纳米药物输送体系通过EPR效应，实现被动靶向；而对于血管化较少的肿瘤(例如结肠癌和胰腺癌)，纳米药物输送体系很难实现被动靶向的目的。由于肿瘤各处血管壁通透性不同，药物在肿瘤部位分布不均匀，很难实现完整而高效的肿瘤治疗，通过配体-受体之间识别作用的主动靶向策略被提出来解决此问题。将诸如抗体、适配体、多肽和碳水化合物等配体共价键结到纳米药物输送体系的表面，促进了纳米药物输送体系被肿瘤细胞摄取。目前已报道了大约有l00种以上配体和受体具有专一性识别能力。肿瘤细胞过度表达某些抗原，基于抗原．抗体之间的识别作用，将纳米粒子表面修饰抗体能提
高其在肿瘤组织的聚集量。结肠癌、B细胞淋巴瘤和转移性的肺癌分别过量表达CC52抗原、CDl9抗原和34A抗原，可以将对应的抗体修饰到纳米药物输送体系实现对肿瘤组织的主动靶向。Park等报道了乳腺癌细胞对HER2抗体修饰的免疫脂质体粒子的摄取量是未修饰的免疫脂质体粒子的700倍，这主要是乳腺癌细胞过量表达HER2抗原；静脉注射后，未修饰的脂质体粒子被巨噬细胞识别和很难进入肿瘤细胞，而HER2抗体修饰的脂质体粒子主要分布于肿瘤细胞的细胞质中，从而提高了肿瘤治疗效果，克服了耐药性问题。
基于非特异性的细胞渗透多肽TAT与细胞膜两侧的磷脂具有相互作用，TAT多肽容易以易位的方式进入细胞，利用TAT多肽修饰抗癌药物或纳米粒子能提高肿瘤细胞对药物的摄取量，增加药物在作用位点的给药剂量，提高肿瘤的治疗效果和逆转肿瘤出现的耐药性。例如，Lee等设计了pH超敏感性多功能聚合物胶束粒子负载DOX，用于肿瘤特定酸性环境暴露耵汀多肽，提高肿瘤细胞对载药粒子的摄取量，实现逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。聚合物胶束由聚合物PLA-PEG-PHis-TAT(PLA：聚乳酸，PHis：聚组氨酸)、PEG-PHis和DOX共组装而成，在血液循环过程中TAT多肽被隐藏在聚合物胶束粒子的内部；在肿瘤微酸性环境刺激下，TAT多肽暴露在聚合物胶束的表面，促进了聚合物胶束被肿瘤细胞摄取。
2.2多种药物联合治疗
与抗癌药物被泵出细胞外有关的基因有ATP结合盒B亚家族l转运蛋白基因(ABCBl，与P-gP有关)和ATP结合盒药物转运蛋白(ABCCl)，利用小干扰RNA(siRNA)技术和反义寡聚核苷酸(asODNs)可以降低耐药性肿瘤细胞内ABCBl和ABCCl基因的表达，从而减少抗癌药物被泵出细胞外，克服肿瘤细胞的耐药性。Davis等首次报道了基于纳米输送体系装载siRNA用于治疗转移型黑色素瘤，纳米输送体系由环糊精-聚合物组装而成，表面修饰PEG提高粒子的稳定性，表面修饰转铁蛋白赋予粒子对肿瘤细胞的靶向性。siRNA纳米
输送体系能显著沉默目标基因M2核苷酸还原酶，显示出较好的肿瘤治疗效果。这说明了通过沉默耐药性基因来提高肿瘤治疗效果策略的可行性。进一步，Yadav等利用PEG-PbAE(PEG：聚乙二醇，PbAE：聚氨基酯)纳米粒子负载与ABCBl有关的siRNA，静脉注射24 h后再次静脉注射装载紫杉醇药物的PEG-PCL(PCL：聚己内酯)纳米粒子。实验发现设计的体系能完全沉默体内的耐药性基因，明显提高紫杉醇药物对耐药性卵巢癌细胞的毒性，达到对耐药性卵巢癌细胞的毒性与非耐药性细胞的相当。Patil等设计了同时装载siRNA和紫杉醇药物的PLGA(聚-丙交酯-CO-乙交酯)药物输送体系，载药粒子表面修饰生物素提高了对肿瘤细胞的靶向性。装载siRNA和紫杉醇的纳米药物输送体系对耐药性肿瘤细胞的毒性远高于只负载紫杉醇的纳米药物输送体系，能明显抑制耐药性肿瘤的生长。
