药理学实验方法

来源：华佗小知识

第一章现代药理学实验方法与技术简介

第一节分子生物学试验方法与技术

分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：

一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。

㈠探针种类

1．基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。

2．cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。

3．RNA探针 RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。 4．寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。

㈡标记物

常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多

335

数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P¸P¸S，有时也用14C,125I或131I。

二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ）是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。

三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度

高，特异性强，操作简便。PCR是本世纪分子生物学研究领域中最重要的发明之一。

四、cDNA文库是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补 DNA（complementary DNA,cDNA）。cDNA文库是指一群含重组DNA细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种mRNA的信息，足够数目克隆的总和则含细胞的全部mRNA信息，此种克隆群体叫cDNA文库。

五．随机分子库技术（random moleculer library）采用不同技术手段和在不同的分子水平有效地实现分子的多样性。其技术路线，一是利用化学合成的方法生成已知结构的化合物，以某种特定方式和一定规律组合在一起，只要确定某一化合物具有活性，即可根据建库的组合方式确定其结构，围绕此技术发展的随机分子库总称为化学合成库（synthetic chemical library）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸库（nucleic acid library ）,由DNA随即编码表达的小分子和大分子的混合群体而表达物的表面显露又提供了可从庞大的复杂的群体中快速筛选到目的物，这就是近几年发展起来的极富有应用潜力的核酸编码分子肽库（oligonucleotide-encoded peptide library ）。

六．真核基因的表达技术真核细胞具有比原核细胞更为庞大的和复杂的基因组。高等真核细胞基因组编码成千上万个基因，基因内遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程，即基因表达过程受不同层次调节机制精密，此既决定着基因表达的量，又决定基因表达的时空顺序。过程精密复杂，涉及到转录前染色质的活化；转录水平的调节；转录后的加工；翻译水平的调节及翻译后的修饰等。基因表达的主要发生在转录水平。

七．转基因动物是用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。此种方法可建立转基因动物模型，以研究外源基因在整体动物中的表达率；能改变动物基因使其表现更符合人类需要；也可用转基因动物产生人类所需要的生物活性物质。

第二节细胞生物学实验方法与技术

细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几

种：1）真核细胞基因结构及其表达；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。

一、细胞培养常用方法

1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。

2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。

二、器官培养方法

器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。

器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。

三、放射自显影术测定

放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。

四、染色体分析技术

染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗

传基础；3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。

五、电镜技术

早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。

电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有立体感，是一个具有真实感的三维结构立体图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大倍数为1000倍左右，透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达6－3nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。

六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、

1、细胞的分离分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少的手段。

2、细胞膜的分离细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。

3、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位，完整的保存遗传物质，幷指导RNA合成，后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。

4、溶酶体的分离溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。

5、线粒体的分离线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由在线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。

6、细胞DNA、RNA分离与纯化核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较困难，主要因为：一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶；二是酸碱等化学因素；三是高温机械

损伤等物理因素，需严格遵守操作规程。

七、细胞凋亡研究方法

细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡（programmed cell death,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身内部机制，尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化，导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。

目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，个体不能形成与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数量，以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之一。透视电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。

八、原位杂交

原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR技术结合用于检测人乳头瘤病毒（HPV）

九、单克隆抗体

是1975年被描述的一种可产生无限量，并可预测其性质的抗备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了性的改观，同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。

十、神经细胞培养神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷保持其结构和功能。

神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。

1、器官培养（organ culture ）是切割最少型的培养。全器官或器官大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的血供，器官的营养交换取决于简单的灌流。

2、组织块培养（explant culture）是真正最小器官培养。组织块通常厚度为0.5－1mm，一个或几个组织块放在一个培养皿内存活数周。实验在其组织块周围生长出的边缘细胞上进行。

3、细胞分离培养（dissciated cell culture ）是由分散其原始组织至其组成的细胞。常用酶进行消化。

第三节信息传递的研究方法与技术

一、受体与配基结合试验技术

受体与配基结合试验是一种在体外直接观察受体的实验手段。随着各种高比活度的特异性受体配基的合成，此方法已成为药理学的基本技术之一，幷广泛用于生理、生化、细胞生物等许多相关学科。

二、G蛋白的纯化分离技术

G蛋白是细胞膜上一类结构和功能都非常相似的蛋白质。其主要功能是偶联受体及其效应器。受体与激动剂结合并被激活时，先激活其相应的G蛋白，然后G蛋白再与相应的效应器（酶离子通道等）发生反应，改变效应器的活性。与G蛋白偶联的受体种类繁多，受G蛋白的效应器包括腺苷酸环化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，离子通道等。因此，G蛋白的研究对阐明跨膜信息传递机理有非常重要的意义。

三、环核苷酸测定技术

环核苷酸是重要的细胞内信使物质，参与各种激素、神经递质和调质所导致的各种细胞生命活动。常用的测定方法有：cAMP蛋白质竞争结合法；cGMP放射免疫测定技术；腺苷酸环化酶测定技术等。

四、花生四烯酸代谢产物测定技术细胞内磷脂、甘油三酯及胆固醇经酰基水解酶的作用释放出花生四烯酸（arachidonic acid ,AA）。而AA通过环加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列活性物质，如前列腺素、前列环素、血栓素、白三烯等。这些物质在体内含量少，但有极强的生物活性。能调节多种系统（神经、内分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、肾等）,并在炎症、免疫、过敏、凝血、肿瘤和心血管等一系列的病理过程中发挥作用而具有重要的临床意义。常用的检测方法：生物测定法、高效液相测定法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、放免配基受体结合法。

五、肌醇磷脂及其代谢产物的测定技术

肌醇磷脂是细胞膜中的一种脂质，能被磷脂酶C水解生成三种重要的细胞内信使物质，都已成为药理学和生物化学等学科中研究的热点。常用实验方法有：肌醇磷脂的测定、磷酸肌醇的分离及测定、甘油二酯的测定、同位素标记测定肌醇磷脂等。

六、蛋白激酶C的纯化和测定

蛋白激酶C是一种普遍存在于生物体内的磷脂依赖的激酶家族。在细胞的信息传递和生长调节中起到重要作用。蛋白激酶C参与多种激素、神经递质及生长因子过程。测定蛋白激酶C活性及纯化该酶成为跨膜信息传递研究的重要技术。

七、离体器官受体生物测定

使用某些离体器官进行受体激动剂、拮抗剂的生物检定，是一项目前仍在广泛应用的经典的药理学方法。可以测定药物对受体的亲和力，对特定亚型的选择，能决定药物是激动剂还是拮抗剂，并能分析药物与受体的构效关系，反映的是药物在器官水平上的作用，因此，与细胞或分子水平上的实验结果可以互相印证，有其不可替代的意义。

第四节钙研究方法与技术简介

钙是人体内极其重要的金属离子，广泛存在于细胞和体液中。它在细胞活动乃至生命过程和疾病的发生、发展中扮演重要角色，已成为化学、生物学、基础和临床医学及其它许多科学研究的一个重要领域。

一、细胞内游离钙研究方法与技术（一）钙指示剂

钙指示剂是近十多年来发展起来的一类离子指示剂，也称离子探针或染料，已成为观察细胞内游离离子浓度及其动态变化和空间分布极有价值的工具。目前常用钙指示剂根据其物理特性一般可分为两类

1、钙荧光指示剂：是指在一定波长的激发光照射下，钙指示剂复合物可发出荧光。属于此类的指示剂有Fura-2 、Quin-2、Fiuo-3、 Indo-1等。

2、光吸收指示剂：是指它们与钙离子结合后，其吸收光谱峰值随Ca2+

——指示剂复合物浓度的不同而变化，据此便可观察细胞内游离钙的动态变化并测定细胞内钙浓度。属于此类指示剂的有Purpurate diacetic acid (PDAA)、AntipyrylazoⅢ等。光吸收指示剂一般属于低钙亲和力指示剂。（二）双波长荧光分光光度计测定方法

应用双波长荧光分光光度法不仅可以检测细胞悬液，单层培养细胞及单个细胞内游离钙浓度的变化，也可以测定细胞内瞬间平均钙浓度的变化及亚细胞水平钙离子的梯度分布等。各种细胞测定方法差异在于标本的制备过程，其余步骤基本相同。基本方法为制备标本的细胞悬液，加入荧光指示剂，用双光束荧光分光光度计测定荧光。测定条件：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，以300-420nm扫描激发光谱，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化，由公式计算游离钙浓度。

二、钙结合蛋白的研究方法

钙结合蛋白的研究方法包括钙调素的纯化及测定、钙调素的表达与突变的研究方法、钙调素结合蛋白检测方法及钙依赖性磷脂结合蛋白的研究方法。

三、细胞内钙释放研究方法 1、放射性标记法测定钙释放：

将分离的内质网或线粒体囊胞用放射性标记的钙离子负载，负载后的囊胞置于一滤器上，通过过滤与负载液分离。在滤器中加入各种促钙释放介质后，定时测定滤器中残留的放射活性即可推断内钙释放情况。

2、三磷酸肌醇刺激内钙释放的研究方法制备细胞或细胞器悬液，加入钙离子荧光指示剂负载，再加入一定浓度的三磷酸肌醇（IP3）刺激内钙释放，观察荧光强度的变化即可反应钙释放情况。

四、钙离子受体测定方法

从牛或人甲状旁腺细胞的cDNA文库中筛选出编码钙离子受体的cDNA，将其mRNA注入爪蟾卵细胞，使其表达，在细胞膜上形成具有天然活性的钙离子受体。当细胞培养液中存在一定浓度的钙或其它阳离子时，激活钙受体，使胞内钙离子浓度增加，打开氯离子通道，测定氯离子通道电流的变化，便可用于筛选钙离子受体激动剂或拮抗剂。

第五节放射配体受体结合实验方法与技术

一、基本概念

1、受体（ receptor）一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。

2、配体（ligand）能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。

3、判断受体的标准真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。

4、受体的基本分类化学门控离子通道受体； G蛋白耦联受体。 5、受体调节的方式

1）共价调节（covalent modification）尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加

8～10倍。

2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。

3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。

4）链锁反应（receptor cascades）另外一种可能的机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。

二、放射配体结合法的应用领域

1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。

三、放射受体结合实验技术简介

1、放射配体的选择需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想的配体应有不少于99%的特异性结合。

2、组织的选择和制备用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。

3、缓冲液最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。

4、非特异性结合的测定非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。

5、孵育条件结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。

6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2～5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时，可用离

心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。

第六节免疫药理学实验方法与技术简介

免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。

免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。

一、免疫细胞的分离与纯化

体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。

外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。

从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。

淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。

二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介

1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。

2、对免疫细胞功能的影响常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。

3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测TH细胞活性。

4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。

5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。

6、对超敏反应影响的体内外实验总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase radioimmunoassay，MSPRIA）和ELISA法。参与I型超敏反应介质的测定：相应介质试剂盒测定，如LTs试剂盒。动物模型：如过敏性哮喘模型等。

三、影响免疫功能的药物药效学研究原则

根据药物对免疫功能的影响进行分类，可分为免疫增强剂、免疫调节剂和免疫抑制剂。

1、免疫增强剂和免疫调节剂的免疫药理学研究

免疫增强剂和免疫调节剂可分为两大类：生物类和化学合成化合物类。生物制品类包括菌苗、细菌的某些成分如脂多糖、真菌产物、免疫细胞的产物如细胞因子和免疫球蛋白、免疫细菌如LAK细胞、自然化合物及中草药及其单体成分等。化学合成化合物类包括含硫化合物、多聚核苷酸等。这些药物的药理作用因用药方案不同，如给药途径、用药剂量和用药时间等，会导致不同的药效；另外，药物本身的纯度和药物受试对象的种系、年龄、疾病类型与程度及遗传背景亦会对药效产生一定的影响，因此，在进行实验设计时要全面考虑这些因素。

临床上免疫增强剂和免疫调节剂主要用于原发性和继发性免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及慢性微生物感染的治疗，故选择实验动物模型时，应考虑采用免疫缺陷模型动物、荷瘤动物、自身免疫病模型及相应病原体感染动物模型。

2、免疫抑制剂的免疫药理学研究

免疫抑制剂的筛选程序一般是先进行体外实验，然后进行体内实验。动物

的体内实验多采用实验性过敏性脑脊髓炎和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的病理模型和新西兰NZB小鼠。在动物实验时，应考虑动物的品系、对免疫应答所影响的环节、治疗指数、给药途径、最佳治疗方案等。在免疫药理学研究之后，还应进行基础药理学研究、药物的急性和慢性毒性研究、药物的动力学研究等。

第七节肿瘤药理实验方法与技术

肿瘤药理实验方法无外乎体内和体外实验两种。从实验目的上看，又可以分成抗癌作用和抗癌作用机制研究两种。

一、抗癌作用研究

（一）体外实验法：用培养的肿瘤细胞系进行。

1、噻唑蓝（MTT）法在培养的活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶可将黄色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的蓝紫色的甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，按照公式

实验组光密度值

肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 - ）×100% 对照组光密度值

计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。用系列浓度的药物可制作肿瘤细胞生长抑制率的量效曲线。

2、染料排斥法本方法是根据活细胞具有排斥某些染料的功能，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色的原理，在培养的对数生长期的细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。根据公式

未染细胞数

活细胞率（%）= ×100% 细胞总数

3、生长曲线法本方法是根据肿瘤的Gompertzian生长曲线而设计。培养的肿瘤细胞在初期为指数增殖期，随着细胞密度的增加，因代谢产物的积聚和营养物质的消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓的平台期。在培

养后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可获得截距No`，用公式

对增殖细胞的杀伤力No-No`100%No

计算药物对增殖细胞的杀伤力（No`是对照组的的截距） 2）用Nt代表接种后t小时的细胞数，用公式

TD = 0.301t / logNt - LogNo

计算药物对细胞增增时间（TD）的影响。

3）取平台期每毫升的细胞均数，比较细胞生长的饱合密度（Ns）。 4、集落形成法本方法利用6代以上的克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数＞50）的能力，比较药物对单个肿瘤细胞增殖能力的影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。

1）贴壁法需要选用贴壁生长的细胞，按500细胞/ml的浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20×解剖显微镜下计数含有50个细胞的细胞集落。

2）半固体软琼脂培养法取对数生长的细胞，用含小牛血清的培养液稀释成1000细胞/ml的悬液；溶化5%的琼脂液，并按1：9的比例与含小牛血清的新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml的细胞悬液，加0.04ml的5%琼脂, 加到已制备的琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16×解剖显微镜下计数直径大于75μm的细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落的存活分数与剂量作图，可获得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， Do为存活分数每下降1/ e时所需的药物剂量， n为外推值。Do越小，药物的杀伤力越大，N越大杀死细胞的药物剂量越大。

5、硫化若丹明B法（SRB）法硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可与生物大分子的碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时的读数与细胞表现出良好的线性关系，可用于细胞的定量。测试的细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB，室温下静置，然后去除未结合的SRB，用非缓冲tris碱液溶解结合的SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可根据下述公式计算:

T - T0

生长率（%）= ×100% C - T0

C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外的对照平板加药时的细胞的OD值。

T - T0

杀伤率(%) = ×100% T

T - T0

50%生长抑制所需的药物浓度(GI50) = ×100% C - T0

T - T0

杀死50%细胞所需的药物浓度(LC50)= ×100% T0

(二) 在体试验法

1、小鼠白血病L1210 系用甲基胆蒽诱发DBA/2小鼠而得。取接种于DBA/2小鼠第6～7天之腹水，制成细胞悬液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接种活细胞1×105，观察体重变化，计算平均存活时间T/C（T--治疗组存活时间，C--对照组存活时间）。T/C大于125%，并可重复，认为有抗癌活性，T/C大于150%，并可重复，认为具有显著活性。

2、大鼠Walker-256瘤本瘤细胞接种在皮下或肌肉成为实体瘤，接种于腹腔则成为腹水瘤。取Walker-256瘤成瘤细胞悬液，按106个细胞接种于大鼠大腿肌肉。计算瘤重和T/C。重复实验T/C≤42%，认为有活性。 3、Lewis 肺癌是一个在C57BL/6小鼠上发现的自发性肺内未分化的上皮样癌。该癌细胞恶性程度高，皮下、肌肉接种对药物的敏感性低，但可向肺转移，静脉接种可在肺形成瘤集落。方法是取接种于C57BL/6小鼠肌肉或腋窝皮下的13～15天的Lewis肺癌，制成细胞悬液接种2×106个细胞于BDF1小鼠皮下或腹腔内，12天后处死动物，作皮下接种者直接摘取肿瘤称重，作腹腔接种者，将双侧后肢从髋关节处剪下，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。重复实验T/C≤42%为有活性。

