478・论 著・ July 2013,Vo1.11,No.20 白头翁和黄连不同配比下有效成分溶出量和量效关系的研究 夏娜 邓雁如 肖婷婷 (天津中医药大学中药化学与分析重点实验室,天津300193) 【摘要】目的探讨白头翁与黄连不同配比对有效成分溶出量及对肠运动性能的影响。方法回流提取不同配比的白头翁和黄连,以干浸膏 量、白头翁皂苷B4、小檗碱含量为指标,考察白头翁和黄连不同配比对有效成分溶出量的影响;运用肠内容物推进速度实验和离体回肠 实验,以小鼠离体肠内容物推进速度和家兔离体回肠震动幅度为评价指标,考察白头翁和黄连不同配比对量效的影响,并分析量效关系。 结果经方配比时浸膏和白头翁皂苷B 的得率较其他配比高,但小檗碱的溶出率并不是最高的。肠内容物推进速度实验表明,白头翁一黄 连(3:1)及单味药白头翁与空白组相比有显著性差异;离体回肠法表明白头翁一黄连3:1、1:1组和单味药白头翁与空白组相比有 显著性差异。结论白头翁汤经方配伍具有较高的有效成分溶出量,并对肠道收缩抑制作用明显。 【关键词】白头翁皂苷B ;小檗碱;量效关系 中图分类号:R9 文献标识码:B 文章编号:1671—81 94(2013)20—0478-03 Pulsatilla and Different Ratios of Berberlne Dissolution of the Active Ingredient and the Next Dose 。effect Relationship X/ANa,DENG Yah—Fu,XIAO Ting-ting (KeyLaboratoryofChemistryandAnatysis ofChineseMedicine,Tianjin University ofTCM,Tianjin 300193,Chin IAbstract]Objective To explore the dissolution of active ingredients ofPulsatilla and Coptisthe before and after hteir compatibility,and evaluate the effects of different ratio on intestinal motor function.Methods The diferent ratio of Pulsatilla and Cclptis were selected,after the water boiling reflux extraction, he amountt of dry extract,Pulsatilla Saponin B4,berberine volume were obtained for the test,to examine the active ingredients in aspects of dissolution rate changes and compatibility relations;based on the intestinal contents from ileum speed test and ileum experiment in vitro,speed in mice and vibration ate of rabbitr ileum were obtained to research the effects of he dose-teffect relationship.Results The best dissolution rate of extract and Pulsatilla Saponin B4 was the classical prescriptions,but the dissolution rate of Berberine was not the best in this ratio.Intestinal contents forward speed experiment showed hatt only Pulsatilla Coptis(3:1)and single Pulsatilla have hte signiifcance level in comparison with the control rogup.The ileum expeirment in virto show hatt Pulsatilla:Coptis=3:1.1:1 group and the single Pulsatilla have the signiifcance level in comparison wih tthe control roup.Conclgusion The classical prescriptions ofBaitouweng Decoction has the best dissolution ofacfive ingredients and the signiicantf inhibition effect on isolated duodenum. 