一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112359016 A(43)申请公布日 2021.02.12

(21)申请号 202011257242.0(22)申请日 2020.11.11

(71)申请人 深圳市茵冠生物科技有限公司

地址 518000 广东省深圳市南山区西丽镇

茶光路10号深圳集成电路设计应用产业园304(72)发明人 姜舒　张芸　纪惜銮　刘赢滢　

谢亮　罗朝霞　(74)专利代理机构 广州科沃园专利代理有限公

司 44416

代理人 陆丰艳(51)Int.Cl.

C12N 5/0783(2010.01)G01N 15/14(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页

(54)发明名称

一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术

(57)摘要

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术。本发明提供的制备技术，将HPL作为T细胞培养液的补充成分，主要包括外周血单个核细胞(PBMC)的分离，T细胞的扩增，T细胞检测等过程。本发明提供的制备技术，可提高中心记忆T细胞亚群的比例，而且同时达到了与FBS一致的T细胞增殖效果，且HPL更易于规模化生产，可满足T细胞的临床制备需求。

CN 112359016 ACN 112359016 A

权　利　要　求　书

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1.一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，其特征在于，包括以下步骤：S1、外周血单个核细胞的分离；S2、T细胞的扩增；S3、T细胞的检测。

2.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S1所述的单个核细胞分离过程为：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液。

3.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20ml：3.5mL；所述淋巴细胞分离液可购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号为LTS10771。

4.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按200g-400g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于200g-400g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。

5.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述T细胞无血清培养基可购自TAKARA生物公司，货号为SK551S。

6.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S2所述的扩增过程为：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL-500IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为5ng/mL-8ng/mL，将细胞置于培养箱中培养。

7.如权利要求6所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为1：1-3：1。

8.如权利要求6所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述培养箱中的培养条件为37℃、5％的CO2浓度，培养时间为14天，根据细胞生长增殖情况补充培养液。

9.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S3所述的检测过程为：将T细胞悬液收集后，于1000rpm下离心10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤2次，每次以1000rpm离心10min，用200μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，取1×106个细胞用0.1mL预冷的0.01mol/L PBS重悬，避光加入相应荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000rpm离心l0min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，上流式细胞仪检测。

10.如权利要求9所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述荧光抗体包括CD4 Antibody-FITC，CD8 Antibody-PE，CD197(CCR7)Antibody-PerCP，CD45RO Antibody-APC，CD3 Antibody-APC，CD62L Antibody-FITC，CD56 Antibody-PerCP。

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一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术

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技术领域

[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术。

背景技术

[0002]近些年，作为细胞过继免疫治疗方式之一的体外修饰T细胞在一些肿瘤和自身免疫性疾病的治疗中展示了良好的治疗效果。嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR-T细胞)因高效靶向肿瘤抗原、杀伤能力强、可在体内持续增殖等优势，在细胞治疗领域备受瞩目，目前已在血液系统疾病上展示了良好的临床治疗效果。尽管CAR-T细胞治疗肿瘤的机制尚未研究透彻，但临床研究结果显示CAR-T细胞的一些生物学特征可预示临床治疗效果，初始T细胞和中心记忆T细胞(CCR7+/CD45RO+，CD62Lhigh)亚群在CAR-T体内长期存活和临床疗效方面发挥着重要作用。T细胞扩增培养是CAR-T细胞制备的关键因素之一。在T细胞扩增培养方面，目前胎牛血清(FBS)和人AB血清常用于T细胞培养液的补充成分，FBS营养成分丰富，由于是动物来源，可能含有病原体而引起免疫排斥反应，人AB血清不是动物来源，安全性较高，但是产量有限，因此可能无法满足大规模的细胞培养需求。人血小板裂解产物(HPL)富含生长因子、蛋白质等营养成分，可促进细胞生长和增殖，有研究报道HPL用于培养间充质干细胞、巨噬细胞、树突状细胞，但用于T细胞的培养仍未见相关报道。HPL含有丰富的营养成分，且可大规模生产，作为T细胞培养液的补充成分极具应用前景。发明内容