中断细胞凋亡信号(与BCL-2和缺氧．诱导因子HIFIa的表达有关)会导致肿瘤细胞出现耐药性。BCL-2家族蛋白细胞程序性死亡，HIFIa编码转录因子，对细胞适应缺氧状态起重要作用[1261。通过小干扰RNA(siRNA)技术和反义寡聚核苷酸(asODNs)法可以调节细胞内BCL-2和HIFIct的表达，从而抗癌药物引起的细胞凋亡。Chen课题组通过多孔硅纳米粒子装载与BCL-2相关的siRNA和DOX，聚酰胺．胺树枝状分子(PAMAM)作为次级载体，分别通过静电相互作用和化学反应负载siRNA和DOX。实验发现纳米粒子装载的siRNA能显著抑制耐药性肿瘤细胞BCL-2信使基因的表达，克服了由P糖蛋白介导的药物泵出所引起的耐药性；纳米粒子通过内吞作用进入细胞，DOX主要分布在细胞核附近，避免被细胞膜表面的P糖蛋白泵出细胞外，提高了DOX的药物活性；设计的多级纳米粒子能抑制对DOX显示耐药性的乳腺癌细胞的生长，细胞毒性是DOX的132倍。
转录因子NF-κB参与细胞对外加刺激的反应，如压力、细胞因子、自由基、紫外线照射和微生物抗原、调节关键蛋白质的表达(BCL-2、BclXL、细胞凋亡抑制剂clAPs、生存素、TRAF、Cox-2、MMP9和诱导型一氧化氮合酶)和细胞周期因子。NF-κB调节异常与慢性炎症、自身免疫性疾病、肿瘤产生、肿瘤增长以及化学治疗中涉及的肿瘤耐药性相关。
因此，转录因子NF-κB已成为肿瘤治疗的新作用位点，利用NF-κB抑制剂调节抗肿瘤反应和增强肿瘤对抗癌药物的敏感性。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作为NF-κB抑制剂，通过抑制NF-κB释放IKBct阻断NF-κB的活性，诱导细胞凋亡。Fan等利用叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子装载DOX和PDTC，载药粒子通过靶向性内吞作用被耐药性肿瘤细胞摄取，在酸性内涵体和细胞液环境刺激下实现药物的可控释放；PDTC抑制NF-κB的活性，克服了细胞耐药性，提高释放的DOX治疗效果。实验结果显示壳聚糖纳米粒子在中性或碱性条件下缓慢释放DOX药物，在酸性环境下实现药物快速释放，2h内大约有75.95％的药物被释放出来，这主要是由于在中性和碱性环境下，壳聚糖聚合物的临界聚集浓度低于酸性环境；叶酸的引入赋予纳米粒子靶向性，提高纳米粒子被肿瘤细胞摄取；相比于DOX和只负载DOX的纳米粒子，同时负载DOX和PDTC的纳米粒子对耐药性肿瘤细胞显示出最高的细胞毒性，说明同时负载NF-κB抑制剂和DOX药物的纳米粒子能逆转肿瘤细胞的耐药性。
2.3靶向肿瘤干细胞和阻止癌细胞与周围环境的联系