二、抗癌作用机制研究

（一）药物作用周期特异性研究

进行药物作用细胞周期性实验必须首先制备同步化的细胞，常用的体外培养细胞同步化的方法有机械振荡法、双胸苷同步法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。

1、机械振荡法机械振荡法分离同步化细胞是基于单层贴壁生长的细胞在进入有丝期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇晃或拍击培养瓶可以剥离出这些细胞，利用此方法可以得到较纯的M 期细胞。双胸苷同步法的原理是先以高浓度的TdR处理细胞，使细胞内的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期的细胞完全越过S期，再给予TdR，让越过S期的细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。因此，本方法可以得到较纯的S期细胞。

2、含羞草氨酸俘获法含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤除含羞草氨酸后，细胞可同步进入S 期。

3、离心洗脱法离心洗脱法的原理是进入细胞周期的的体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。

在上述同步化处理尚需配合以同步化程度的检测，检查的方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者通过测定细胞的荧光强度来定量细胞的DNA量；后者则利用测定掺入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）的量来获知处于S 期的细胞量。

（二）药物抗微管作用利用微管蛋白在37℃聚合，在冰浴上解聚的特点，测定微管蛋白或微管液的OD值，分别获得S型的聚合曲线和倒S型的解聚曲线，比较药物对曲线的影响，用下式计算抑制率。

实验组光密度值

抑制率（%）=（1 - ）×100% 对照组光密度值

（三）药物与DNA结合能力检查

吸收光谱移动法原理是DNA与药物形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药物复合物的量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。

荧光光谱移动法原理是在激发光的激发下，DNA-药物复合物的荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些变化。

（四）药物造成的DNA损伤

彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法正常的DNA为负超螺旋结构，在pH<9.0时以双链形式存在, 在pH>12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散的结构, 在电场的作用下,松散的DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似的拖尾,变换不同pH缓冲液可检测断裂的是双链还是单链。

碱洗脱法收集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。

（五）药物对DNA拓扑异构酶的影响

DNA拓扑异构酶是调节DNA空间结构的动态变化的关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I可以造成DNA的单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA的复制、重组和基因表达。实验的原理是用从肿瘤细胞核提取的拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一种质粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶的作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，相应的缺口环状或线性DNA增加。如果药物对拓扑异构酶具有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改进为观察药物对拓扑异构酶功能的促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量的拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不同浓度的药物，如果药物抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药物增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。

（六）药物对细胞核酸代谢的影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基

酸，用同位素标记前体物如3H-TdR，H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去，用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 的合成情况。

（七）药物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

细胞凋亡是一种受基因的细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等的块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180～200碱基对)的整倍数，提取后普通的琼脂糖电泳表现为特殊的云梯状，凋亡小体形成。检查细胞凋亡的方法有：

1、荧光显微镜的形态学检查该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解的特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用与DNA分子结合的原理，建立DNA的荧光探针。常用的方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡的细胞对Hoechst33342具有高摄取比，加之染色质的高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。

2、流式细胞光度术该方法的原理是用DNA结合性的荧光染料标记DNA，因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成的小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术可以检测出DNA的这种结构和量的变化。

3、琼脂糖电泳分析法利用该方法可检测出呈云梯状的寡聚核小体。

第八节心脑血管药理学实验方法与技术简介

心脑血管药物实验方法很多，择其要者简介如下：

一、血压测定及相关模型

血压测定法大体分为直接和间接测压法。直接测压可选用颈动脉或股动脉插管，通过压力换能器记录血压变化，一般用麻醉动物作急性实验。常用的间接测压法主要有大鼠尾容积测压及尾动脉脉搏测压法。实验性高血压模型有：1、肾血管性高血压模型（肾动脉狭窄性高血压模型），分为2肾1夹型（两侧肾完整，一侧肾动脉狭窄）、1肾1夹型（一侧肾切除，另一侧肾动脉狭窄）和2肾2夹型（两侧肾完整，两侧肾动脉狭窄），常用动物是狗和大鼠。2、内分泌性高血压模型常用大鼠，包括DOC盐性高血压模型、肾上腺再生性高血压模型。3、神经原性高血压模型。4、遗传性高血压模型，根据采用的遗传学方法进行分类：①选择性近亲繁殖高血压模型（如自发性高血压大鼠SHR、Dahl盐敏感大鼠DS、米兰种高血压大鼠 MHS、遗传性高血压大鼠 GH、以色列种高血压大鼠 SBH、里昂种高血压大鼠 LH）②基因工程高血压模型高血压转基因动物（transgenic animals of hypertension）、高血压基因敲除动物（geneknockout animals of hypertension）。

研究降压药作用机理的实验方法包括:中枢降压(毁髓猫或大鼠模型、减弱神经反射性调节实验等)；外周降压（神经节阻断、对传出神经递质及受体的影响、对在体血管阻力或离体血管平滑肌作用实验等）。

二、心脏与血管实验法简介

心脏实验可用在位心脏和离体心脏进行。离体心脏实验最常用的方法是Straub法、八木-Hartung法与Langendorff法。前两种方法主要观察药物直接对心脏收缩力、传导与心输出量的影响，适用于两栖类动物如青蛙、蟾蜍等离体心脏；后者适用于哺乳类动物兔、豚鼠、大鼠等，不仅可观察药物对心肌的直接作用，还可观察药物对冠脉流量的影响。本法虽然排除了神经体液的作用，但不能同时控制前、后负荷和心率，故又建立了离体工作心脏实验法。在位心脏实验法有Bülbring法、家兔不破坏胸膜记录心收缩力法、狗心肺装置实验法等。

冠脉血管及冠脉血流量实验法离体实验主要有冠状动脉条实验、Langendorff离体心脏测定冠脉灌流量法；在位心脏测定冠脉血流量及心肌耗氧量、测定区域性心肌血流量、86Rb测定心肌营养血流量法。心血管药理实验方法中的技术手段还有：清醒大鼠心功能及血流动力学实验、动物心电图、心导管技术等。

三、抗心肌缺血与再灌注损伤药物实验法简介

首先介绍心肌缺血与再灌注损伤模型的制备：①整体动物结扎冠脉后再灌注模型（常用犬、兔、大鼠进行）；②离体心脏缺氧造成全心缺氧和其

后的在给氧损伤，亦可结扎离体心脏的冠脉，然后松结产生局部心肌再灌注损伤；③体外心肌培养缺糖缺氧与再给糖给氧产生再灌注损伤。

心肌缺血与梗塞范围测定：组织学检查；NBT或TTC标本染色法；心肌酶活性测定（如CK、LDH）；心表面NADH荧光照相法。

还可应用心肌代谢测定法观察药物的影响，如测定血或组织中的乳酸、游离脂肪酸（FFA）、丙二醛（MDA）等，一般用试剂盒检测。

四、脑缺血和脑血流实验法简介阻断支配脑组织的血管，可模拟与人脑卒中相近似的病理模型，实验性脑缺血模型制备的方法主要有：1、全脑缺血：结扎大鼠双侧颈总动脉和椎动脉；结扎大鼠双侧颈总动脉合并血压下降法；沙土鼠双侧颈总动脉阻断；结扎大鼠一侧颈总动脉合并低氧环境处理等。2、局灶性脑缺血：阻断大鼠大脑中动脉（MCAO）法；沙土鼠一侧颈动脉结扎；光化学法致大鼠局部脑血栓和颈动脉内注入血栓法等。3、自发性高血压大鼠阻断大脑中动脉致脑卒中模型。

评价脑缺血程度的方法：⑴脑功能改变（神经症状评分、脑电图改变等）；⑵测定脑血流（放射微球法、放射自显影法和氢清除法等）；⑶组织学检查（脑切片染色法、病理切片）；⑷脑代谢测定（如SOD、MDA等）。测定脑血流是评价脑缺血程度和药物作用的重要方法，目前常用的方法主要有：①开颅窗显微镜下直接观察；②流量计测定法；③示踪技术常用H2清除法；④脑组织同位素标记法；⑤大鼠脑血管在位灌流法等。

五、抗心功能不全药与抗心律失常药物实验简介

㈠抗心功能不全药实验法在心功能不全动物模型上观察药物作用，制备模型至关重要，方法主要有：1、心脏压力超负荷模型：主动脉狭窄法（结扎或用特制动脉夹致腹主动脉狭窄、缩窄肾动脉、单侧或双侧肾切除等）；肺动脉狭窄法。2、心脏血容量超负荷模型：动静脉短路法、腔静脉缩窄法、主动脉瓣与二尖瓣关闭不全法等。3、化学因素致心功能不全模型：抑制心脏的药物（普萘洛尔、维拉帕米、戊巴比妥钠等）诱发心衰；阿霉素致心肌损害；氧自由基损伤心功能；心肌梗死加快速起搏造成CHF；拟似冠心病高血压的CHF等。

㈡抗心律失常药实验法制备实验性心律失常通常以心电图II导联记录以观察心律失常类型、发生时间和持续时间等，进行药物研究可预防给药和治疗给药。主要方法简介如下：

1、药物诱发心律失常：氯仿致小鼠室颤；氯仿-肾上腺素致兔室性心律失常；哇巴因、乌头碱、氯化钡等诱发室性心律失常；乙酰胆碱诱发房颤等。

2、电刺激诱发心律失常：电刺激下丘脑或直接刺激心脏。 3、冠脉结扎诱发心律失常。

4、产生窦房结功能低下及房室传导阻滞模型：阻塞窦房结动脉和房室

结动脉法；缺氧营养液灌流离体窦房结和房室结标本法；维拉帕米致窦房结、房室结功能低下等。

第九节行为药理学实验方法与技术简介

行为药理学主要研究药物对大脑学习、记忆功能及情绪活动（如焦虑、抑郁等）的影响，也包括药物依赖性的实验评价。

一、学习、记忆实验法和记忆障碍动物模型简介学习和记忆是脑的重要功能之一。学习是指新行为（经验）获得和发展，记忆就是使获得的经验保持和再现。人类记忆区可分为三种存贮系统，即感觉记录系统，短时存贮系统和长时存贮系统。目前关于学习记忆的机制，认为“感觉记忆”即感知事物后在极短时间内的记忆，与脑的电活动有关；“短时记忆”和“长时记忆”可能与脑的神经细胞的突触效能或脑的化学变化有关，即学习、记忆有赖于全脑的整合功能，完成记忆的过程离不开知觉、情绪、注意、意图等心理功能，也离不开早已贮存的知识和经验。

（一）动物学习、记忆实验方法及模型：

1、跳台法（step down test）简便易行，有较高的敏感性，尤适合于初筛药物。可同时观察药物对记忆过程及对学习的影响。

2、避暗法（step through test）利用鼠类的嗜暗习性而设计。简便易行，对记忆过程特别是对记忆再现有较高的敏感性。

3、穿梭箱（shuttle box）可同时观察被动和主动回避性反应。

4、爬杆法（pole-jump text）适用于大鼠或小鼠。观察非条件刺激和条件刺激对动物逃避行为的影响。

5、迷津(maze) 学习、记忆的经典实验，至今仍经常采用。常用的装置有Y型迷路、水迷路和Morris水迷津。

6、小鸡的一次性味觉----回避学习行为的动物模型 Cherkin等人（1969）在前人研究的基础上，根据小鸡在自然环境中先天性的自发啄食行为而建立的小鸡一次性味觉－回避学习行为(one-trial-avoidance task)的实验模型。其优点：建立模型快，记忆保持良好；脑内注射方便；实验重复性好；实验成本低等。

7、操作式条件反射（operant conditioned reflex）在巴甫洛夫经典的条件反射的基础上创立的一种实验方法，通过动物完成压杆或按键反应的特定活动来研究动物的学习行为。（二）记忆障碍动物模型

1、记忆获得障碍模型应用抗胆碱药物制备，常用东莨菪碱、樟柳碱。 2、记忆巩固障碍模型如电休克、缺氧、使用蛋白质合成抑制剂（如环己酰亚胺、氯霉素等）。

3、记忆再现缺失模型如乙醇可明显干扰记忆再现。

4、其他小鼠脑缺血-再灌注模型；大鼠中脑动脉结扎-再灌注模型；脑栓塞模型；基底神经核-胆碱系统损伤模型及应激引起的学习、记忆障碍模型等。

二、抗焦虑实验方法及动物模型简介

焦虑以恐惧、忧虑、紧张不安等精神障碍为主要表现，一般认为，焦虑模型至少必须符合三个要求：①对临床有效的抗焦虑药敏感并呈剂量依赖性；②不同抗焦虑剂的相对强度应与在人体观察到的结果类似；③能够区别抗焦虑剂与非抗焦虑剂的不同效应。现有的焦虑模型包括二大类：一类是基于动物非条件反射的模型，根据其行为特点又可分为：⑴探究行为模型：大鼠高架十字迷宫（the elevated plus-mazetest, EPM）、小鼠明暗穿箱(light-dark transitions)、小鼠爬梯实验（the staircase test）、孔板实验（the holiboard test）、大鼠开场实验（the open field test）等；⑵社会行为模型：大鼠群居接触实验（the social interaction test）、分离发声实验（separation vocalization）。另一类是基于条件反射（传统学习模式）的模型，主要有Geller-Seifter冲突实验（Geller-Seifter conflict test ）、安全信号撤除实验（the safety signal withdrawal test）、Vogel冲突模型（the Vogel’s conflict test）等。这些焦虑模型虽然并非人类焦虑情绪的精确复制，但对于抗焦虑药物的评筛及探讨焦虑的生化机制发挥了重要作用。

三、抗抑郁实验方法及动物模型简介

1、药物之间相互作用模型一般作为抗抑郁药初筛手段。主要有：利血平拮抗（reserpine reversal）；高剂量阿朴吗啡的拮抗（antagonism of high dose of apomorphine）；5-HT诱导的甩头行为（5-HT induced head-twitches）；小鼠育亨宾增强模型（yohimbine potentiation model in mice）。

2、应激模型包括：“行为绝望”及其衍生（“behavioural despair”and derivatives），如强迫游泳实验、悬尾实验等；获得性无助（learned helplessness）；未预知的长期应激刺激（chronic unpredictable stress）；未预知的长期温和应激刺激（chronic unpredictable mild stress）等。

3、脑损伤模型嗅球切除模型（olfactory bulbectomy model）。

4、72s低频率差式强化程序（differential reinforcement of low rate 72-s schedule）。

四、药物依赖性动物实验方法简介

药物依赖性包括机体依赖性和精神依赖性。机体依赖性的试验评价以阿片类药物为代表，通用的实验方法主要有三种：自然戒断实验（spontaneous withdrawal test）、催促戒断实验（precipitation withdrawal test）和替代实验（substitution test）。常用动物：小鼠、大鼠、狗、猴。目前还发展了用离体组织标本进行评价，其方法主要为：①已形成阿片依赖性的整体动物身上取其离体组织进行试验；②直接将离体组织放在含阿片类药物的Krebs液

浴一段时间后再进行试验。药物精神依赖性评价方法中认为比较成熟且应用较多的主要有两种：自身给药试验（drug self-administration）和药物辨别试验（drug-discrimination）；80年代后又发展了一种经济简便的条件性位置偏爱试验（conditioned place preference）。

第十节时间药理学实验方法与技术

时间药理学即是在药理学研究时融入时间的概念，探讨生物节律性对药效学和药动学的影响，从而建立择时给药、合理给药的药物治疗方法。

生物节律性可以表现为宏观的生理变量的节律性，亦可表现为微观的细胞、亚细胞和酶系活动、活性的节律性；可以表现为外部环境（又称授时因子或同步因子）节律性变化对机体内环境产生的节律性影响，亦可表现为机体内环境对外部环境节律性变化所产生的适应性节律性变化。对于药物与机体的相互作用来说，机体的生物节律性会对药物的药理作用产生影响，药物也可能对机体的生物节律性产生影响。因此，在时间药理学的研究中，必须做到：

1、兼顾机体内、外环境节律性的变化，严格控制实验条件的同步化如对授时因子（动物接受的光照时间、所处的环境温度、湿度，群居还是单养、进食进水时间、食物成分和进食量）的控制和对动物机体内环境（如年龄、体重、性别、是否处于特殊的生理期：发情、妊娠、分娩等）的选择控制等。

2、选择准确、可靠、灵敏、易于监测的节律标志标志节律是指可以灵敏地反应机体某种生理机能过程的时间特征, 并可用作监测标志的节律。如啮齿动物肝药酶活性在24:00最高，14:00活性最低。人糖皮质激素分泌量在上午8:00达峰值，24：00～8:00的分泌量为全天总量的70%。正常人胆囊的昼夜节律，胆囊面积5：00～7：00>11：00～13：00>17：0：00～19：00、23：00～1：00（P<0.01）;3：00比23：00～1：00明显增大。