[0003]为了进一步提高中心记忆T细胞的数量，本发明创造性地提供了一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，可提高中心记忆T细胞亚群的比例，解决了FBS可能含有病原体而引起免疫排斥反应、人AB血清产量有限因而可能无法满足大规模的细胞培养需求的问题。

[0004]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：[0005]一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，包括以下步骤：[0006]S1、外周血单个核细胞的分离；[0007]S2、T细胞的扩增；[0008]S3、T细胞的检测。[0009]优选地，步骤S1所述的单个核细胞分离过程为：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液。[0010]优选地，所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20mL：3.5mL；所述淋巴细胞分离液可购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号为LTS10771。

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优选地，所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝

剂混合，按200g-400g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于200g-400g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。

[0012]优选地，所述T细胞无血清培养基可购自TAKARA生物公司，货号为SK551S。[0013]优选地，步骤S2所述的扩增过程为：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL-500IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为5ng/mL-8ng/mL，将细胞置于培养箱中培养，根据细胞生长增殖情况补充培养液(含HPL的T细胞无血清培养基，IL-2，IL-7，IL-15)。[0014]优选地，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为1：1-3：1。[0015]优选地，所述培养箱中的培养条件为37℃，5％的CO2浓度，培养时间为14天。[0016]优选地，步骤S3所述的检测过程为：将T细胞悬液收集后，于1000rpm下离心10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤2次，每次以1000rpm离心10min，用200μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，取1×106个细胞用0.1mL预冷的0.01mol/L PBS重悬，避光加入相应荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000rpm离心l0min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，上流式细胞仪检测。[0017]优选地，所述荧光抗体包括CD4 Antibody-FITC，CD8 Antibody-PE，CD197(CCR7)Antibody-PerCP，CD45RO Antibody-APC，CD3 Antibody-APC，CD62L Antibody-FITC，CD56 Antibody-PerCP。

[0018]与现有技术相比，本发明提供的提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，具有以下优势：[0019](1)本发明提供的T细胞制备技术，将HPL作为T细胞培养液的补充成分，可提高中心记忆T细胞亚群的比例，而且同时达到了与FBS一致的T细胞增殖效果，且HPL更易于规模化生产，可满足T细胞的临床制备需求；[0020](2)本发明提供的T细胞制备技术，解决了FBS可能含有病原体而引起免疫排斥反应、人AB血清产量有限因而可能无法满足大规模的细胞培养需求的问题。具体实施方式

[0021]下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

[0022]所述T细胞无血清培养可购自TAKARA公司，货号为SK551S；所述流式细胞仪可购自BD公司，型号为Calibur；所述淋巴细胞分离液可购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公

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司，货号为LTS10771；所述荧光抗体可购自美天旎公司，各抗体名称及型号为：CD4 Antibody-FITC，130-113-775；CD8 Antibody-PE，130-125-881；CD197(CCR7)Antibody-PerCP，130-120-609；CD45RO Antibody-APC，130-114-072；CD3 Antibody-APC，130-113-687；CD62L Antibody-FITC，130-114-145；CD56 Antibody-PerCP，130-114-742。[0023]实施例1一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术[0024]所述提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，包括以下步骤：[0025]S1、外周血单个核细胞的分离：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液；所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20mL：3.5mL；[0026]所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按400g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于400g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。[0027]S2、T细胞的扩增：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为1：1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为5ng/mL，将细胞置于37℃，5％的CO2浓度的培养箱中培养14天，根据细胞生长增殖情况补充培养液(含HPL的T细胞无血清培养基，IL-2，IL-7，IL-15)；[0028]S3、T细胞的检测：将T细胞悬液收集后，于1000rpm下离心10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤2次，每次以1000rpm离心10min，用200μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，取1×106个细胞用0.1mL预冷的0.01mol/L PBS重悬，避光加入相应荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000rpm离心l0min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，上流式细胞仪检测；所述荧光抗体为CD4 Antibody-FITC，CD8 Antibody-PE，CD197(CCR7)Antibody-PerCP，CD45RO Antibody-APC，CD3 Antibody-APC，CD62L Antibody-FITC，CD56 Antibody-PerCP。[0029]实施例2一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术[0030]所述T细胞制备技术，包括以下步骤：[0031]S1、外周血单个核细胞的分离：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液；所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20mL：3.5mL；[0032]所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按300g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血