【Key wordsl Pulsatilla saponin B4;Berberine;Dose—effect relationship 白头翁汤最早收录于张仲景的《伤寒论》,由白头翁、黄柏、黄 连、秦皮四味药组成,具有清热解毒,凉血止痢的功效。该方被认为是 治疗热毒血痢的代表方 1。白头翁为君,清热解毒,凉血止痢。黄连苦 寒,泻火解毒,燥湿厚肠为治痢之要药,与黄柏共为臣药。献报 道,白头翁皂苷B4和盐酸小檗碱分别为白头翁和黄连的有效成分 。为 探讨这一传统方剂的药效物质基础和药效关系,本实验选取白头翁汤中 的君药白头翁和臣药黄连为研究对象,对白头翁汤进行了拆方研究 】, 阐明了不同配比对有效成分溶出量及对肠收缩的影响,从量效关系的角 度考察经方配伍的合理性。 1仪器与材料 1.1实验仪器 CoMetro一6000高效液相色谱仪(2O L定量环),KDM型调温电 热套(山东鄄城永兴仪器厂),电子天平(上海精密科学仪器有限 公司),天平(北京宣武区天平厂制),BT125D电子分析天平(德 国赛多利斯公司),电热真空干燥箱(天津市天宇实验仪器有限公 司)。RM6240 C型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)、智 能竖线恒温水浴锅(巩义市于华仪器有限责任公司)。 1.2药品与试剂 白头翁皂苷B4对照品(中国药品生物制品鉴定所,批号为 111766.200601)、盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品鉴定所,批 号为110713—200910);白头翁(Radix pulsatilla chinensis rege1)及黄连 +通讯作者:E-mail:dyanru@sina.COIn (Rhizoma coptis chinensis rfanch)均购于天津协和药店,由天津中医药 大学李天祥老师鉴定为合格药材;甲醇和乙腈均色谱纯(天津市协和 吴鹏色谱科技有限公司),三乙胺、磷酸和盐酸均为分析纯(天津市 江天化工技术有限公司),娃哈哈纯净水(天津娃哈哈有限公司), 台氏生理溶液(氯化钠0.8g、氯化钾0.2g、氯化钙0.2g、氯化镁0.1g、 磷酸二氢钠0.05g、碳酸氢钠1.0g、葡萄糖1.0g,溶于1000mL蒸馏水 中,加热溶解。随用随配,试剂均为分析纯) 1.3动物 家兔由天津中医药大学实验动物中心提供,合格证号SCXK (津)2009.0011;昆明种小鼠,购于天津市山川红实验动物有限公司, 清洁级,合格证号SCXK(津)2009—0001。动物均饲养与天津中医药大 学实验动物中心,饲养温度20 ̄25℃,相对湿度40% ̄50%,动物自由 摄食摄水。 2方法与结果 2.1药材提取 药材加8倍量水回流3次,每次1h,合并提取液,过滤,浓缩后, 减压干燥,称浸膏重量,备用。 2.2含量测定 2.2.1白头翁皂昔B4含量测定 色谱条件:HypersilODSCI8色谱柱(250rfuTlx4.6mm,5 m); 柱温:30"C;流动相:乙腈:水(28:72),流速:1.0mL/min,检测 波长205nm;进样量2O L。 对照品溶液制备:取白头翁皂苷B4对照品适量,精密称定,置 圄眶|囡—盈同2013年7月第1 1卷第2O期 表2实验结果 ・论 著・479 注: 表示与对照组相/:tao<0.05, 表示与对照组相/:e,ao<O.01 10mL容量瓶中,用甲醇溶解,定容至刻度,配制成435 g/mL的对照 品溶液,备用。 阴性溶液:取黄连6g按2.1法制得阴性对照溶液,备用。 样品溶液的制备:取白头翁15g、黄连6g按2.1处理,精密称定适 量浸膏,置10mL容量瓶中,甲醇溶解,定容至刻度,用0.45 m微孔 滤膜过滤,取续滤液进样。 对该HPLC实验方法进行方法学考察结果表明,仪器的精密度、 方法重现性良好,供试品在12h内稳定,RSD线值均<2.O%,线性范 围:21.75-435 g/ml_, 2.2.2盐酸小檗碱的含量测定 色谱条件:HypersilODS2Cl8色谱柱(250mlrl×4.6mrn,2.5 m); 柱温:30℃;流动相:6‘%三乙胺水溶液(磷酸调pH至3):乙腈(70: 30),流速:1.0ml_/min;检测波长346nmI进样量20 L。 对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,置 10 mL容量瓶中,用盐酸一甲醇(1:100)溶解并定容至刻度,配制成 43-3 g/mL的对照品溶液,备用。 阴性对照溶液:取白头翁15g按2.1法制得阴性对照溶液,备用。 