3、使用特殊的监测系统和给药系统时间药理学研究就是探讨生物节律对药物效应的影响或药物对生物节律的影响。因此，必须用特殊的仪器设备同步收集相关的节律指变化参数。常用的仪器有动物行为自动监测仪，摄食节律监测仪，体温、心血管功能监测仪，程序化给药泵等。

第二章动物实验的基本操作与技术

动物实验方法是多种多样的，在医学的各个领域内都有其不同的应用，其中一些基本方法都是共同性的，如动物的选择、抓取、固定、麻醉、脱毛、给药、采血、采尿、急救、处死、尸检等，不管是从事何种课题的医学研究都要用这套基本方法，因此，动物实验基本方法，已成为医学科技工作者必须掌握的一项基本功。

第一节实验动物的抓取固定方法

一、小鼠抓取固定方法

小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图2-1之一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图2-1之二）。有经验者可直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图2-2），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。

图2-1 小鼠的抓取固定方法

图2-2 小鼠尾静脉注射方法

二、大鼠的抓取固定方法大鼠的抓取方法基本同小鼠，只不过大鼠比小鼠牙尖性猛，不易用袭击方式抓取，否则会被咬伤手指。抓取时为避免咬伤，可带上帆布手套。如果进行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃时，同样可采用左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手即可进行各种实验操作。也可伸开左手之虎口，敏捷地从后一把抓住。若做手术或解剖等，则需事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活结缚腿，背卧位绑在大鼠固定板上；尾静脉注射时的固定同小鼠（只需将固定架改为大鼠固定盒）。三、蛙类的抓取固定方法

蛙类抓取方法宜用左手将动物背部贴紧手掌固定，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压住左、右前肢、右手进行操作（见图2-3）。

图2-3 蛙、蟾蜍抓取固定方法

在抓取蟾蜍时，注意勿挤压其两则耳部突起之毒腺，以免毒液射进眼中。实验如需长时间观察，可破坏其脑脊髓（观察神经系统反应时不应破坏脑脊髓）或麻醉后用大头针固定在蛙板上。依实验需要采取俯卧位或仰卧位固定。

四、兔的抓取固定方法

（一）抓取实验家兔多数饲养在笼内，所以抓取较为方便。一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上（图2-4），这样就避免了抓取过程中的动物损伤。不能采用抓双耳或抓提背部。

（二）固定一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；若做血压测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上，四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定木块上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台铁柱上；马蹄形固定多用于腰背部，尤其是颅脑部位的实验，固定时先剪去两侧眼眶下部的毛皮，暴露颧骨突起，调节固定器两端钉形金属棒。使其正好嵌在突起下方的凹处，然后在适当的高度固定金属榛。用马蹄形固定器可使兔取用背卧位和腹卧位，所以是研究中常采用的固定方法。

图2-4 家兔抓取方法

第二节实验动物编号标记方法

动物在实验前常常需要作适当的分组，那么就要将其标记使各组加以区别。标记的方法很多，良好的标记方法应满足标号清晰、耐久、简便、适用的要求。

常用的标记法有染色、烙印、号牌等方法。

一、颜料涂染

这种标记方法在实验室最常使用，也很方便。使用的颜料一般用3-5%苦味酸溶液（黄色），标记时用毛笔或棉签蘸取上述溶液，在动物体的不同部位涂上斑点，以示不同号码。编号的原则是：先左后右，从上到下。二、烙印法

用刺数钳在动物耳上刺上号码，然后用棉签蘸着溶在酒精中的黑墨在刺号上加以涂抹，烙印前最好对烙印部位预先用酒精消毒。三、号牌法

用金属制的牌号固定于实验动物的耳上，大动物可系于颈上。

对猴、狗、猫等大动物有时可不做特别标记，只记录它们的外表和毛色即可。

第三节实验动物给药途径和方法

在动物实验中，为了观察药物对机能功能、代谢及形态引起的变化，常需将药物注入动物体内。给药的途径和方法是多种多样的，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型等情况确定。一、皮下注射

注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。

二、皮内注射

皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连4(1/2)细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。三、肌肉注射

肌肉注射应选肌肉发达，无大血管通过的部位，一般多选臀部。注射时垂直迅速刺入肌肉，回抽针栓如无回血，即可进行注射。给小白鼠、大白鼠等小动物作肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳和头部皮肤，右手取连有5（1/2）针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。四、腹腔注射

用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图2-5），为避免伤及内脏，可使动

物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。

图2-5 小鼠腹腔注射方法

五、静脉注射

（一）兔兔耳部血管分布清晰。兔耳为动脉，耳外缘为静脉。内缘静脉深不易固定，故不用。外缘静脉表浅易固定，常用。先拔去注射部位的被毛，用手指弹动或轻揉兔耳，使静脉充盈，左手食指和中指夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，无名指及小指垫在下面，右手持注射器连6号针头尽量从静脉的远端刺入，移动拇指于针头上以固定针头，放开食指和中指，将药液注入（图2-6）。用干棉球压在针眼处，然后拔出针头，继续压迫针眼至血止。

图2-6 家兔耳缘静脉注射方法

（二）小白鼠和大白鼠一般采用尾静脉注射。鼠尾静脉有三根，左右两

侧及背侧各一根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用，背侧一根也可采用，但位置不易固定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用45～50℃的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2)号细针头，使针头与静脉平行（小于30度），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针。此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射（图2-7）。

图2-7 小鼠尾静脉注射方法

六、经口给药

在急性试验中，经口给药多用灌胃法，此法剂量准确，适用于小白鼠、大白鼠、家兔等动物。

（一）小鼠、大鼠（或豚鼠）用输血针头或小号腰穿针头，将其尖端斜面磨去，用焊锡在针尖周围焊一圆头，注意勿堵塞针孔，即成灌胃针；亦可用烧成圆头的硬质玻璃毛细管或特制的塑料毛细管，作为导管。灌胃时将针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。

一般当灌胃针插入小鼠3－4cm，大鼠或豚鼠4-6cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2-1ml，大鼠1-4ml，豚鼠为1-5ml。

（二）狗、兔、猫、猴灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约10-15cm，粗细应适合狗嘴，约2-3cm，中间钻一小孔，孔的直途为5-10cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道。此时应检查导管是否正确插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中。未误入气管，即可将药液灌入。

各种动物一次灌胃能耐受的最大容积小鼠为0.5-1.0ml，大鼠4-7ml，豚鼠为4-7ml，家兔为80-150ml，狗为200-500ml。

第四节实验动物用药量的计算方法

动物实验所用的药物剂量，一般按mg/kg体重或g/kg体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当于每kg体重应注射的药液量（ml数），以便给药。

例1：家兔体重1.8kg的，静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，按每kg体重1g的剂量注射，应注射多少ml？

计算方法：兔每kg体重需注射1g，注射液为20％，则氨基甲酸乙酯溶液的注射量应为5ml/kg体重，现在兔体重为1.8kg，应注射20%氨基甲酸乙酯溶液用量=5×1.8=9ml。

例2：小白鼠体重23g的，注射盐酸吗啡15mg/kg，溶液浓度为0.1%，应注射多少ml？

计算方法：小白鼠每kg体重需吗啡的量为15mg，则0.1%盐酸吗啡溶液的注射量应为15ml/kg体重，现小白鼠体重为23g，应注射0.1%盐酸吗啡溶液的用量=15×0.023=0.345ml。

第五节实验动物的麻醉

在一些动物实验，特别是手术等实验，为减少动物的挣扎和保持其安静，并便于操作，常对动物采用必要的麻醉。由于动物种属间的差异等情况，所采用的麻醉方法和选用的麻醉剂亦有不同。一、常用的麻醉剂

动物实验中常用的麻醉剂分为三类，即挥发性麻醉剂、非挥发性麻醉剂和中药麻醉剂。

1．挥发性麻醉剂这类包括乙醚、氯仿等。乙醚吸入麻醉适用于各种动物，其麻醉量和致死量差距大，所以安全度亦大，动物麻醉深度容易掌握，而且麻后苏醒较快。缺点是对局部刺激作用大，可引起上呼吸道粘膜液体分泌增多，再通过神经反射可影响呼吸、血压和心跳活动，并且容易引起窒息，故在乙醚吸入麻醚时必需有人照看，以防麻醉过深而出现上情况。 2．非挥发性麻醉剂这类麻醉剂种类较多，包括苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫喷妥钠等巴比妥类的衍生物，氨基甲酸乙酯和水合氯醛。这些麻醉剂使用方便，一次给药可维持较长的麻醉时间，麻醉过程较平衡，动物无明显挣扎现象。但缺点是苏醒较慢。

3．中药麻醉剂动物实验时有时也用到象洋金花和氢溴酸东莨菪碱等

中药麻醉剂，但由于其作用不够稳定，而且常需加佐剂麻醉效果才能理想，故在使用过程中不能得到普及，因而，多数实验室不选用这类麻醉剂进行麻醉。

二、动物的麻醉方法（一）全身麻醉 1、吸入法用一块圆玻璃板和一个钟罩或一个密闭的玻璃箱作为挥发性麻醉剂的容器，多选用乙醚作。麻醉时用几个棉球，将乙醚倒在其中，迅速转入钟罩或箱内，让其挥发，然后把待麻醉动物投入，约隔4-6分钟即可麻醉，麻醉后应立即取出，并准备一个蘸有乙醚的棉球小烧杯，在动物麻醚变浅时给套在鼻上使其补吸。本法最适于大、小鼠的短期操作性实验的麻醉，当然也可用于较大的动物，只是要求有麻醉口罩或较大的玻璃箱。由于乙醚燃点很低，遇火极易燃烧，所以在使用时，一定要远离火源。 2、腹腔和静脉给药麻醉法

非挥发性和中药麻醉剂均可用作腹腔和静脉注射麻醉，操作简便，是实验室最常采用的方法之一。腹腔给药麻醉多用于大、小鼠和豚鼠，较大的动物如兔、狗等则多用静脉给药进行麻醉。由于各麻醉剂的作用长短以及毒性的差别。所以在腹腔和静脉麻醉时，一定控制药物的浓度和注射量（见表2-1）。

表2-1 常用麻醉剂的用法及剂量麻醉剂动物戊巴比妥狗、兔纳

给药方法剂量常用维持时间

（mg/kg）浓度% 静脉腹腔

30 40-50 40-50 15-20 40 15-20 80-100 50 750-1000

3 3 2 2 1 1 2 2 30 20

3-4小时，诱导期不明显

2-4小时，毒性小，主要适用小动物的麻醉。 2-4小时中途加上1/5量，可维持1小时以上，麻醉力强，易抑制呼吸。 15-30分钟，麻醉力强，宜缓慢注射。

大、小鼠、豚腹腔鼠

硫喷妥纳狗、兔

大白鼠小白鼠

氯醛糖兔

大白鼠

乌拉坦兔

大、小白鼠蛙

静脉腹腔腹腔静脉腹腔静脉

皮下或肌800-1000 肉

淋巴囊注0.1ml/100g 20-25 射

蟾蜍

淋巴囊注1ml/100g 射

（二）局部麻醉

1、猫的局部麻醉，一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因。

2、兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉。

3、狗的局部麻醉用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%盐酸可卡因。三、麻醉注意事项

1、静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中，不可过高，以免麻醉过急；但也不能过低，以减少注入溶液的体积。 2、麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降，可影响实验的准确性。此时常需采取保温措施。保温的方法有，实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。常用实验动物正常体温：猫为38.6℃±1.0℃，兔为38.4℃±1.0℃，大鼠为39.3℃±0.5℃。

3、作慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。

第六节急性动物实验中常用的手术方法

急性动物实验中常以血压、呼吸等为指标，以静脉注射、放血等为实验方法。需要暴露气管、颈总动脉，颈外静脉，股动脉，股静脉，并做相应的插管，以及分离迷走神经，减压神经及股神经等。因此手术主要在颈部及股部进行，现分述如下：一、兔、狗颈部手术

颈部手术的目的在于暴露气管、颈部血管并作相应的插管以及分离神经等。颈部手术成败的关键在于熟悉动物颈部及手术要领，防止损伤血管和神经现以兔为例，说明如下：

（一）动物麻醉一般选用20%乌拉坦作全身麻醉。

（二）家兔背位固定于兔台上，颈部剪毛。剪下的毛置水中，以免飞扬。

（三）气管及颈部血管神经分离术

1、气管暴露术：用手术刀沿颈部正中线从甲状软骨处向下靠近胸骨上缘作一切口（兔长约4～6cm，狗的长约10cm）。切开皮肤后，以气管为标志从正中线用剪刀剪开筋膜，用止血钳钝性分离正中的肌群即可暴露气管，分离食道与气管，在气管下穿过一条棉线备用。

2、颈总动脉分离术：正中切开皮肤及皮下筋膜，暴露肌肉。将肌肉层与皮下组织分开。此时清楚可见在颈中部位有两层肌肉。一层与气管平行，覆于气管上，为胸骨舌骨肌。其上又有一层肌肉呈V字形走行向左右两侧分开。此层为胸锁乳突肌。用镊子轻轻夹住一侧的胸锁乳突肌，用止血钳在两层肌肉的交接处（即V形沟内）将它分开（注意，切勿在肌肉中分，以防出血）。在沟底部即可见到有搏动的颈总动脉鞘。用眼科镊子（或纹式止血钳）细心剥开鞘膜，避开鞘膜内神经，分离出长约3-4cm的颈总动脉，在其下穿两根细线备用。

3、颈部迷走、交感、减压神经分离术：于家兔颈部，在找到颈动脉鞘以后，将颈总动脉附近的结缔组织薄膜镊住，并轻拉向外侧使薄膜张开，即可见薄膜上数条神经，根据各条神经的形态、位置和走向等特点来辨认。迷走神经最粗，外观最白，位于颈总动脉外侧，易于识别。交感神经比迷走神经细，位于颈总动脉的内侧，呈浅灰色；减压神经细如头发，位于迷走神经和交感神经之间，在家兔为一的神经，沿交感神经外侧后行走，但在人、狗此神经并不单独行走，而是行走于迷走、交感干或迷走神经中。将神经细心分离出2-3cm长即可，然后各穿细线备用。

4、颈外静脉暴露术颈外静脉浅，位于颈部皮下，其属支外腭静脉和内腭静脉，颈部正中切口后，用手指从皮肤外将一侧部组织顶起，在胸锁突乳肌外缘，即可见很粗而明显的颈外静脉。仔细分离长约3-4cm的颈外静脉，穿两线备用。

(四) 气管及颈部血管插管术

在前述分离术的基础上，按需要选作下列插管术。

1、气管插管术：暴露气管后在甲状软骨下1-2cm处，于两软骨环之间，剪开气管口径之半，再用剪刀沿正中线向头端剪开气管约0.5-1cm，使气管切口呈倒“T”形。用镊子夹住T形切口的一角，将适当口径的气管套管由切口向肺方向插入气管腔内，用准备好的棉线扎紧，再将结扎线固定于“Y”形气管插管分叉处，以防气管套管脱出。

2、颈总动脉插管术：颈总动脉主要用于测量颈动脉压。为此，在插管前需使动物肝素化，并将口径适宜的充满抗凝液体（也可用生理盐水）的动脉插管（也可用塑料管）准备好。用动脉夹住血管的近心端，将准备好的两根线中的一根结扎血管的远心端，另一根置于动脉夹与结扎点之间备用。插管时以左手拇指及中指拉住离心端结扎线头，食指从血管背后轻扶血管。右手持锐利的眼科剪，使与血管呈45度角，在紧靠离心端结扎线处向心一剪，

剪开动脉壁之周径1/3左右（若重复数剪易造成切缘不齐，当插管时易造成动脉内膜内卷或插入层间而失败），然后持动脉插管，以其尖端斜面与动脉平行地向心方向插入动脉内，用备好的细线扎紧。最后将动脉插管作适当固定，以保证测压时血液进出插管之通畅。

3、颈外静脉插管术：颈外静脉可用于注射、输液和中心静脉压之测量。血管插管插入方法与颈总动脉相似，现将用于中心静脉压测量的插管方法作一简介：

在插管前先将兔肝素化，并将联接静脉压检测装置的细塑料管导管充盈含肝素之生理盐水。在导管上作一长5-8cm的记号，导管准备好后，先将静脉远心端结扎，靠近结扎点的向心端作一剪口，将导管插入剪口，然后一边拉结扎线头使颈外静脉与颈矢状面、冠状面各呈45度角，一边轻柔地向心端缓慢插入，遇有阻抗即退回改变角度重插，切不可硬插（易插破静脉进入胸腔）一般达导管上记号为止，此时可达右心房入口处。若导管插管成功，则可见静脉压检压计水面漂浮于中心静脉压数值附近随呼吸而上下波动。二、兔、狗股部手术

