实验四、蛋白酶活力的测定
1.实验目的
掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。 2.实验原理
蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂
试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA溶液
仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。 4.实验步骤
（1）标准曲线绘制 管号 1 2 3 4 5 标准酪氨酸标准液 0 1 2 3 4 10 9 8 7 6 0 10 20 30 40 0.55mol/L碳酸5 5 5 5 5 稀Folin试剂（mL） 1 1 1 1 1 吸取量（mL） H2O（mL） 浓度（µg/mL） 钠溶液（mL） 6 5 5 50 5 1 （2）样品的测定 取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。三支试管中反应液用滤纸过滤。另取三支试管（一支空白。两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。 5.数据处理