样品溶液的制备:取白头翁15g、黄连6 g按2.1处理,用盐酸一甲 醇(1:100)定容于25 mL的容量瓶中,精密移取1 mL溶液,移至 25mL容量瓶中并用盐酸.甲醇(1:100)定容,用0.45“m微孔滤膜过 滤,取续滤液进样。 对该HPLC实验方法进行方法学考察结果表明,仪器的精密度、 方法重现性良好,供试品在12 h内稳定,RSD线值均<2.0%,线性范 围:0.433,-4-3.3 g/mL。 2-3白头翁和黄连的配比试验 配比分为以下七组:1组(白头翁5g、黄连15g),2组(白头翁 7 g、黄连13g),3组(白头翁10g、黄连10g),4组(白头翁13g、黄 连7g),5组(白头翁15 g、黄连5g),6组(白头翁20g),7组(黄 连20g),按2.1方法提取,2.2方法测量白头翁皂昔B4溶出量、小檗碱 溶出量,结果见表1,趋势图见图1。 表1不同配比时白头翁皂苷B4和小檗碱溶出量 由图1可知当黄连药材量多于白头翁,出臂翠随看白头翁用量的 增加、黄连用量的减少而降低;当黄连药材量少于白头翁,出膏率随 着白头翁用量的增大、黄连用量的减少而增大。5号的配比为经方配 比,其出膏率最高,白头翁用量在7-15g ̄,当用药量为15g时,白头 翁皂苷B 溶出率最高;白头翁汤黄连的用量范围在4 ̄6 g时,此时小檗 碱的溶出率最低。 图1不同配此时有效成分溶出率趋势图(x轴为试验编号,Y轴为有效成 分溶出率。数据处理时,将浸膏量扩大100倍,白头翁皂苷B4的量扩大10 倍。6、7纽分别为白头翁、黄连单味药方,所以对应小檗碱、白头翁皂苷 B4含量无法呈现连续性) 2.4药理实验(该部分A、B、C、D、E组分别对应5、4、3、6、7组 药物配比) 2.4.1肠内容物推进速度实验 健康雄性小鼠42只,体质量(20±3.90)g,随机分组,给药 前禁食24h。取各组浸膏0.3000g于lmL蒸馏水中,加入活性炭0.1g 配制成混悬液,对照组为生理盐水。以0.2 mL/10 g体质量的给药容 积进行灌胃给药后130min(经预试验得出)断头处死,立即剖腹取 出全肠(幽门至直肠末端),平铺于玻璃板上,测量活性炭末头端 在肠管内的移动距离(x)以及全肠长度(Y),计算推进百分率 W=X/Y,以此反映各组水提物对小鼠肠内容物推进的影响,实验结 果见表2。 2.4.2离体回肠法 健康家兔18只,体质量2 ̄2.5kg,雌雄不限,随机分为6组,给药 前禁食24h。给予受试药后将其击昏、剖腹,迅速取出小肠3 ̄4cm,放 在37℃充盈以一定量台式液的保养皿中,去除附着的肠系膜和脂肪。 迅速取肠管,一端固定在玻璃通气钩上,另一端固定于张力换能器与 RM6240C型多道生理信号采集处理系统相连。肠管浸没在加有40mL台 氏液的麦氏浴皿内,维持(37±0.5)℃恒温,向台氏液中不断充气, 用生物信号采集系统记录肠管收缩波形,观察正常离体肠管自动节律 性收缩。描记5 rnin后用10 mL注射器分别注入(O.0300-4-0.001)g/mL 的A、B、C、D、E组药液,对照组加入等量蒸馏水,同样打下标记, 以震动幅度(mv)为指标(给药前M、给药后N),记录每段肠管的运动变 化。每种配比提取物作用结果记录完毕,用37"C台式液冲洗三次,放 入下一肠管继续,实验结果见表2。 2.4.3数据分析 数据用均数士标准差表示,采用SPSS 13.0统计软件,单因素方差 分析进行组间比较。给药前后比较用配对 险验,组问比较用两样 本f检验。 结果表明,对照组的肠内容物推进速度最快,给药组中E组肠内 容物推进速度最快,其次为C组、B组、D组,推进速度最慢的为A 组;对肠道收缩的影响的实验表明对照组给药前后没有显著性差异, (下转481页) 2013年7月第1 1卷第20期 ・论 著・481 选择一个数字表示自己的疼痛感,其中10分为非常疼痛难以忍受,0 护士交流,说出自己的想法和恐惧情绪,使护士可以针对性地给予干 分为完全无痛。 预,让患者感受到温暖。而术中的疼痛护理可以缓解患者的疼痛感, 1.4数据处理 进而减少人工流产、引产对患者产生的心理阴影 ”。此外,手术后的 本次实验的所有 数据处理均采用SPSS19.0软件包进行处理,检验 心理干预,可以帮助其建立更好的自我保护意识,树立其自强自尊的 水准o【为0.05,以95% ̄j可信区间,计算结果me<O.05时,为样本差 人生观。 异明显且有统计学意义 其中两组患者的焦虑程度、抑郁程度和疼痛 从本次实验结果我们可以看出,实验组患者护理干预后,其焦虑 感为计量资料,组间对比方法为舛佥验。 情绪、抑郁情绪明显降低,患者的焦虑情绪、抑郁情绪明显降低,且 2结果 疼痛感更轻微,与对照组比较,P<O.05,差异有统计学意义。 实验组患者护理干预后其焦虑程度更低,患者抑郁程度低,疼痛 综上所述,对未成年少女意外怀孕终止妊娠患者给予心理护理能 感降低,与对照组各个指标比较,差异明显,P<0.05,差异有统计学 够缓解患者的不良情绪,进而降低患者的疼痛感,是一种有效的护理 意义。