股部手术目的在于分离股神经、股动、静脉及进行股动、静脉插管，以备放血、输血输液、注射药物等用。现以兔为例其基本步骤如下：（一）动物背位固定于兔台上，腹股沟部剪毛。

（二）用手指触摸股动脉搏动，辨明动脉走向，在该处作局部麻醉并作方向一致长约4-5cm的切口。用止血钳小心分离肌肉及深部筋膜，便清楚地暴露出股三角区。股三角区上界为鼠蹊韧带，内界为缝匠肌，外界为内收长肌。肌动脉及神经即由此三角区通过。股神经位于外侧，股静脉位于内侧，肌动脉位于中间偏后。

（三）用止血钳细心将股神经首先分出，然后分离股动、静脉间的结缔组织，清楚地暴露股静脉，如作插管可分离出一段静脉（约2-2.5cm）。穿两根细线备用。再仔细分离股动脉，将股动脉与其部的组织分离开，长约2-2.5cm。切勿伤及股动脉分支。动脉下方穿两根细线备用。

（四）在动物行肝素化后作股动、静脉插管。狗的血管粗大，插管较易。家兔血管细，插管较难；因此要细致耐心和掌握要领。

1、股动脉插管术：于肌动脉近心端用动脉夹夹住，远心端用细线结扎，牵引此线在贴近远心端结扎处剪开血管向心插入动脉套针或塑料管，结扎固定后备放血或注射用。

2、股静脉插管术：股静脉插管术，除不需用动脉夹外，基本与股动脉插管相同。但因静脉于远心端结扎后静脉塌陷呈细线状，较难插管，因此可试用静脉充盈插管法。即：在股静脉近心端用血管夹夹住（也可用线提起），活动肢体使股静脉充盈，股静脉远心端结扎线打一活扣，待手术者剪口插入套针后，再由助手迅速结扎紧。

第七节实验动物的急救措施

当实验进行中因麻醉过量、大失血、过强的创伤、窒息等各种原因，而使动物血压急剧下降甚至测不到、呼吸极慢而无规则甚至呼吸停止、角膜反射消失等临床死亡症状时，应立即进行急救。急救的方法可根据动物情况而定。对狗、兔、猫常用的急救措施有下面几种。 1、针刺

针刺人中穴对挽救家兔效果较好。对狗用每分钟几百次频率的脉冲电刺激膈神经效果较好。 2、注射强心剂

可以静脉注射0.1%肾上腺素1ml，必要时直接作心脏内注射。肾上腺素具有增强心肌收缩力，使心肌收缩幅度增大与加速房室传导速度、扩张冠状动脉、增强心肌供血、供氧及改善心肌代谢、刺激高位及低位心脏起搏点等作用。

当动物注射肾上腺素后，如心脏已搏动但极为无力时，可从静脉或心腔内注射1%氯化钙5ml。钙离子可使心肌收缩加强，血压上升。 3、注射呼吸中枢兴奋药

可从静脉注射山梗菜碱或尼可刹米。给药剂量和药理作用如下：

尼可刹米：每只动物一次注25%1ml。此药可直接兴奋延髓呼吸中枢，使呼吸加速加深；对血管运动中枢的兴奋作用较弱。在动物抑制情况下作用更明显。

山梗菜碱：每只动物一次可注入1%0.5ml。此药可刺激颈动脉体的化学感受器，反射性地兴奋呼吸中枢；同时此药对呼吸中枢还有轻微的直接兴奋作用。作为呼吸兴奋药，它比其他药作用迅速而显著。呼吸可迅速加深加快，血压亦同时升高。

4、动脉快速注射高渗葡萄糖液

一般常采用经动物股动脉逆血流加压、快速、冲击式的注入40%葡萄糖溶液。注射量根据动物而定，如狗可按2-3ml/kg体重计算。这样可刺激动物血管内感受器，反射性地引起血压呼吸的改善。 5、动脉快速输血、输液

在作失血性休克或死亡复活等实验时采用。可在动物股动脉插一软塑料套管，连接加压输液装置（血压计连接输液瓶上口，下口通过胶皮管连接塑

料套管）。当动物发生临床死亡时，即可加压（180-2000mmHg）快速从股动脉输血和低分子右旋糖酐。如实验前动物曾用肝素抗凝，由于微循环血管中始终保持通畅，不出现血管中血液凝固现象，因此就是动物出现临床死亡后数分钟，采用此种急救措施仍易救活。 6、人工呼吸

可采用双手压迫动物胸廓进行人工呼吸。如有电动人工呼吸器，可行气管插管后，再连接人工呼吸器进行人工呼吸。一旦见到动物自动呼吸恢复，即可停止人工呼吸。

有条件时，当动物呼吸停止，而心搏极弱或刚停止时，可用5%CO2和60%O2的混合气体进行人工呼吸，效果更好。

采用人工呼吸器时，应调整其容量：大鼠为50次/分钟，每次8ml/kg(即400ml/kg/分钟)；兔和猫为30次/分钟，每次10ml/kg（即300ml/kg/分钟）；犬为20次/分钟，每次100ml/kg(即2000ml/kg/分钟)。

第八节实验动物的处死方法

一、蛙类

常用金属探针插入枕骨大孔，破坏脑脊椎的方法处死。将蛙用湿布包住，露出头部，左手执蛙，并且用食指按压其头部前端，拇指按压背部，使头前俯；右手持金属探针由头前端沿线向尾方刺触，触及凹陷处即枕骨大孔所在。将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔。这时将探针尖端转向头方，向前探入颅腔，然后向各方搅动，以捣毁脑组织，如探针确在颅腔内，实验者可觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出，再由枕骨大孔刺入，并转向尾方，与脊柱平行刺入椎管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否被完全破坏，可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后，用一小干棉球将针孔堵住，以防止其出血。

操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。如被射入时，即需立即用生理盐水冲洗眼睛。二、大鼠和小鼠 1、脊椎脱臼法

右手抓住鼠尾用力向后拉，同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。 2、断头法

实验者戴上棉纱手套，用右手握住大鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉。小鼠处死法相同。

3、击打法

右手抓住鼠尾，提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死亡。用小木锤用力击打鼠头部也可致死。 4、急性大失血法

可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。 5、化学致死法

吸入一氧化碳，大、小鼠在一氧化碳浓度为0.2-0.5%环境中即可致死。皮下注射士的宁，吸入乙醚、氯仿，均可致死。士的宁注射量，小鼠为0.76～2.0mg/kg体重，大鼠3.0-3.5ml/kg体重。氯化钾处死大鼠剂量：25%溶液0.6ml/只静脉注入。三、狗、猫、兔、豚鼠（一）空气栓塞法

向动物静脉内注入一定量的空气，使之发生栓塞而死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相混致血液成泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻梗其分支，进入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快致死。一般兔、猫等静脉内注入20-40ml空气即可致死。每条狗由前肢或后肢皮下静脉注入80～150ml空气，可很快致死。（二）急性失血法

先使动物轻度麻醉，如狗可按每公斤体重静脉注射硫喷妥纳20-30mg，动物即很快入睡。暴露股三角区，用锋利的杀狗刀在股三角区作一个约10cm的横切口，把股动、静脉全切断，立即喷出血液。用一块湿纱布不断擦去股动脉切口周围处的血液和血凝块，同时不断的用自来水冲洗流血，使股动脉切口处保持畅通，动物3～5分钟内即可致死。采用此种方法，动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种较好的方法。（三）破坏延脑法

如果急性实验后，脑已暴露，可用器具将延髓破坏，导致动物死亡。对家兔也可用木锤用力锤击其后脑部，损坏延脑，造成死亡。（四）开放性气胸法

将动物开胸，造成开放性气胸。这时胸膜腔的压力与大气压力相等，肺脏因受大气压缩发生肺萎陷，纵隔摆动，动物窒息而死。（五）化学药物致死法

静脉内注入一定量的氯化钾溶液，使动物心肌失去收缩能力，心脏急性扩张，致心脏驰缓性停跳而死亡。每条成年兔由兔耳缘静脉注入10％氯化钾溶液5～10ml；每条成年狗由狗前肢或后肢下静脉注入20～30ml，即可致死。

静脉内注入一定量的溶液，使血液内蛋白凝固，动物由于全身血液循环严重障碍和缺氧而死。每条成年狗静脉注入10%溶液

20ml即可致死。也可将与酒精按一定比例配成动物致死液应用。皮下注射士的宁致死：豚鼠剂量为3.0-4.4mg/kg体重，兔0.5-0.5mg/kg体重，狗0.3-0.42mg/kg体重，猫1.0-2.0mg/kg体重。经口或注射DDT致死；（LD50）：豚鼠：经口0.4g/kg体重，皮下0.9g/kg体重。兔：经口0.3g/kg体重，皮下0.25g/kg体重；静脉0.043g/kg体重。狗：静脉0.067g/kg体重。

第三章离体实验

实验一离体平滑肌α-抗交感活性测定

【目的】观察各种药物对去甲肾上腺素引起血管平滑肌收缩作用降低

的程度。

【材料】

动物：Pirbring White豚鼠，雌雄均可，体重400±10g。仪器：器官槽，水平换能器，等张换能器，手术器械。

药物：Krebs－Henseleit缓冲液，10-9-10-5mol/L去甲肾上腺素，待测药物。

【操作步骤】

将动物击晕放血处死，迅速取下肺动脉或胸主动脉，切成宽1－2mm，长15－20mm的螺旋条，固定在器官槽中，血管条前负荷1g。槽内营养液为含11.5mol/L葡萄糖的Krebs－Henseleit缓冲液，恒温37°C，通入95％O2 ，5%CO2气体。连接等张换能器（测定等长收缩力）或水平换能器（测定血管条长度变化）。平衡60 min，稳定之后开始实验，依次加入10-9-10-5mol/L 去甲肾上腺素，观察血管收缩功能，当达到强弱一致的收缩坪值时，开始加入待测药物(可连续给药)，至该药物的最大效应。

【结果】

1、测定给药前后血管的收缩力。

2、以NA引起的收缩力为100％，计算药物的抑制率。

3、从单个剂量效应曲线上测定IC50值。IC50表示对去甲肾上腺素引起收缩产生50％舒张效应时对应药物剂量。

【注意事项】

1、若加入代测药物后，血管舒张活性不明显，可加入酚妥拉明（1×

10 -7 mol/L）,以测定血管标本的敏感性。

2、如果化合物具有血管舒张活性，则增加去甲肾上腺素的浓度以逆

转血管舒张活性。

3、 Krebs－Henseleit缓冲液组分(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7， CaCl 2 2.5，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25，MgSO4 1.2和葡萄糖11.5，pH 7.4。

实验二

药物的血管舒张活性测定

【目的】 1、学习制备去内皮细胞血管螺旋条的方法。

2、观察各种药物对血管舒张活性的影响。

【材料】

动物：Pirbring White豚鼠雌雄均可，体重400±10g或体重为250－400g的SD大鼠。

仪器：器官槽，杠杆换能器，手术器械。

药物：PSSⅠ溶液，去甲肾上腺素（NA）,乙酰胆碱（ach），待测药物.

【方法】

将动物击晕放血处死，迅速取下肺动脉或胸主动脉，室温下浸入PSSⅠ溶液。并切成环，温和摩擦内膜表面去除内皮细胞，螺旋切成宽1－2mm，长15－20mm的条，固定在含有20ml PSSⅠ溶液并通入95％O2 ，5%CO2气体的器官槽内，血管条负荷380mg， 37°C恒温。张力换能器等张记录血管长度的变化。

加药前测试内皮功能完整性，在浴槽内加入ACh，观察血管条瞬时舒张。

平衡60 min，稳定之后开始实验，加收缩剂使血管条收缩。当达到强弱一致的收缩坪值时，开始加入浓度固定的待测药物，每次给药间隔1h或在前一剂量效应已达稳定水平时，连续给药至该药物的最大效应，得到量效曲线。

为避免NO对实验结果产生影响，可在给待测药前15－30min，加入亚甲蓝或氧合血红蛋白（10 µmol/L）,选择性地阻断NO引起的舒张。

【结果】

1、计算舒张的X±S.E.M,第一次加入被测化合物前的收缩高度为

100%.

2、从单个剂量效应曲线上测定IC50值。IC50表示对激动剂引起收缩产生50％舒张效应的药物剂量。

【注意事项】

1、加药前测试内皮功能完整性，在浴槽内加入ACh，观察血管条瞬

时舒张。

2、给待测药前15－30min，加入亚甲蓝或氧合血红蛋白（10 µmol/L）,选择性地阻断NO引起的舒张。

3、PSSⅠ液组分(mmol/L)：KCl 5.0，CaCl 2 1.2，KH2PO4 1．2，NaHCO3 25，MgSO4 0.56和葡萄糖12.0。

实验三离体Langendorff心脏灌流法

【目的】学习制备Langendorff离体心脏灌流模型并观察药物对血流动力学的影响。【材料】

动物：大鼠或豚鼠

仪器：心脏灌流装置，手术器械药物：K-H液待测药物

【方法】

备妥立体心脏灌流装置及K-H液后，取动物击晕头部，迅速开胸暴露心脏,迅速剪下带2. 5～3. 0mm长主动脉的心脏(通常带小部分肺组织) ,浸入预先准备好的4 ℃含氧的K-H 液中,冲洗2 次排空心脏内残留的血液，并剪去多余肺组织,然后移到盛4 ℃生理盐水或K－H 液平皿中(液面盖过心脏) ,用两小镊子夹住主动脉开口逆行插入(1～1. 5mm) Langendorff 插管,结扎固定。剪去左心耳,将球囊导管插入左心室,经导管注入生理盐水,连接压力换能器输入四道生理记录仪，记录LVP、LVEDP、HR,最后将上述电信号输入微分放大器记录±dp/dtmax。

稳定20－30min后，先记录一段正常指标，然后经心脏套管侧支管道注入药物，也可用含有一定药物浓度的灌流液进行灌流，观察有关指标变化。

Krebs－Henseleit缓冲液（K－H 液）组分(mmol/L)：NaCl 118，KCl 4．7，CaCl 2 2．5，KH2PO4 1．2，NaHCO3 25，MgSO4 1．2和葡萄糖11．0，充分通入95 %O2及5 %CO2 混合气,衡定温度37 ℃、pH7. 3。

【结果】

待测药物对LVP、LVEDP、HR、±dp/dtmax的影响。

【注意事项】

1、摘取心脏速度要快，仔细，应排空心脏内淤血。

2、向主动脉插入心脏套管时不宜过深，以防损伤主动脉瓣及堵塞冠状动脉入口。

3、豚鼠和大鼠的药前灌流量以5－8ml/min为宜。灌流液要保持充足的氧气和37℃的温度。

第四章整体实验

实验四毁脊髓大鼠的血压测定

【目的】制备毁脊髓大鼠模型，评价药物对心血管系统的作用【材料】

动物：SD大鼠，♂，250－350g

仪器：手术器械、钢质探针、小动物呼吸机、动脉插管药物：乌拉坦、待测药物

【方法】

取SD大鼠，乌拉坦腹腔麻醉（0.65g/kg）。浅麻醉后，背位固定。左颈总动脉插管供监测血压和采血。此外，气管与右颈外静脉分别插管。将一直径2.2mm，长约11cm的钢质探针通过眼眶和枕骨大孔沿椎管插入脊管全长刺毁脊髓。通过气管切开术的小管，用一部小型动物换气泵给动物换气。换气泵（Harvard Apparatus model 680）空气入口处接一T－型接头，通入氧气流，使动物吸入富氧空气。动物换气频率为每分钟60次。潮气量为100g体重2ml。刺毁脊髓30min后，自颈动脉插管采血0.3ml，立即分析O2分压、CO2分压和pH值，并用自动血气分析仪测定碳酸氢盐浓度。通过改变换气泵冲程体积，将各项指标调整到如下水平：pCO230~43mmHg, pH7.36~7.50, pO287~105mmHg。通过左颈总动脉连续记录血压和心率。

为测定对α1和α2受体拮抗作用，通过静脉注射剂量0.1~30μg/kg的苯肾上腺素（选择性α1受体激动剂）和剂量1~1000μg/kg的BHT920（选择性α2受体激动剂），记录首次剂量－效应曲线。被测药物静脉给药，15min后重复测定激动剂剂量－效应曲线。

【结果】

绘出量效曲线。如果激动剂使血压效应曲线改变，剂量效应曲线可采用对数作图处理并计算效力比。

实验五在体心肌梗死模型

【目的】制备急性心肌梗死模型并观察药物的影响。【材料】

动物：SD大鼠，♂，250－350g

仪器：手术器械、小动物呼吸机、动脉插管药物：乌拉坦、待测药物【方法】

1．制备模型

选用250~300g的SD雄性大鼠。乌拉坦腹腔麻醉（0.65g/kg）浅麻醉后，背位固定。用大半个橡皮球（大小正好套住大鼠头颈部）连接到人工呼吸机，进行人工呼吸。胸部去毛、消毒、沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏。在动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔。迅速缝合胸壁。停止人工呼吸。进行给药观察。

