荧光定量聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒

中华医院感染学杂志２００２年第１２卷第４期　荧光定量聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒　岳林　，楚雅玲　，王利芬。，李亚伟。　（１．洛阳市中心医院，河南洛阳４　７Ｊ００９；２．洛阳医专附属医院，河南洛阳４７１　０００）　摘要　目的验证单纯疱疹病毒（ＨＳＶⅡ）临床简单、实用、可靠的检测方法，以利早期诊断、早期治疗。方涪荧　光定量聚台酶反应检测单纯疱疹病毒并对阳性病例进行抗病毒治疗。结果　１００例可疑标本检出ＨＳＶⅡ阳性４６　倍　阳性基固拷贝数范围在（４５０～５）×１０　．结论荧光定量聚合酶链反应检测　纯疱疹病毒、能较好的解决假用　性污染．井实现准确定量：对单纯疱疹病毒感染的早期诊断、治疗方案选择，提高疗效有较大指导意义。　美键词：单纯疱疹病毒｛黄光定量聚台酶链反应；抗病毒治疗　中图分类号：Ｒ１　９７．３９　文献标识码：Ｂ　文章编号：１［１（Ｉ５　４５２９（２０ｏ２）０４　０３１７　０１　生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）感染所　致的性传播疾病．约占生殖器疱疹的９０　。随着医　学分子微生物学的不断发展，荧光定量聚合酶链反　仪，读取并记录读数Ａ－。荧光激光波长为４８７　ｎｉｌ），　检测波长为ｊ２５　ｎｍ。　１．６结果判定计算：Ａｘ—Ａ　Ａ　。定性结果判定：　应（ＦＱ　ＰＣＲ）在许多临床实验室中开展．将陵方法　用于ＨｓＶⅡ的检测，显示了－较突出的优点，我们自　ｌ　９９９年１　０月～２０００年３月．用ＦＱ　ＰＣＲ法对ｌ（）。　例ＨＳＶ感染可疑者做ＨＳＶⅡ检测，并对其中阳性　者进行了－治疗，现报告如下。　ｌ材料与方法　在实验有效的前提下．样品Ａｘ＞Ｎ１．３，判为阳性，　否则为阴性。定量计算：以定量阳性质控管的ＤＮＡ　数量的对数值为横坐标，相应的Ａｘ为纵坐标，用直　线连接各定量阳性质控管的数据点，构成标准曲线，　样品的Ａｘ若＜Ｎ１．３，则判为阴性，否则以它的Ａｘ　值在标准曲线上查出相应的横坐标值Ｃ，样品的　ＨＳＶ　ＤＮＡ含量一５０×１０“。（取样量为１　ｍ１），或　２５０×１０“　（中取样量为０．２　ｍ１）。　２结果　１．１　标本采集　取自水疱液、尿道分泌物或官颈分　泌物。　１．２标本处理标本试管中加入ｌ　ｍｌ无菌生理盐　１　Ｏ０例可疑标本，检出ＨＳＶⅡ阳性４６份。阳性　定量值范围在（１　５０～５）×ｌ０　，平均值为２．６×１　０，　阳性病例经抗病毒治疗，效果良好　３讨论　水．充分振荡摇匀，吸取液体转至１　５　ｍｌ离心管中，　１２　Ｏ００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｍｉｎ，沉淀加无菌生理盐水ｌ　ｍｌ　打匀，１　５　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｍｉｎ．再重复洗涤１次。沉　淀直接加５０　ｌ　ＤＮＡ提取敞充分混匀．沸水浴１Ｏ　ｍｉｎ，１　Ｏ　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｒａｉｎ，取上清液２　ｌ做　ＰＣＲ反应。　１　３　ＰＣＲ反应前荧光检测　采用ＨＳＶⅡＰＱ　ＰＣＲ试剂盒，取ＨＳＶ　ＰＣＲ反应ｌ管，直接加入处　目前已有治疗和控制ＨＳＶ感染的较为有效方　法，故通过实验室检查明确ＨＳＶ感染的临床诊断　显得非常重要　聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术虽已广泛　用于核酸分析，但普通ＰＣＲ还存在一些不足：只有　定性结果．无法结出临床需要的定量结果；由于采用　电泳检测易引起ＰＣＲ产物的交叉污染，增加了假阳　性结果的可能性　荧光定量ＰＣＲ法（ＦＱ　ＰＣＲ）由于　理后样品或质控标准品２　ｍｌ，振荡器振荡２～３　ｓ混　匀　６　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心数秒。将所有反应管置ＰＣＲ仪　３３　Ｃ保温，ｌ　ｍｉｎ后迅速逐个将反应管放入荧光检　测仪，读取井记录读数Ａｏ。荧光激光波长为４８７　ｎｍ，检测波长为５２５　ｎｍ　采用荧光技术和闭管检测，避免了交叉污染；同时采　用实时检测技术，所得值和原始模板数量完全呈线　性相关，定量准确率极高。这为临床实验室确定　ＨＳＶ感染提供了可靠的技术保证。本组检出４６份　阳性病例，由于做到了早期确诊，使抗病毒治疗及　时、高救、并发症少。ＦＱ　ＰＣＲ对单纯疱疹的临床诊　断、治疗方案选择、提高疗敢、防止复发有较大指导　意义。　１．４　ＰＣＲ扩增将各反应管放入ＰＣＲ仪，按下到　条件扩增：９３　Ｃ一２ｍｉｎ预变性，然后按９３　Ｃ　４５　ｓ一　５　５　Ｃ１　２０　ｓ，共做４０个循环后置３３［、保温。　１　５　ＰＣＲ反应后荧光检测　待各ＰＣＲ管充分冷　却至３３　Ｃ后，迅速将扩增后的反应管放入荧光检测　收稿日期：２ｏｏｌ—Ｏ１—０９；修订日期：２ｏｏｌ—Ｏ８—２３