肿瘤干细胞对各种肿瘤治疗具有抵抗性，而传统的化学疗法往往无法将它们摧毁。肿瘤干细胞的耐药性通过增加Wnt/13-catenin和Notch信号、改变DNA修复机制和延缓细胞增殖来实现。一项对骨肉瘤细胞的研究表明，抗肿瘤药物沙利霉素可以靶向干细胞，通过Wnt/13-catenin信号通路的中断来抑制肿瘤细胞的生长增殖。因此，Zhang等设计了奥曲肽修饰的聚合物胶束粒子负载沙利霉素和紫杉醇药物，胶束粒子能有效地靶向从乳腺癌细胞分离出的肿瘤干细胞(CD44+/CD24-)，对肿瘤的治疗效果明显优于沙利霉素药物和紫杉醇。用奥曲肽修饰负载聚合物胶束粒子赋予了聚合物胶束粒子对癌细胞内过表达的生长激素抑制因子受体的靶向能力，提高了细胞对胶束粒子的摄取量，可以同时治疗肿瘤细胞和肿瘤干细胞，克服了肿瘤细胞的耐药性。
癌细胞周围的支持间质和血管为癌细胞提供能量和进行物质交换，促进癌细胞生长和增殖，若阻止癌细胞与周围间质和血管的联系，就能克服癌细胞的耐药性。众所周知，成熟的B-细胞恶性肿瘤通过CXCR4信号与周围环境进行交流获取能量，而基质细胞位于骨髓微环境中，能分泌CXCR4的配体一基质细胞因子，促使癌细胞转移到骨髓，并在骨髓处生长和获得耐药性信号。CXCR4拮抗剂作为纳米药物的重要补充可以破坏肿瘤与周围环境的相互作用，迫使白血病细胞返回血液，提高了细胞对化疗药物的敏感性。Jai等利用白蛋白和通过具有酸性环境响应性的腙键连接DOX的细胞周期蛋白肽组装成纳米药物载体，其中细胞周期蛋白肽可靶向血小板源生长因子受体。由于靶向识别作用，纳米药物粒子能快速在耐药性C26小鼠结肠癌组织聚集，显示出优于DOX药物的治疗效果，同时没有引起毒副作用。
抗癌药物难以被输送到肿瘤组织的作用靶点和肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性是癌症治疗的主要障碍，响应性纳米药物载体作为一种安全、有效的药物递送体系有望解决小分子抗癌药物的缺陷和克服肿瘤出现的耐药性问题。响应性纳米药物载体具有较长的血液循环时间、可以主动或被动靶向肿瘤组织、刺激响应性的药物可控释放、以内吞作用方式被细胞摄取和同时装载多种治疗药物，这些优越的特征使得响应性纳米药物载体在克服癌症耐药性和提高癌症治疗效果方面具有很高的应用前景。响应性纳米药物载体通过EPR效应在肿瘤组织富集，通过内吞作用进入肿瘤细胞，避免了抗癌药物被泵出胞外，提高了细胞内的药物浓度和治疗效果。此外，响应性纳米药物载体可以同时装载抗癌药物和涉及肿瘤耐药性的基因或者蛋白抑制剂，通过肿瘤的协同治疗克服耐药性和提高治愈指数。目前已有大量同时装载抗癌药物和逆转肿瘤耐药性药物的响应性纳米药物载体用于体内实验，但仍没有一例可应用于临床。多种原因导致响应性纳米药物载体无法实际应用，包括：(1)响应性纳米药物载体很难实现精确装载溶解度不同的药物。尽管纳米脂质体和囊泡能同时负载亲疏水性的药物，但很难两种药物的合适给药剂量，这了肿瘤协同治疗的效果。(2)响应性纳米药物载体进入细胞从溶酶体和内涵体逃逸，避免其被溶酶体和内涵体内的酶
和酸性环境代谢，仍是需要攻克的难题。(3)纳米药物载体实现长时间的血液循环和肿瘤组织富集要求纳米粒子的粒径合适(200nm以下)和粒子表面不带电荷或带负电荷，而实现从肿瘤组织外围渗透到组织深处要求粒径要尽可能的小且粒子表面需显示正电性，这两种矛盾性的要求为纳米药物输送体系的设计带来了难题。