2．梗死范围测量

1）将实验后心脏取下，用盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。

2）沿冠状沟切除心房，留下心室，称重。顺房室沟从心尖心基部平行将心室切成0.1cm厚的心肌片，用生理盐水冲洗干净。

3）将心肌片放在1%的TTC溶液(pH7.4~7.8的0.2mol/L Tris配制)中，在37℃5~7min染色。染色过程中不时摇动或搅拌染色液使之与心肌有充分的接触机会。

4）染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被TTC染为红色。

5）剪去各心肌片被染色的非梗死区心肌，把未染色的梗死心肌称重，除以全心重或心室生即分别得到梗死范围或占心室重的%。

【结果评价】

观察药物对梗死范围的影响。

【注意事项】

由于大鼠心脏表面见到的是静脉，结扎后如未出现明显的心肌梗死心电图波形，应弃去不用。

实验六心室内压测定

【目的】测定大鼠左心室压力并观察药物的影响【材料】

动物：SD大鼠，♂，250－350g

仪器：手术器械、小动物呼吸机、动脉插管药物：戊巴比妥钠、待测药物【方法】

1．导管准备：导管均选用PE－50聚已烯导管。也可用塑料导管加热拉制成内径0.5mm，外径1mm的导管。股动、静脉导管长约20cm，插入端剪成45 o角度平滑的斜面。左室导管长约12cm，插入端剪成平口并把该部用热水稍烫光滑。左室插管通路较直，需将导管插入段制成直的（在导管内插入直金属丝放入热开水中约半分钟，冷却后抽出内芯即可）。插管前在导管内充40IU/ml肝素生理盐水，左室导管非插入端接压力换能器及记录仪、股动、静脉导管非插入端接肝素生理盐水的注射器。

左心室插管应选择右颈总动脉，血压记录选择右股动脉，静脉插管最好也在右侧以减少手术切口，且所有插管均在同侧操作比较方便。

2．插管：取220g左右雄性大鼠，用0.3%戊巴比妥钠溶液30mg/kg即1ml/100g ip麻醉。仰卧固定于手术台上，剪去颈部及右腹股沟部毛后用碘酊消毒手术部位皮肤。

（1）动、静脉插管：沿股动、静脉走向切开右大腿内侧皮肤，分离一段长约1.5cm的股动脉及静脉，分别将导管插入。股动脉导管推进约3cm，股静脉导管推进约2.5 cm，回抽注射器确定回血良好后结扎固定。再将两导管合并，在相距1cm的两处进行结扎，并分别用其结扎线缝于附近肌肉。全部固定好后，再次回抽注射器确认二导管回血良好。然后用肝素生理盐水把流入导管内的血推回血管内，用导管夹（将止血钳头部齿挫平套上适当的橡皮管制成）夹住导管末端，移去注射器，塞上不锈钢针。

（2）左心室插管：颈部腹侧偏右纵向切开皮肤。在胸锁乳突肌内侧分离右颈总动脉1.5cm，插入已准备好的左室导管，用丝线轻轻扎动脉壁于导管上，松紧度应以切口处不漏血，导管又能自由进出为度。左手用镊子夹住颈总动脉及导管，右手交导管插向左室腔，当感到导管随心脏搏动而明显抖动时，则应减慢插进速度（这时通常已插入4cm左右）。注意显示器上波形变化，波形由血压波变成下沿达0mmHg附近具有明显舒张期而峰顶平坦的波形时表明导管已通过主动脉瓣进入左室腔内，再送入导管约0.2~0.3cm，若还保持同样波形则固定导管于胸锁乳突肌上。将左室导管与换能器分离。若导管插入过深，管口碰上左室壁则出现底平方波或直线，应将导管退回少许。当显示器上出现主动脉波形但导管不能顺利通过主动脉瓣时，可快速抖动右手所持的导管，并稍向前插，往往可获成功。

（3）给药：手术完毕后稳定一段时间，描记正常心室内压曲线。根据药物特点选择合适的给药时间及给药量，描记心室内压曲线，观察曲线的变

化。

【结果】

比较给药前后左心室压力曲线的变化。

实验七镇痛药的镇痛作用

一、热板法

【目的】观察吗啡的镇痛作用【材料】

动物：昆明鼠，♀

仪器：恒温水浴1台，大烧杯1只，温度计1支，秒表1只，1ml注射器2支，

药物：0.1%盐酸吗啡，生理盐水

【方法】

取雌性小白鼠数只，测定每只鼠痛反应时间，挑选合格者2只供实验用。将恒温水浴加热并调节到55℃，其内放入大烧杯并固定之（或用热板），预热3分钟后将小白鼠投入烧杯底，立即记录投入时间。小鼠足部受热刺激产生痛反应，以小鼠舐后爪为痛反应指标，用秒表测定其痛反应时间。自小鼠投入烧杯底至舐后爪时间即为痛反应时间（痛阈），以秒计算。一旦出现舐后爪立即取出小鼠，以免烫伤。5分钟后再测一次，如两次痛反应时间均在10~30秒内者为合格鼠，取两次痛反应时间的平均值作为正常痛阈。不合格的鼠弃去不用。

取合格鼠2只，称重标记，甲、乙两鼠分别腹腔注射0.1%盐酸吗啡

0.1mg/10g及生理盐水0.1mg/10g。注射后15、30分钟各测一次痛反应时间，如60秒内无痛反应则取出，以60秒计算，算出两次痛反应时间的平均值。痛阈明显延长或痛阈提高百分率明显为药物镇痛作用的指征。

【结果】

鼠号体重药物正常痛阈给药后痛阈

1次 2次均值 15分 30分均值 % 甲 0.1%盐酸吗啡

0.1mg/10g 乙生理盐水

0.1mg/10g

给药后痛阈均值－给药后痛阈均值

痛阈提高百分率＝给药前痛阈均值

如上式中的分子为负数，则以零计算

×100%

【注意事项】

1、雄性小鼠阴囊易接触烧杯底或热板，影响实验结果的准确性。 2、计算正常痛阈和给药后痛阈拟统计全实验室结果。 3、室温以15~20℃为宜。

二、化学刺激法（扭体法）

【目的】观察镇痛药的镇痛作用【材料】

动物：昆明鼠（28~32g），雌雄兼用

仪器：秒表1只，大烧杯3只，1ml 注射器4支

药物：0.1%盐酸吗啡，生理盐水，0.6%醋酸溶液。

【方法】

化学物质刺激腹膜引起持久的痛反应。使小白鼠出现“扭体”反应，表现为腹部收缩内凹，后肢伸展，躯体扭曲，臀部抬高。取称重的小白鼠4只，随机分为二组，每组2只。甲、乙两组分别腹腔注射0.1%盐酸吗啡0.1mg/10g和生理盐水0.1mg/10g。注射后20分钟，各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，记录15分钟内各组中发生“扭体”反应的动物数，以不出现“扭体”反应为药物镇痛的指征。

【结果】

组别药物扭体反应无扭体反应镇痛鼠数鼠数百分率% 甲 0.1%盐酸吗啡

0.1mg/10g

乙生理盐水

0.1mg/10g

统计全实验室结果，计算各药镇痛百分率

实验组无扭体反应鼠数－对照组无扭体反应鼠数

药物镇痛%＝ ×100% 对照组无扭体反应鼠数

【注意事项】

1、醋酸需临用时配制 2、小鼠体重轻，“扭体”反应出现率低。 3、室温以20℃为宜。

实验八抗炎实验法一、鼠耳肿胀法

【目的】观察药物的抗炎作用【材料】

动物：昆明鼠，♂，22±2g

仪器：打孔器、精密天平药品：二甲苯、待测药物

【方法】

1、致炎剂配制：100%二甲苯

2、实验或对照药物溶解于致炎剂中，一般为0.03~1mg/ml。

3、在实验小鼠的右耳的前后两面涂布致炎剂（对照）或含有药物的致炎剂（实验组）。致炎剂的体积为0.02ml/只。左耳不作任何处理。

4、4h后，将动物麻醉处死，剪下双耳用9mm直径打孔器分别用同一部位打下圆耳片，称重。

5、每鼠右耳片重量减去左耳片重即为肿胀度。将对照组与给药组的肿胀程度进行统计学处理。

【结果】比较对照组与给药组肿胀程度的差异【注意事项】

1、涂致炎剂的部位应与取下的耳片相吻合。 2、打孔器应锋利，可选用由碳钢制的皮带冲。

二、大鼠足爪肿胀法

【目的】观察药物的抗炎作用【材料】

动物：SD大鼠，♂，130g~150 g 仪器：容积检测仪，软皮尺，注射器药物：角叉菜，待测药物

【方法】

1、致炎剂配制：1%角叉菜. 2、试验者将动物后肢拉直，用26号针头注射器先自足跖中部皮下向上注入1%角叉菜0.05ml，然后掉转针头向下注0.05ml。

3、分别于注入后5min、30min、1h、2h、4h、6h，按下列方法测定其肿胀程度，观察到达高峰时间和消退时间，比较给药组和对照组的差异情况。肿胀测量方法如下：

（1）周长或厚度测量法

实验时分别用特制软皮尺测量踝关节周长，或用千分尺测量肿胀肢体厚度。测量周长的软皮尺不能有弹性，刻度以1/5mm 左右为宜。测量部位尽量少变动，每次测量的宽紧度必须一致。测量动作要熟练，要由专人负责，尽可能减少误差。

(2) 容积测量法

是目前较为常用的足跖测量方法，目前多用容积检测仪检测。

【结果】列表比较给药组和对照组各指标的差异

实验九精神神经行为药理实验方法

一、氯丙嗪对小白鼠电刺激激怒的影响

【目的】观察]氯丙嗪对电刺激引起小白鼠激怒反应的影响。【材料】

动物：小白鼠4只（雄性）。

仪器：药理生理多用仪、动物活动盒、1ml 注射器、粗天平。药物：0.075％氯丙嗪溶液、生理盐水。

【方法】

1、把药理生理多用仪“刺激方式”旋纽拨到“连续B”档上，把后面板开关拨到“电惊厥”处。将导线插入后面板两芯插座内，此导线与动物盒相连。将“时间”扭拨到1秒，“频率”拨到8Hz。

2、取异笼饲养小鼠4只，称重，标记，每次取一对放在动物活动盒内。接通多用仪电源并打开电源开关，然后调节后面板上“惊厥”右下方电位器。电压由低到高，以小白鼠出现激怒反应（小鼠竖立，两前肢离地，对峙，互相撕咬）为止。此电压即为该鼠出现激怒反应所需的阈电压。

3、一对鼠腹腔注射0.075％氯丙嗪7.5mg/kg，另一对给予等量的生理盐水作为对照。给药后20分钟分别用给药前阈电压刺激。观察两对小鼠给药前、后反应有何不同。

【结果】鼠号体重药物阈值电压（V）激怒反应

（克）用药前用药后

1 氯丙嗪

2 氯丙嗪 3 NS 4 NS 【注意事项】

1、挑选异笼饲养雄性小白鼠，以30克左右为宜。

2、刺激电压从低到高，过低不引起激怒，过高会使小白鼠逃避，激怒反应不典型。

3、应随时清除导电铜丝板上的大小便，以免影响导电。

二、药物的抗惊厥作用（电刺激致惊厥法）

【目的】观察药物的抗惊厥作用。【材料】

动物：小白鼠2只。

仪器：药理生理多用仪、小白鼠笼。1ml注射器2只、天平。药品：0.5％苯巴比妥钠溶液、生理盐水。

【方法】

取小白鼠2只，分别称重并编号。将多用仪“刺激方式”扭旋到“单次”的位置上，“频率”扭拨到4Hz。再用导线由后面板两芯插座引出交流电压，把后面板上的开关拨向“电惊厥”一边，并将输出的导线前端两鳄鱼夹的两端用生理盐水浸润。一只鳄鱼夹夹在小白鼠两耳间的皮肤上，另一只夹在下颌的皮肤上，也可直接夹小鼠两耳。接通多用仪的电源导线，打开电源开关，按“启动”按钮，即可使小白鼠产生惊厥（电压强度从80V开始，如未产生惊厥，可把电压提高到90～100V），如仍不出现惊厥，可将“频率”扭由4Hz改为2Hz或1Hz，（如再无效，则将该鼠弃之另换）。

观察小白鼠的惊厥过程：潜伏期→强直期→阵挛期→恢复期。以后肢强直作为惊厥指标。然后甲鼠腹腔注射0.5％苯巴比妥钠溶液0.1ml/10g(50mg/kg),乙鼠给以生理盐水（同容积同途径）作为对照。30分钟后，以药前同样参数进行刺激，观察两鼠的反应有何不同。

【结果】动物号体重药物与剂量通电参数惊厥反应（克）用药前用药后

甲乙

【注意事项】

通电参数由于动物个体差异而有所不同。电压以能引起惊厥为宜，不宜过大。

三、抗疲劳实验

（一）小鼠游泳实验

【目的】观察药物对小鼠游泳时间长短的影响，评价药物的抗疲劳作用。【材料】

动物：成年雄性小鼠4只。

仪器：游泳箱（大小约50cm×50cm×40cm）、电子天平、铅皮、1ml注射器。

药品：待测药物、生理盐水

【方法】

取小鼠4只，随机分为对照组和给药组，给药组腹腔注射待测药物，另一组给予等量的生理盐水作为对照。给药后30分钟，置小鼠在游泳箱里游泳，水深不超过30cm，水温保持恒定，常用25-30℃。鼠尾根部负荷5％体重的铅皮，用秒表计算鼻孔沉下水面（超过5秒钟）所需的时间，为小鼠游泳时间。观察两组游泳时间有无差异。

【结果】鼠号体重药物游泳时间（分）

（克）

【注意事项】

1、水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，以25℃为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果。

2、铅皮缠绕松紧应适宜。

3、观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动，如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。

4、受试动物应采用同一批动物进行，避免因饲养环境、年龄、大小等原因所造成的差异。

（二）棒式疲劳仪实验

【目的】观察药物对于小鼠在转棒式疲劳仪上剧烈运动时间长短的影

响，评价药物的抗疲劳作用。

【材料】

动物：成年雄性小鼠4只。

仪器：XZC－4B转棒式疲劳仪、天平、1ml注射器。药品：待测药物、生理盐水

【方法】

取小鼠4只，随机分为对照组和给药组，给药组腹腔注射待测药物，另一组给予等量的生理盐水作为对照。给药后30分钟，置小鼠于转棒式疲劳仪上，调整传送带位置，挂到24转/分，按动转动按钮，转棒转动，提小鼠尾将小鼠放到转棒上按下清零按钮，清零后开始记数（显示圈数）。并插上前挡板。当小鼠跌落下来后压动下踏板，记数器被锁住，此时显示的数字就是停留在转棒上的圈数，计算小鼠在转棒上停留的时间（分）＝记数显示值/每分钟转数。比较二组时间上有无差异。一批实验结束后将鼠拿出，并将踏板托起以备下批使用。

【结果】鼠号体重药物停留时间（分）

（克）

【注意事项】

1、用小鼠实验时应提前进行筛选和训练，应选用在棒上爬动3分钟而不落下的小鼠进行实验，小鼠实验前的学习和适应对实验至关重要。

2、不可强行转轴转动，需要更换转速时请先按停止按钮，待停止后更换皮带位置。

3、受试动物应采用同一批动物进行，避免因饲养环境、年龄、大小等原因所造成的差异。

四、迷宫趋食实验

【目的】动物饥饿时，趋食反应较强，通过复杂迷宫游走后取得食物，

获得记忆。本实验观察待测药物对于这种记忆力的保护作用。

【材料】

动物：成年雄性小鼠2只。

仪器：复杂迷宫装置、天平、1ml注射器。药品：待测药物、生理盐水

【方法】

取禁食12小时的小鼠2只进行训练。在迷宫中心小室放置食饵。通过训练，使小鼠记忆取食的截近。以小鼠从迷宫起点到中心室所需时间和通入盲道的错误次数为指标。记录小鼠取得食物的时间及错误次数。然后甲鼠腹腔注射待测药物,乙鼠给以生理盐水（同容积同途径）作为对照。30分钟后，以药前同样条件放入迷宫，观察两鼠取得食物的时间及错误次数有何不同。