详细结果见表1。 措施。 表1两组患者的焦虑程度、抑郁程度和疼痛感比较 参考文献 [1]裴静,覃少珍,梁金清,等,复合护理干预在减轻未成年少女门诊 乳腺手术恐惧心理中的应用[J].齐鲁护理杂志,2012,18(2o):1O7一 注: <0.05,样本差异显著有统计学意义 lO8. 3讨论 [2】李晓琳,李胜女.未成年少女中期引产的护理措施[J].中国实用 未成年少女意外怀孕会出现有较为复杂的心理活动,其心理压力 医药,2008,3(17):176—177. 大,存在有较为明显的羞愧、紧张、焦虑、恐惧等心理。而这些不良 [3]徐素玲,盖炼炼.心理护理干预对未成年少女中期引产的效果分 情绪会导致患者出现一系列的神经内分泌功能紊乱,直接影响人工流 析[J】.中国医药导报,2011,8(36):117—118. 产和引产手术。而部分 女还会留下心理阴影,影响成年后的性生活 [4]陈莉.未成年少女中期引产的心理特点及护理干预[J].中外健康 与妊娠。 文摘,2010,7(27):312—313. 心理护理是以患:者为中心的一项护理工作。我院实验组的心理护 [5] 曾令先,余明会.未成年少女怀孕问题的分析及心理护理[J].中 理,是从四个方面加强了心理干预,包括热情接待、耐心的开导、疼 外健康文摘,2012,9(15):105-106. 痛干预和手术后的心理护理。其中热情的接待能够让患者感受到温 [6】赵璐.未成年少女分娩55例心理护理【J】.临床合理用药杂志,2012, 暖,进而缓解其入院后的恐惧情绪,有利于迅速地建立与护士的和谐 5(4):150-151. 护患关系,可以保证护:上后续的护理工作进行 。其次,耐心的开导 [7] 叶秀涛,柳晓春,潘淑芬,等.非意愿妊娠的未成年少女避孕现状 能让患者逐渐消除自己的抵触情绪,接受终止妊娠的手术,并愿意与 的调查研究[J].医学信息(上旬刊),201 1,24(7):4234-4235. ……一一……………………………… (上接479页) 白头翁含量最高的A组和D组均有显著性变化,A组、B组、C组和E组 药白头翁的浸膏量略小于经方组与药理试验的结果也刚好吻合;综合 表明对肠道收缩的影响随着白头翁含量的减少而减小。 白头翁皂苷B 溶出量与药理实验结果可知:白头翁皂苷B 作为有效成 3讨论 分,溶其出量与药效成正比关系;小檗碱作为臣药黄连的有效成分, 3.1不同配比对成分溶出率的影响 在组方中不起主要作用,综合黄连小檗碱溶出量与药理实验结果可 经方配比(白头翁:黄连:3:1)时,得到浸膏量最多,初步证 知:小檗碱溶出量与药效之间无明显关系。 明经方的科学性。白头翁皂苷B 的溶出率1组>7组>5组>4N>3组 参考文献 >2组,由此可见黄连对皂苷的溶出具有双向调节作用。而小檗碱的 [1]谢鸣.方剂学[M】.北京:人民卫生出版社,2002:13. 溶出率与白头翁皂昔B 溶出率无明显对应关系,原因是这两种成分不 [2]丁林生,唐元辉,王勇.白头翁汤有效成分检查和测定[J].中成药, 互相影响,或还受其他成分影响,仍需做进一步的研究。历代白头翁 1992,14(19):34—35. 汤中黄连用量的范围是4 ̄6g,而在本实验考察的各组中,此段的小檗 [3]朱华旭,丁林生.白头翁汤汤剂化学成分的分离研究[J].中成药, 碱的溶出率最低,黄连为臣药,针对兼证,推测小檗碱在此溶出率下 1999,21(6):313—317. 已达到治疗量,或小檗碱在白头翁汤证中的兼证中不起主要作用,需 [4]张镖.中药复方研究现状与思路探析[J]_天津中医药大学学报, 进一步考察。 2007,26(2):1 04. 3.2不同配比对药效的影响 [5] 曲龙妹,赵春杰,李丹,等.RP—HPLC法测定白头翁汤中白头翁皂 不同配比时,随着白头翁用量的增大,肠内容物推进速度减缓, 苷B 的含量[J].沈阳药科大学学报,2009,26(1) ̄45—47. 对离体回肠收缩的抑制作用也更加明显。经方配比时效果最为明显, [6】蔡乐,刘萍,周忻,等.HPLC法同时测定加味白头翁汤凝胶灌肠剂 证明白头翁作为君药的合理性;黄连作为臣药,对肠道收缩也有一定 中秦皮甲素和盐酸小檗碱的含量[J]冲国医院用药评价与分析, 的抑制效果;经方组比白头翁组的影响略明显,再次验证该方剂的配 2010,10(3):244—246. 伍的科学性,由于本实验并未加入秦皮和黄柏,故还需进一步实验证 [7]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社, 明配伍的效果。 1991:241—246. 3.3量效关系分析 [8] 吕锦芳,卢文超,宁康健.白头翁汤对兔离体十二指肠运动性能 综合浸膏量与药理实验结果可知浸膏量和药效成正比关系,单味 的影响[J].中国中医药科技,2005,12(5):279—280.