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小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于300g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。[0033]S2、T细胞的扩增：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为2：1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为500IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为8ng/mL，将细胞置于37℃，5％的CO2浓度的培养箱中培养14天，根据细胞生长增殖情况补充培养液(含HPL的T细胞无血清培养基，IL-2，IL-7，IL-15)；[0034]S3、T细胞的检测：所述检测过程与实施例1相同。

[0035]实施例3一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术[0036]所述提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，包括以下步骤：[0037]S1、外周血单个核细胞的分离：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液；所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20mL：3.5mL；[0038]所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按200g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于200g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。[0039]S2、T细胞的扩增：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为3：1，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为400IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为6ng/mL，将细胞置于37℃，5％的CO2浓度的培养箱中培养14天，根据细胞生长增殖情况补充培养液(含HPL的T细胞无血清培养基，IL-2，IL-7，IL-15)；[0040]S3、T细胞的检测：所述检测过程与实施例1相同。[0041]对比例1一种T细胞制备技术

[0042]所述T细胞制备技术与实施例3类似；[0043]与实施例3的区别在于，对比例1中在外周血单个核细胞的分离和T细胞的扩增时，将HPL换成等量的FBS。

[0044]对比例2一种T细胞制备技术

[0045]所述T细胞制备技术与实施例3类似；[0046]与实施例3的区别在于，对比例1中在外周血单个核细胞的分离和T细胞的扩增时，将HPL换成等量的ABS。

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试验例

[0048]1.试验样品：本发明实施例3组及对比例1-2组培养的T细胞；[0049]2.试验方法：在进行细胞扩增之前，进行细胞计数，用流式细胞仪测定CD3+CD56-T细胞(非NK样T细胞总数)的比例；然后分别采用本发明实施例3及对比例1-2所述的方法培养扩增细胞，扩增14天后，进行细胞计数以便计算扩增倍数，测定CD3+CD56-T细胞(非NK样T细胞总数)、CCR7+/CD45RO+CD4+T细胞(中心记忆CD4+T细胞)、CCR7+/CD45RO+CD8+T细胞(中心记忆CD8+T细胞)和CD3+CD62L+T细胞(中心记忆T细胞和初始T细胞)比例。[0050]3.试验结果：扩增前后CD3+CD56-T细胞(非NK样T细胞总数)比例和扩增倍数对比试验结果见表1，扩增后CCR7+/CD45RO+T细胞(中心记忆T细胞)和CD3+CD62L+T细胞(中心记忆T细胞和初始T细胞)比例见表2和表3。[0051]表1 扩增前后CD3+CD56-T细胞比例和扩增倍数对比

[0052]

试验组别扩增前扩增后扩增倍数

实施例3组66.3％95.3％275倍对比例1组67.7％90.1％248倍对比例2组65.9％88.9％148倍

[0053]由表1可见，本发明添加10％的HPL，可以显著提高CD3+CD56-T细胞的比例和扩增倍数，培养效果优于对比例组。[0054]表2 扩增后CD3+CD62L+T细胞的比例对比

[0055]

[0056]

[0057]

表3 扩增后CCR7+/CD45RO+T细胞的比例

[0058]

由表2和表3可知，与对比例组相比，本发明添加10％的HPL，扩增后，显著提高了中心记忆T细胞(CCR7+/CD45RO+，CD62L+)的比例。[0060]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

[0059]

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