【结果】鼠号体重药物与剂量时间(分) 错误次数

（克）用药前用药后用药前用药后

【注意事项】

1、实验时必须保持环境安静，室内光线不宜过强，要保持稳定，室温在25℃为宜。

2、实验动物实验时应提前进行筛选和训练，禁食时间应一致，否则影响实验结果。

五、镇咳祛痰平喘实验

（一）药物的平喘作用

【目的】1. 观察组织胺的致喘作用。

2.了解氨茶碱的平喘作用。

【材料】

动物：豚鼠，250g左右。

仪器：透明喷雾室一个、喷雾器一个、人工呼吸机一台、1ml注射器两副。

药品：0.1%磷酸组织胺、2%氯化乙酰胆碱、2.5%氨茶碱。

【方法】

取体重250g左右的豚鼠两只，甲鼠腹腔注射2.5%氨茶碱0.6ml/100g，乙鼠腹腔注射等量生理盐水。将两鼠放入喷雾室内，观察其活动情况及呼吸快慢。注射后20 分钟，用喷雾器将2%氯化乙酰胆碱10ml 和0.1%磷酸组织胺5ml 的混合液，喷入喷雾室。观察两鼠一般活动及呼吸情况有何改变。记录两只豚鼠从致喘至倒下这段时间的长短，以证实药物的拮抗作用（停止喷雾后应连续观察5分钟，如5 分钟内不出现上述现象，则表示药物有保护）

【结果】

一般情况

鼠号体重药物倒下时间

喷雾前喷雾后

甲 2.5%氨茶碱

乙生理盐水

（二）可待因的镇咳作用

【目的】1. 学习用浓氨水引咳的方法；

2. 观察可待因的镇咳作用；

3. 学习量反应资料的显著性检验（t-test）。

【材料】

动物：昆明种小白鼠，体重18-22g，♀♂兼用仪器：鼠笼、天平、灌胃器、棉球、大烧杯

药品：0.3％磷酸可待因，0.9％生理盐水，浓氨水

【方法】

1. 每组取8只小鼠，称重，标记，随机分两组；

2. 给药：实验组i.g. 可待因0.2ml／l0g，对照组i.g. 生理盐水0.2ml／l0g，每只小鼠给药间隔4min左右；

3. 给药后30分钟将小鼠扣入500ml烧杯中，再将注入0.2ml浓氨水的棉球迅速放入烧杯中，立即记录小鼠的咳嗽潜伏期和2分钟内的咳嗽次数。

【结果】

全室结果汇总，做咳嗽次数的t-test。

本实验指标为咳嗽次数，是具体的数值，属量反应资料，应用t-test来进行统计学分析。

t-test的步骤： 1、建立假设；

2、计算t值（公式见讲义P73）； 3、确定自由度，查t值表； 4、判断结果

【注意事项】

1、磷酸可待因为混悬液，应混匀后再i.g.，以保证给药均匀。

2、8个棉球的大小、松紧程度要适中，尽量一致； 3、潜伏期即把棉球放入后至第一次咳嗽的时间；

4、小鼠咳嗽很难听到声音，因此应注意观察，表现为剧烈腹肌收缩并张嘴。

（三）祛痰药物实验法

【目的】 1.掌握小鼠酚红排泄法测量呼吸道液分泌量。 2.了解药物的祛痰作用。【材料】

动物：小鼠，20g左右。

仪器：小鼠手术器械一套、紫外分光光度计、2ml试管、1ml注射器两副。

药品：2.5%酚红生理盐水溶液、生理盐水、5％NaHCO3、待测药物。

【方法】

1. 2.5%酚红生理盐水溶液的配制：称取一定量的苯酚红放入研钵中逐渐加生理盐水研磨后，溶于生理盐水中。

2．小鼠饥饿16h过夜，给受试药物30min后脱颈处死小鼠，暴露气管，气管插管并与注射器相连，用5％NaHCO3溶液1ml，缓慢注入气管内，然后轻轻吸出，在用5％NaHCO3溶液1ml同上冲洗，如此反复三次，合并3次冲洗液放置一定时间使杂质沉淀，得到透明红色上清液，用545nm分光光度计比色，根据酚红的标准曲线计算出酚红的排泄量。（注意：气道内注入溶液后吸出时要轻轻的进行，一旦用力过度，肺泡会破裂流入胸腔）

【结果】计算酚红排泄量

（四）尼可刹米对抗吗啡抑制呼吸的作用

【目的】掌握尼可刹米对抗吗啡抑制呼吸的作用

【材料】

动物：家兔1只(1.5㎏以上)

仪器：兔固定箱、婴儿秤、兔口罩、橡皮管、呼吸容量管、换气瓶、双向T形管、2ml注射器、铁支架、双凹夹、胶布

药品：1％的吗啡溶液、2.5％的尼可刹米溶液

【方法】

取家兔1只，称重，置于兔固定盒内，将连有橡皮管的口罩照住其鼻部，通过橡皮管与换气瓶上的双向T型管相连，另一端与呼吸容量瓶相连，呼吸容量瓶倒置于盛有浅红色水的面盆中。由兔耳缘静脉缓慢注射1％吗啡溶液0.5～1ml/kg（50-100mg/kg），待呼吸抑制明先后，再由耳缘静脉注射2.5％尼可刹米溶液2ml/kg(50mg/kg)，再观察上述指标的变化。

【结果】动体重记录项目正常状态给吗啡后给尼可刹米后物（g）

呼吸曲线

呼吸频率（次／min）

【注意事项】

1.先测15秒钟呼吸容量瓶中上升的气泡数（呼吸频率）及排水量（呼

吸深度），连续3次，取平均值。

2.吗啡注射速度应缓慢，以控制其出现潮式呼吸为止。如上述剂量不足时可适当增加。

3.尼可刹米注射不宜过快，否则易引起惊厥。

实验十

茶碱体内动力学参数的测定

（血药浓度法）

【目的】1．通过测定茶碱体内动力学参数，掌握血药浓度数据法。

2．通过药物口服吸收实验，掌握计算茶碱在家兔体内的K、

ka、tmax、Cmax等参数的方法。

【基本概念和实验原理】

当药物按表观一级吸收过程进入体内，又按一级过程消除，且在体内按单室模型分布时，下述微分方程式成立：

dX/dt= ka Xa-KX (1)

式中：X——血管外给药后时间的体内药量；

K——药物的表观一级消除常数； ka——表观一级吸收速度常数； Xa——吸收部位的药量。对该方程求解并写成浓度表达式有：

－－

C=〔kaFX0/V( ka－K)〕(eKt－eKa t ) (2) 式中:C——任意时间血浓度；

X0——给药剂量； F——吸收分数；

V——表观分布容积。

－

对于大多数药物，一般有ka＞K，于是，当t比较大时，ekt 将趋于零，

－

式（2）简化为： C=〔kaFX0/V( ka－K)〕ekt （3）

用常用对数表达为：

㏒C=－Kt/2.303+㏒〔kaFX0/V( ka－K)〕 (4)

该式表明对数血药浓度—时间曲线的吸收后相为一直线。从㏒C—t图形上的直线斜率咳求算消除速度常数K和消除半衰期t1/2表：

K=－2.303×b (5) t1/2=0.693/K (6)

吸收速度常数ka则可以用残数法求算，将式（2）移项得：

－－

〔kaFX0/V( ka－K)〕ekt－C=〔kaFX0/V( ka－K)〕eka t （7）

－

令〔kaFX0/V( ka－K)〕eK t =C/ （8）

－

则有 C/－C=〔kaFX0/V( ka－K)〕eKa t （9）

两边取对数得：㏒（C/－C）=－ka t/2.303+㏒〔kaFX0/V( ka－K)〕 (10) 将实验中对数血药浓度—时间曲线的尾段直线外推至纵轴，则吸收期中各时间在该直线上相应的浓度即为C/，C即为对应时间的实测血药浓度值，故用各个㏒（C/－C）值对t作图时，即得第二条直线，称为残数线，其斜率为－ka /2.303，由此求出ka值。

将式（2）中的t从0→积分，即得血药浓度—时间曲线下的面积：

AUC=〔kaFX0/V( ka－K)〕〔1/K—1/ka〕（11）

式中：kaFX0/V( ka－K) 即为吸收后相直线或残数线截距的反对数。

血药浓度峰值（Cmax）的到达时间即峰时（tmax）分别是：

tmax =（㏑ka—㏑k）/（ka—K）（12）

－

Cmax =（ FX0/V）ek tmax (13)

－

或Cmax =截距的反对数×〔(ka－K)/ ka〕eK tmax (14)

【材料】

动物：家兔器材：

方法①紫外分光光度计，旋涡混合机，离心机，带塞离心管（5ml,10ml）

细量管0.25ml,0.5ml,1ml,5ml）,滴管，家兔固定木盒，红外灯，注射器（5ml）灌胃器，刀片，棉球，搪瓷盘，试管架等。

方法②Lincrospher-C18柱（江苏淮阴）,预柱C18 ；流动相：甲醇∶水=32∶68；流速=1.0ml/min;检测波长275nm.

药品：

方法①茶碱溶液（4mg/ml）,0.1mol/LHCL,氯仿—异丙醇(9.5:0.5);0.1mol/LNaOH,75%乙醇等。

方法②茶碱标准溶液：（1.omg/ml;0.10mg/ml;0.01mg/ml, 0.001 mg/ml）, 咖啡因内标液：（1.048mg/ml,01102401）等。

【方法】

1、标准曲线制备

方法①配制25g/ml浓度的茶碱贮备液，分别吸取适量，并加蒸馏水稀释至1.0ml，是标准系列浓度为0、0.5、2、4、6、8、12、16和25g/ml ，各加入兔血清0.5ml、0.1mol/L盐酸0.2ml于旋涡混合器上混匀后，再各加氯仿—异丙醇(9.5:0.5)混合液5.0ml，密塞，混匀2分钟，2500rpm离心20分钟。精密吸取下层液4.0ml，加等量的0.1mol/LNaOH溶液，混匀2分钟，2000rpm离心10分钟。取上清液在紫外分光光度计上于波长274nm及298nm处测定吸收值，以两波长吸收值的差值对浓度计算标准曲线方程。

方法② 取标准血浆0.5ml于1、2、3、4、5号离心管中，分别加入茶碱标准储备液（0.1mg/ml）使浓度依次为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0µg/µl，然后加入内标物咖啡因储备液（1.0mg/ml）20µl。各加7%高氯酸0.5ml涡旋混合1min,离心10min(3500转/分钟)取上清液20µl。

2、实验方法

1）将实验前禁食一夜的家兔（2.5kg左右）取空白血1.5ml，然后用 37℃ 左右的茶碱溶液（20ml/kg）灌胃。

2）给药后0.5、1、2、4、6小时取耳静脉血1.5ml，共5份样品。 3）将血样以2500rpm离心20分钟后，转移血清至另一试管中，各吸取血清样品0.5ml，加蒸馏水1.0ml，混匀，以下同标准曲线绘制项“加0.1mol/LHCL0.2ml……”方法操作。

3、数据处理

将测得的吸收值数据记录入下表并计算血药浓度C和C、C-CDENG1。再根据实验原理中各公式及残数法求K、ka、t1/2、AUC、tmax、Cmax。

【结果】

编号检索号 A标/A内浓度（µg/ml） Ⅰ Ⅱ

Ⅲ Ⅳ Ⅴ

实验十一生物利用度测定

【目的】观察肌肉注射磺胺嘧啶钠后的生物利用度【材料】

动物：兔

器材：注射器1ml、5ml各一付,5号、6号针头，磅秤、剪刀、棉花，试管10只，试管架，吸管2ml、1ml，离心机，天平，紫外分光光度计，兔盒.

药物：20%磺胺嘧啶钠溶液，5%三氯醋酸溶液，0.5%亚钠溶液（新鲜配制），0.5%麝香草酚溶液（以20%氢氧化钠溶液配制）。

【原理】

肌肉注射磺胺嘧啶钠溶液后，即被吸收入血液，而含磺胺类药物的标本（含游离的NH2），在酸性溶液中与亚钠起偶氮化反应，产生偶氮化物，此物在碱性溶液中可与麝香草酚起作用，使溶液呈橙红色，颜色深浅与其中之磺胺类药含量成正比。

【方法】

1、取血及分离血浆：

取兔一只，称体重，固定。先自耳缘静脉放血1.5-2ml于含草酸钾（或肝素）之离心管中，作为空白对照。

肌肉注射磺胺嘧啶钠溶液0.5g/kg（2.5ml/kg）,将所需注射药量，平分地注射于两侧臀部肌肉中，记下注射给药的时间，分别于用药后5-10分钟、60分钟、90分钟、120分钟，自耳静脉放血1.5-2ml，分别置于含草酸钾的离心管中.将离心管编号，平衡后，置离心机中，3000转/分离心5-10分钟，分离血浆。

2、自血浆中提取药物：吸取各标本血浆0.2ml置于另一排已编好相应号码的离心管中，再分别加入5%三氯醋酸5.8ml（加时吸管不得于血浆接触，以免蛋白质凝固阻塞吸管），充分摇匀后，放置5分钟，平衡后离心（1500转/分）5分钟，取上清液按下述步骤测定血中磺胺类药物浓度。

3、显色及比色：取上述各管上清液1.5ml 置于另一排中试管内，再加5%三氯醋酸溶液3.0 ml ，依次加入0.5%亚钠溶液0.5ml ，0.5% 麝香

草酚溶液1ml（每加入一试剂必需充分摇匀，加入试剂次序不得颠倒，否则影响比色结果），摇匀后静置10分钟即显橙红色。用紫外分光光度计记录各标本之光密度。按光密度自标准曲线上查得各管中的磺胺嘧啶的浓度（ mg% ）×4（因上清液在显色过程中被稀释了4倍）即为不同时间兔血浆中磺胺嘧啶浓度。

4、绘制曲线：

以血浆中磺胺嘧啶浓度为纵座标，采血时间为横座标，在座标纸上绘制血药浓度与时间曲线。

5、计算生物利用度：用公式或软件计算曲线下面积（AUCi.m），利用已知的磺胺嘧啶钠静脉注射的曲线下面积（AUCi.v），根据下式计算磺胺嘧啶钠的相对生物利用度：

F = AUCi.m / AUCi.v × 100% 6、标准曲线的制备：于一系列试管中，分别加入100mg%、80mg%、60mg%、40mg%、20mg%、10mg%、5mg%的磺胺嘧啶钠溶液0.2ml，再分别加入5%三氯醋酸溶液4.3ml，摇匀，再依次加入0.5% 亚钠溶液0.5ml,0.5%麝香草酚溶液1ml，摇匀后静置10分钟，以紫外分光光度计比色，记录各管的光密度。以光密度为纵座标，磺胺嘧啶浓度（mg% ）为横座标，于座标纸上绘一标准曲线。

【注意事项】

1、采取血标本在本实验中至关重要。血标本加入含抗凝剂的试管内，边加边稍摇动试管，使血液与抗凝剂充分混匀，但不可剧烈摇动试管，以免溶血。

2、为避免溶血，盛血试管必需干燥，离心时转速也不可太高。

3、三氯醋酸沉淀蛋白质要完全，以离心后上清液澄清为适当，否则影响比色结果。

第四章实验设计的基本知识

第一节实验设计的基本原理和方法

一．实验设计的基本程序

实验设计是通过学生自行设计实验去了解科学研究的基本过程，其主要功能是训练学生的实验研究能力。它对加深理解课堂讲授的已知规律和应用已知规律去探讨研究未知世界有重要作用。因此指导学生完成一个好的实验设计对培养研究型、创造型人才有重要的意义。

实验研究基本程序大致包括立题、实验设计、实验和观察、实验结果处理和分析及得出研究结论。（一）立题

立题是确定所要研究的课题，是研究设计的前提，决定研究方向和内容。立题的过程是创造性的思维过程，它包括选题和建立假说。

1．选题

一个好的选题应该具有目的性、创新性、科学性及可行性。目的性是指选题应明确、具体地提出要解决的问题，必须具有明确的理论或实际意义。选题越具体明确，说明选题者的思维越清楚。创新性是指发现新的规律和现象，提出新见解、新技术、新方法和新理论，或是对原有的规律、技术或方法进行修改完善。科学性是指选题应有充分的科学依据，要与已证实的科学理论和科学规律相符合。一个好的选题必须符合自然科学的基本原理，不应脱离科学规律作无根据的胡思乱想。可行性是指选题应考虑研究者的技术水平和所在实验室客观条件，去选择力所能及的课题。要综合考虑研究者的学术水平、技术水平和实验室条件及研究基础，盲目地求大、求全和求新最终只能纸上谈兵，无从下手。

因此，选题过程中要查阅大量的文献资料和实验资料并进行分析研究，了解前人和别人对有有关课题已做的工作、取得的成果和尚未解决的问题。只有充分了解最新的研究进展和动向，在进行综合分析的基础上，找出研究

课题的关键，从而建立假说及确定研究课题。

2．假说的建立

假说是预先假定的答案或解释，也是实验研究的预期结果。科学的假说是关于事物现象的原因、性质或规律的推测，其建立需要运用对立统一的观点进行类比、归纳及演绎等一系列逻辑推理过程。

一旦课题选定后，就要建立这个课题的假说，假说是课题研究重要的思想理论准备，是实验设计的前提和依据，在假说的指导下，实验设计就更具有目的性、计划性和预见性，就可全方位的周密、细致地安排实验设计的各个方面。假说是实验设计中最重要的环节之一。

假说是未经实践证明的理论，理论则是经过实践证明的假说。建立科学的假说，一要详细的占有材料，集古今中外的资料和论点、本人先前的实践和认识。不但要掌握该课题的国内外研究动态和趋势，而且要广泛涉猎有关理论认识。二要积极进行思维活动，即进行逻辑思维、辩证思维和创造性思维活动。活跃的思维活动不但选题时需要，建立假说时更需要。通过积极的思维活动要使问题从“模糊”到“清晰”、从“片面”到“全面”，从非逻辑性到逻辑性。三要把积极的思维活动和活跃的实践活动结合起来。假说形成是一个过程，有一个理论想法后可先做一些探索试验来帮助研究者进一步思索，这样可形成“原始假说”。有了原始假说，就可在它的指导下进行预试验的实验设计。通过预试验，对原始假说作非正式的验证，以便对原始假说作必要的修订或改进，以使其上升为工作假说。最终，在工作假说的指导下进行正式实验设计。（二）实验设计

实验设计是指实验研究计划和方案的制定。实验设计必须根据研究目的，结合专业和统计学的要求，做出周密具体的研究内容、方法和计划，它是实验过程的依据和数据处理的前提，也是提高实验研究质量的保证。

实验设计的任务是有效地控制干扰因素，保证实验数据的可靠性和准确性；节省人力、物力和时间；尽量安排多因素、多剂量、多指标的实验，以提高实验效率。实验设计包括实验材料和对象、实验的例数和分组、技术路线和观察指标、数据的收集和处理方法等。（三）实验和观察 1．实验准备

包括实验理论准备和实验实施准备。前者主要包括实验的理论基础、假说的理论基础、实验方法和技术、参考文献等的准备；后者指仪器设备、药物和试剂的准备和药物剂量的选定、实验方法与指标的建立、实验对象的准备等。

2．实验操作及其结果的观察记录

1）按照预备实验确定的步骤进行实验。

2）熟练掌握实验方法，用药量准确，认真操作。

3）经分析属于错误操作或不合理的结果应重新实验。

4）仔细、耐心地观察实验过程中出现的结果。发生了什么现象、发生时间和转归，发生这些现象的机制及其意义。有无出现非预期结果，在排除了错误的不合理的结果后，应对其进行分析，是否有新的发现和得出新理论。

5）要重视原始记录，预先拟定原始记录方式和内容。记录的方式有文字、数字、图形、照片、表格和录像等。原始记录应及时、完整、准确和整洁。严禁撕页或涂改，不能用整理后的记录代替原始记录，要保持记录的原始性和真实性。通常实验记录的项目和内容：

（1）实验名称、实验日期、实验者。

（2）受试对象：动物种类、品系、性别、体重、健康状况、饲料及离体组织器官名称等。

（3）实验药物或试剂：名称、来源、剂型、批号、规格、含量或浓度，给药的剂量、时间及疗程等。

（4）实验仪器：主要仪器名称、生产厂家、型号、规格等。（5）实验条件：实验室的室温、饲养环境等。

（6）实验方法和步骤：动物固定、麻醉、分组、手术方法、施加的刺激强度、给药方法、测定方法等。

（7）实验指标：指标的单位、数据及不同时间的变化等。（8）数据处理：对实验结果进行整理的统计分析。（四）实验结果的处理

将原始数据或资料整理，计算出各组数据的均值和标准差等，并制成一定的统计表或统计图。其次，做统计学显著性检验等。在分析和判断实验结果时，决不能带有研究者的偏见，对数据任意取舍。必须实事求是，不能强求实验结果服从自己的假说，而应该根据实验结果去修正提出的假说，使假说上升为理论。（五）研究结论

科学研究经过实验设计、实验和观察、数据处理后，就可做出研究总结、得出结论及写出论文。这个结论要回答原先建立的假说是否正确，从而对所提出的问题做出解答。研究结论是从实验结果中概括或归纳出来的判断，要严谨、精练和准确。

二、实验设计的三大要素

实验设计包括三个基本要素，即受试对象，处理因素，观察指标。（一）受试对象

受试对象(study subjects)包括动物和人。

1．实验动物

随着科学技术的发展，无损伤技术、遥控技术和微量技术等现代化检测技术使某些实验直接在人体上进行的可能性越来越大，但基于人道和安全等原因，往往用动物作为实验对象。

（1）动物实验的道德准则

1）凡使用实验动物的实验室应配备相应的专职或兼技术人员负责实验动物的管工作。工作人员应接受专业培训，自觉遵守实验动物管理的各项制度，熟悉、掌握操作规程。

2）为了增进实验动物的敏感性、准确性和实验结果的可重复性，医学实验必须使用合格动物并使之逐步达到标准化。拒绝已经死亡或患传染病的动物进实验室。

3）应当在麻醉下进行动物外科操作，严禁在不使用麻醉剂下使用肌肉松弛剂进行实验。

4）必须爱护实验动物，不得戏弄或虐待。对处死后的动物或动物的器官组织应按照实验室规定做适当处理，不可随便乱抛乱弃。（2）实验动物的选择

选择合的实验动物对实验的成功有重要的意义，选择的条件如下： 1）要选择生物学特征接近人类而又经济易得的动物。灵长类动物最接近人类，但价格昂贵，但有时实验需用大动物完成，可选用犬、羊、猴。一般常选用的动物为家兔、大鼠、小鼠，它们比较接近于人类而价格又比较便宜。

2）根据实验要求选择动物的品种和纯度。其中以纯种动物为佳，且应健康和营养良好的动物。

3）动物年龄、体重、性别最好一致。一般选择发育成熟的年幼动物，对性别要求不高的动物可雌雄混用，但分组时应雌雄搭配。与性别有关的实验，只能用某种性别的动物。

常用实验动物有：

1）小鼠：繁殖力强，价廉，易于饲养，广泛用于需要大量动物的实验。如药物筛选实验、急性毒性实验；镇痛、抗感染、抗肿瘤、避孕实验；生物制品和遗传性疾病研究等。

2）大鼠：在医学研究中，用量仅次于小鼠，如心血管系统、神经系统、内分泌系统及长期毒性实验、致畸实验；免疫学、关节炎实验、肿瘤学研究等。

3）蛙：用于神经肌肉系统和心血管系统实验等。 4）豚鼠：用于过敏、抗感染实验等。

5）兔：用于心血管实验、离体耳实验、发热实验、生殖生理研究等。 6）猫：用于神经系统实验、呕吐实验等。

7）猪：用于烧伤实验、肿瘤实验、心血管系统实验、泌尿系统实验等。 8）犬：用于神经系统、心血管系统、消化系统和毒性实验及外科实验等。

同一药物对不同动物的同一器官系统的效应可以不同，如吗啡对人、猴、犬、兔的中枢神经系统产生抑制效应，而对虎、猫、小鼠的中枢神经系统则

引起兴奋。

2. 人

人体实验，是以人体为对象，采取实验手段，有效地对人体进行观察和研究的行为过程。人体实验是医学发展到实验医学后遇到的新课题，常常涉及到道德和法律问题。1946年，《赫尔辛基宣言》问世，规定了人体实验的道德原则。主要有以下四条：（1）医学目的原则

人体实验的目的必须与医学的目的相一致，通过人体实验研究疾病发生的原因和发病机理，提高预防和诊疗技术水平，从而更好地为人类的健康利益服务，任何以医学科研为名而进行的离开医学目的的人体实验，都是不道德的，是不允许的。要保证人体实验的严肃性和科学性，实验前要进行论证，并经过上级有关部门批准后才能实施。

（2）维护受试者利益原则人体实验必须以维护受试者利益为前提和出发点，其内容包括：1）实验前要反复权衡利弊，充分估计实验中可能发生的问题和困难并制定有关措施。必须先经过动物实验获取无危害的符合科学的良好效果后再做人体实验，不能只顾医学科研而牺牲病人的根本利益。2）在实验过程中要有充分的安全措施，以保证受试者身心受到的不良影响减少到最低限度；实验中一旦出现严重意外要立即终止实验。3）实验必须具有相当学术水平的医学科研工作者和丰富经验的实验室人员共同参与或在其指导、监督下进行。

（3）知情同意原则知情同意原则，包括知情和同意两个方面。受试者及其家属在实验前有权了解实验的目的、方法、预期好处和潜在危险，在知情以后表示同意接受人体实验并履行承诺手续，才能实施人体实验。受试者随时都有权撤消其承诺。任何采取欺骗性、强迫性或半强迫性手段而实施的人体实验，或利用经济诱惑而取得“同意”的做法，都是违背医学科研道德的，因此是应当绝对禁止的。

4．实验对照原理为保证实验结果的客观性，人体实验必须正确设置对照组，并注意对照组和实验组的齐同性和可比性，一般采用随机化分组的方法。实验对照组的操作方法主要是安慰剂和双盲剂，二者相互交联，必须严格在不损害受试者利益的范围之内。（二）处理因素

处理因素(study factor)是指对实验对象施加的某种外部干预。处理因素可以是物理因素，如电刺激、温度、射线、外伤、手术等；可以是化学因素，如药物、毒物、营养物、缺氧等，也可以是生物因素，如细菌、病毒、真菌等。处理实验对象的目的有两个，一是复制人类疾病的动物模型，观察其发病机制；二是进行实验治疗，观察药物或其他治疗手段的疗效。

1．确定主要处理因素

根据所提出假设的目的和可能性，实验主要处理因素可确定为单因素或

多因素。一次实验的处理因素不宜过多，否则会分组过多，受试对象增多，实验时难以控制。而处理因素过少又难以提高实验广度、深度和效率。

2．确定因素的强度

处理因素的强度是因素的量的大小，如电刺激强度、药物剂量等。处理的强度适当，同一因素有时可以设置几个不同的强度，如一种药设几个剂量（处理因素的水平也不要过多）。

3．处理因素的标准化

处理因素在整个实验过程中应保持不变，否则会影响实验结果的评价。例如电刺激的强度（电压或电流、持续时间、频率等）、药物的质量（来源、纯度、生产厂家、批号、配制方法等）应一致。

4．重视非处理因素

非处理因素（干扰因素）可能会影响实验结果，应加以控制，如动物的年龄、性别、饲养环境，离体实验时的恒温或灌流条件等。（三）观察指标

观察指标是反映实验对象在经过处理前后发生生理或病理变化及药物效应的客观指标，是可被仪器检测或研究者感知的特征或现象。实验指标选择的基本原则如下：

1．特异性指标应能特异性地反映某一特定的现象而不至于与其他现象相混淆。如研究心律失常和心肌缺血应用心电图做指标。研究心功能不全，以室内压变化和心输出量作为指标比用心电图做指标好。特异性低的指标容易造成“假阳性”。

2．客观性应避免受主观因素干扰造成误差。尽可能选用具体数字或图形表示客观指标，如心电图、脑电图、血压、心率、室内压、血液生化指标等。而用疼痛、饥饿、疲倦、全身不适、咳嗽等症状和研究者目测等主观指标则较差。

3．灵敏度指处理因素引起某种变化的灵敏程度，灵敏高的指标能使微小效应显示出来。灵敏度低的指标可使本应出现的变化不出现，造成“假阴性”。

4．精确度精确度包括精密度和准确度。精密度指重复观察时观察值与其均值的接近程度，其差值属随机误差。准确度指观察值与其真实值的接近程度，主要受系统误差的影响。实验指标要求既精密又准确。

5．重现性指在相同条件下所测指标的结果可以重现。重现性高的指标一般意味着误差小，能较真实地反映实际情况。为提高重现性，需注意仪器的稳定性，减少操作误差，控制实验动物的机能状态和实验条件。

6．可行性指研究者的技术水平和实验室的设备条件能够完成本实验指标测定。

7．认可性指现成指标必须有文献依据，自己创立的指标必须经过专门的实验鉴定，方被认可。

实验资料可以分为计量资料（graded response，量反应）和计数资料(all-or-none response，质反应)。有连续量变的资料为计量资料(measurement data)，如血压、尿量、检验值、收缩力、身高、体重、体温等。计量实验效率较高，实验要求的例数可较少，其统计主要为均数和标准差，常用t检验或F检验。

只有出现与否（全或无，阳性或阴性）的资料为计数资料(enumeration data)，如有效或无效、死与活等，其实验效率较低，要求的例数较多，其统计描述主要为率，统计检验主要为X2检验。另一为等级资料，如病理改变的程度一、+、++、+++、++++（“-”为正常，“++++”为病变最严重）；也有人把药物的疗效分为-（无效）、+（显效）、++（有效）、+++（治愈），等级资料一般可归入计数资料。计数资料的“数”也是一种量表达，计数资料不意味着是定性研究的资料。

三、实验设计的三大原则

实验设计三大原则是对照、随机、重复。这些原则是为了避免和减少实验误并及取得实验可靠结论所必须和始终遵循的。（一）对照原则

要比较就要有对照（control），以确定处理因素对实验指标的影响，如无对照就不可能说明问题。实验分组可分为处理组和对照组。对照原则要求处理组和对照组除处理因素以外，其他可能影响实验的因素应力求一致。对有自然痊愈倾向的疾病研究尤其要有对照，心理因素影响药物疗效时也必须有对照。对照形式有：

1．空白对照

空白对照指不对受试对象做任何处理。严格地说，这种对照组与处理组缺乏“齐同”，如处理因素是给药，除用药外，有给药操作如注射的差异，因此，这种对照通常少用。

2．假处理对照

经过同样的麻醉、注射、甚至进行假手术，但不用药或不进行关键的处理。假处理所用的液体PH、渗透压、溶媒等均与处理组相同，因而可比性好。在做药物实验时，常将动物做成一定的病理模型，然后才用药，不用药的做模型组，这对于评价药物的作用是必需的。

3．安慰剂对照

安慰剂是一种在形状、颜色、气味等方面均与药物相同而不含主药的制剂。安慰剂通过心理因素对病人产生“药效”，对某些疾病如头痛、神经官能症等可以产生30%～50%的疗效。安慰剂也可产生“不良反应”，如嗜睡、乏力、头晕等。在新药研究中，应尽量采用双盲法，即病人及医务人员均不能分辨治疗药品和对照品（安慰剂），以确定其真实疗效。安慰剂在新药临床研究双盲对照中极为重要，可用以排除假阳性疗效或假阳性不良反应。研究者应掌握用药组和安慰剂对照组的病人，必要时采用适当措施，以保证病

人的安全。

4．自身对照

对照与处理在同一受试对象中进行，如以给药前的血压值作为对照。这种对照简单易行，但它不是随机分配的，如实验前后某些因素发生改变会影响结果，这就难以得到正确的结论。故在实验中常仍需单独设立对照组，通常分别比较处理组和对照组前后效应的差异。 5．标准对照

用现有的标准方法或用同类典型的药物作为对是，其目的是比较标准方法或典型药物与现用方法（或现用药物）。 6．相互对照

指各处理因素间互为对照，如几种药物治疗某种疾病时，观察几种药物的疗效，各给药组间互为对照。（二）随机原则

随机（randomization）是使每个实验对象在接受分组处理（用药、化验、分组、抽样等）时均具有相等的机会，随机遇而定。随机化有两个作用，一是尽量使抽取的样本能够代表总体，减少抽样误差；二是使各组样本的条件尽量一致，消除或减小组间人为的误差，从而使处理因素产生的效应更加客观，以便得出正确的实验结论。随机化手段可采取随机数字表或小计算机上的随机数字键。

上述的随机方法为完全随机或称绝对随机，虽然能使每个实验对象在接受处理时都有相等的机会，但不能保证主要因素在各组中分配均衡，故近年来提倡“均衡随机”的方法处理实验对象，即先将能控制的因素（如性别、体重、年龄、感染程度等）先行均衡地分档，然后在每一档中随机取出等量的动物分配到各组，使那些难以控制的因素（活泼程度、饥饱程度、疲劳程度等）得到随机安排。（三）重复原则

精确可靠的实验结果，应能在同样条件下重复出来。能够充分重现的实验才是可靠的实验。另一方面，实验决不能单凭三五例观察就草率地做出结论，一定要有足够的重复数（实验次数或实验例数）。因此，重复原则就有二方面的含义，一是重复稳定性，或称重现性，二是重复数。

重现率可用统计学中显著性检验规定的P（机率）表示： P≤0.05差异在统计学上有显著意义，不可重现的概率小于或等于5%，重现性好。P≤0.01：差异在统计学上有非常显著意义，不可重现的概率小于等于1%，重现性非常好。

为了提高重现性，要求实验必须具有足够的重复数，因此在药理专业上有基本实验例数的规定，下面列出的数据供实验设计时参考。

每组实验动物的基本例数

动物计量资料计数资料小动物（小鼠、大鼠、蛙） ≥ 10 ≥30 中等动物（豚鼠、兔） ≥8 ≥20 大动物（猫、猴、犬） ≥6 ≥10 注：药物分为3～5个剂量组时也可少些例数

重复性（实验例数）应适当，过少不行，过多也不必要。实验例数与许多因素有关。一般而言，在生物个体差异较小、处理因素强度较大、实验技术（仪器等）较先进、计量资料、组间例数相同、高效实验设计（如拉丁方设计、正交设计）及大动物可选用较少的例数。反之，要较多的例数。

另外，实验设计还要注意均衡原则，实验组与对照组除了处理因素不同外，非处理因素基本一致者称为均衡。均衡是处理因素具有可比性的基础，研究可采用各种设计方案，控制干扰因素趋于一致。主要在以下几方面：

1．动物要在品系、体重、年龄、性别、饲养和饲养方式等方面一致。 2．仪器要在仪器种类、型号、灵敏度、精确度、零点漂移、电压稳定性、操作步骤和熟练程度等方面一致。

3．药物要使药物厂商、批号、纯度、剂型、剂量、注射容量和速度、酸碱度、温度，给药途径和顺序等方面保持一致。

4．环境要使实验室温度、气压、湿度、季节乃至时间等条件保持一致。

第二节实验设计的基本方法

实验设计方法指实验设计的随机分组法，有以下几种主要类型。一．完全随机设计

完全随机设计（completely random design）是把实验动物完全随机地分配到处理组及对照组中去。仅涉及一个处理因素，又称单因素设计。可分为两组或两组以上，各组例数可相等，也可不相等。本设计和处理简单易行，但只能处理一个因素，效率较低。实施方法有抽签法及随机数字表法。

例将雌兔16只分为2组，2组动物数相同。编上动物号（按体重由小到达）。从随机数字表（见表）中取第7行1~16列数字。先以随机数字奇数编为A组，偶数编为B组。得A组9只，B组7只。因需要将A组1只调入B组，再取以上随机数字后的一个数字（76）除以9（即9只兔子有均等归入B组的机会）的余数4，故将A组的第4只归入B组。

兔号

随机数字组别组别调整

84 B

42 B

17 A

53A

31 A

57 A

24 B

55 A

06 B

88 B

77 A

04 B

74 B

47 A

67 A

21 A

随机数字表

行数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

1 03 97 16 12 55 16 84 63 33 57 18 26 23 52 37 70 56 99 16 31 68 74

2 47 74 76 56 59 22 42 01 21 60 18 62 42 36 85 29 62 49 08 16 34 57

3 43 24 62 85 56 77 17 63 12 86 07 38 40 28 94 17 18 57 15 93 30 25

4 73 67 27 99 35 94 53 78 34 32 92 97 19 35 12 37 22 04 32 13 65

5 86 62 66 26 39 31 59 29 44 46 75 74 95 12 13 35 77 72 43 70 76

6 36 42 56 96 38 49 57 16 78 09 44 84 82 50 83 40 96 88 33 50 55 59

7 96 81 50 96 54 54 24 95 47 17 16 97 92 39 33 83 42 27 27 74 29

8 47 14 26 68 82 43 55 55 56 27 16 07 77 26 50 20 50 95 14 30 97

9 36 57 71 27 46 54 06 67 07 96 58 44 77 11 08 38 87 45 34 87 77 68

10 61 20 07 31 22 82 88 19 82 54 09 99 81 97 30 26 75 72 09 19 40 60

11 46 42 32 05 31 17 77 98 52 49 79 83 07 00 42 13 97 16 45 20 44 71

列数 12 98 53 90 03 62 37 04 10 42 17 83 11 45 56 34 12 59 15 22 91

13 63 32 79 72 43 93 74 50 07 46 86 46 32 76 07 51 25 36 34 37 78 38

14 71 37 78 93 09 23 47 71 44 09 19 32 14 31 96 03 93 16 68 00 84 67

15 62 32 53 15 90 78 67 75 38 62 62 24 08 38 88 74 47 00 49 49 26 54

16 33 27 13 57 06 87 21 12 15 90 06 20 32 80 54 17 70 04 12 52 04 13

17 26 07 55 12 18 35 76 86 51 52 76 14 98 22 42 76 33 43 72 85 33 58

18 16 36 38 10 44 20 33 73 00 84 50 85 94 02 06 37 24 18 07 66 46 18

19 80 07 58 14 32 96 50 58 13 77 03 88 07 53 87 13 03 66 34 60 09 24

20 45 51 59 21 53 43 25 07 42 27 10 45 72 53 98 04 54 79 45 44 52 76

21 60 24 88 88 23 84 83 44 99 08 55 10 93 86 35 07 97 94 90 38 68 15

22 11 51 97 26 83 26 92 39 66 02 23 93 85 60 85 74 77 77 27 48 07 54

23 14 79 54 49 01 34 12 52 02 73 72 79 42 29 21 46 24 72 88 97 55

24 10 14 81 30 91 06 38 79 43 05 88 10 04 48 19 44 21 95 11 06 95

23 24 25 26 27

27 00 29 16 11

42 39 94 90 27

37 68 98 82 94

86 29 94 66 75

53 61 24 59 06

48 66 68 83 06

55 37 49 62 09

90 32 69 19

65 20 10 11 74

72 30 82 12 66

96 77 53 67 02

57 84 75 19 94

69 57 91 00 37

36 03 93 71 34

10 29 30 74 02

96 10 34 60 76

46 45 25 47 70

92 65 20 21 90

42 04 57 29 30

45 26 27 68 86

97 11 40 02 38

60 04 48 02 45

49 96 73 37 94

04 67 51 03 30

如将动物分为3组，过程相似，其中将随机数字被3除，余数为1、2、0者分别归入A、B、C组。

完全随机设计的数据分析，可按单因素方法（F检验）。如只有两组，

可用成组比较t检验。质反应数据常用检验法。

二．配对设计

配对设计先将受试对象按相似条件配对，再随机分配每对受试对象到两个组中。在动物实验中常将同窝、同性别、相近体重的动物配对。本设计与配伍设计结合能提高统计效率。

例将12对动物进行配对设计。取第20行前12个随机数字，数字为奇数者将配对组第一个动物分入甲组，偶数分入B组（配对设计资料的分析用配对t检验法）。

动物对数随机数字配对组第一个动物组别配对组第一个动物组别

1 31 A

2 16 B

3 93 A

4 32 B

5 43 A

6 50 B

7 27 A

8 A

9 87 A

10 19 A

11 20 B

12 15 A

三．配伍设计

配伍设计（随机区组设计）是配对设计的扩大，每一配伍组的动物数在3只或3只以上。各配伍组的例数为组数。本设计涉及两个处理因素，又称双因素设计。

例将已分成5个组的20只动物随机分配到A、B、C、D四个组。取随机数字，每取3个数字留一个空位，第一个配伍组中3个数字依次用4、3、2除之，余数分别为1（A）、1（B，即剩下的B、C、D之第一位）、0（D、C、D的第二位）、第四个只能为C，其他配伍组类推。进而整理出各配伍组的动物编号。

动物编号随机数字除数余数组别

1 61 4 1 A

2 58 3 1 B

3 22 2 0 D

4 − - - C

5 04 4 0 D

6 02 3 2 B

7 99 2 1 A

8 - - - C

9 99 4 3 C

10 78 3 0 D

11 78 2 0 B

12 - - - A

13 83 4 3 C

14 82 3 1 A

15 43 2 1 B

16 - - - D

17 67 4 3 C

18 16 3 1 A

19 38 2 0 D

20 - - - B

配伍组 A组 B组 C组 D组

（1） 1 2 4 3

（2） 7 6 8 5

（3） 12 11 9 10

（4） 14 15 13 16

（5） 18 20 17 19

配伍设计的数据可用双因素方差分析。四．拉丁方设计

A B C D 拉丁方设计涉及三个因素，又称三因素设

B C D A D C D B A C A B 计。本设计被安排在一个n×n拉丁方阵中，

如4×4拉丁方（见左）

从左表可见，每行或每列均有A、B、C、

D四种处理，比配伍设计更均衡，故这种设计误差更小，效率更高，特别适用于立体标本，可以消除标本间和用药次数间的干扰，准确比较药效。在实际应用时使用优化拉丁方则更佳，如4×4优化拉丁方：

标本号

1 A B C D

2 B D A C

3 C A D B

4 D C B A

用药顺序

1 2 3 4

在上表中，每种药物受前其他药物影响各一次，每一种药物又影响之后其他药物各一次，即抵消了各药间的相互影响。在统计计算时不必计算各药的后遗作用。

拉丁方设计的数据可用三因素方差分析。五．正交设计

要分析的处理因素较多时可用正交设计，以提高实验效率及节省试验次

数，例如做一个4因素各因素有3个水平的全面试验需要34~81次，瘅应用正交设计仅需作9次。正交设计是利用一套正交表（见有关统计书），将各个处理因素与每个水平之间各组合均匀配搭，是一种高效和快速的多因素试验设计方法。正交设计一般记为L9（34）、L8（27）等，L表示正交，L的右下标表示试验次数，铦号内的数字表示水平数，忧伤角的数字表示因素数，如L8（27）表示做8次试验，每个因素有2个水平，可以安排7个因素。正交设计特别适于优化工艺方法、实验条件及多种药物配比等情况。如有4种药物（因素），每种药物有3个剂量（水平），可用L9（34）：

药物

1 2 3

试验号

4 5 6 7 8 9

A 1 1 1 2 2 2 3 3 3

B 1 2 3 1 2 3 1 2 3

C 1 2 3 2 3 1 3 1 2

D 1 2 3 3 1 2 2 3 1

在上表中，各药计量以1（低剂量）、2（中计量）、3（高剂量）表示，第一次试验表示4种药均用低剂量混合，第五次试验表示A、B药均用中剂量，C药用高剂量，D药用低剂量。经各次试验后，用效果最好的（可用某些指标和定量计分）。判断某次试验的药物配比最佳处方。

第三节实验数据的分析与统计

实验研究中，对实验中所获得的数据正确的应用统计学方法分析与处理可以提高研究效率，排除实验中偶然因素的干扰，用较短的时间、较少的人力物力，取得确切恰当的实验结论。

一、量反应资料的归纳和处理 (一) 量反应资料的基本参数

量反应资料的基本参数包括均数（），标准差（SD），标淮误（Sx，SE），例数（n），变异系数（CV），可信限（CL）。

1．均数（，arithmetic mean，样本平均数）一组测量值的算术平均数，它反映这一组数据的平均水平或集中趋势。其计算公式为：

12nn

n2．标准差（SD，stamdard deviation，样本标准差）标准差是描述该

组数据的离散性代表值。它是离均差平方和自由度均数的平方根，即

22()/n

SDn1

根式内分子为离均差平方和（L）， L2()2/n。根式内

值为均方（MS），均方是方和与自由度（n’, df）之比。

在求得均数与标准差后，一般用均数±标准差(±s)联合表示集中趋向与离散程度。样本量足够时，可用（1.96S）作为双侧95%正常参考值范围。

3．标淮误（Sx，SE，standard error，均数的标准误）标准误是表示样本均数间变异程度的指标。

SSn2()2/nn(n1)

4．变异系数（CV）当两组数据单位不同或两均数相差较大时，不能直接用标准差比较其变异程度的大小，这时可用变异系数作比较。

CVSD

CV可用小数或百分数表示。是一种相对离散度，即能反映实验数据的离散程度（SD），又能代表集中趋向的正确程度（）。CV越小，表示数据的离散性越小，均数代表集中趋向的正确性越好。

5．可信限（CL）可信限用来衡量实验结果的精密度，即均数的可信程度，从某实验所得部分动物实测值参数推算总体（全部动物）均数范围。

95%可信限 =  t(n’)0.05Sx

99%可信限 =  t(n’)0.01Sx

前一式表示在0.05的概率水平估计其可信限范围，也可以说100次实验有95次其均数在这个范围）。

对量反应数据，样本例数n及、SD是最基本的，其他指标（CV、SX、可信限）可由此进一步求得。（二）量反应资料的显著性检验

1．t检验 t检验是用t值作显著性检验的统计方法。用于两组均数、LD50、ED50、回归系数、前后对比或配对对比的差数均数的显著性检验。（1）两组均数比较的t检验：两组的量反应资料（n值相同或不同）用本法。

n’=n1-n2-2)t式中

12Sx1x2

Sx1x2Sc2n1n2 n1n2

Sc2

212(1)2/n12(2)2/n2n1n22

为较方便地用计算器计算，可先求出两组平均数、标准差，按下式求Sc，便进一步求出t值。

2S2c2(n11)S12(n21)S2

n1n22

（2）自身前后比较（个别比较、配对比较）：实验结果用给药前后值或配对比较时用本法。

Sx (n’=n-1)

式中，位给药前后（或配对）值之差的均数，SX为给药前后数值之差的标准误。根据t值表中所列的t（n’）0.05与t（n’）0.01的值确定p值，t值越大，p值越小，统计学上越有显著意义。

2．方差分析多组（3组或3组以上）量反应资料间的比较，用方差分析（amalysis of variance）。这是一种很常用的统计方法。

这里用随机分组的方差分析为例说明。样本均数间的差异可能由两种原因造成：抽样误差（个体间差异）的影响和不同处理的作用。如果处理不发生作用（即各样本均数来自同一总体），则组间均方（MS组间，表示组间变异的程度）与组内均方（MS组内，表示组内变异的程度）之比值（F值）接近1。如F值远大于1，超过方差分析用的F值表。中F（n1、n2）0.05的数值，则各种处理作用不同）。下面是方差分析的基本步骤。

（1）求F值，作方差分析：计算各组的为小写，与各组数据有关）及

、2、n、(、n

、2、N、（、N为大写，与整

个数据有关）。根据下表求F值。变异来原总变异组间变异组内变异 C=()2/N k为组数

从计算的F值及F（n1\\n2）0.05、F(n1、n2)0.01判断p值及显著性。

（2）各组均数两两比较：如方差分析p≤0.05，则进行下列运算，将各组平均数排序（由大至小或由小至大）

求两组比较的q值

L总-L组间 N2=N-k L组内/n2 方和L 自由度 N-1 n1=k-1 均方MS F值 2c [()2/n]c L组间/n-1 MS组间/MS组内 qabS2211nanb

式中S2为组内均方。从q值表中查出Q（n’、T）0.05及Q（n’、T）0.01的值（n’为组内自由度，T为处理数），判断p值及显著性。

二、质反应资料统计分析

质反应资料又称定性资料，每一观察对象不能得到一个具体的数据，只能从性质上归属于某一类型。基本参数只有二种，即例数（n ）与出现率（P）。后者常用小数表示（0.85 = 85%）

质反应资料的显著性检验方法有： 1．2检验 2读作“卡方”（chi方）。其基本公式为：

f = （R-1）×（C-1）

此公式中A是实验频率。T是理论频数，R为行数， C为列数。 2值越大，统计意义也越大，P值就越小。2 0.05及2 0.01值可根据自由度（f）由表中查到。自由度为1时，2 0.05=3.84，2 0.01=6.63。

2．两组阳性率的2检验-----四格表资料的显著性测定

2检验在甲

乙两组比较阳性率时，共有二行二列，可排成四格表，此时自由度为（2-1）×（2-1）=1。对四格表来说，2基本公式误差较大，可用校正公式（四格表专用公式）计算。

2(adbcN/2)2N(ab)(cd)(ac)(bd

（f =1，2 0.05=3.84，2 0.01=6.63）

式中a,b,c,d是四格表中的例数（不是阳性率）

例：某次药理试验结果，A、B二组有效和无效例数，试作显著性检验。 + - 合计 A （用药组） 11（a） 14（c） 25（a+c)

B（对照组） 13（b） 4（d） 17(b+d) 合计 24（a+b) 18(c+d) 42N 73

2(11413442/2)242241825173.13

3.13< 3.84 ，p ＞ 0.05 A、B二组阳性发生率的差别无显著性意义。三、回归与相关

前面的资料均为单变量资料。如果两个变量X、Y，其间存在密切的数量关系，就是说X与Y有相关关系（简称相关）。如果两个变量中，X为自变量，Y为因变量，则可以根据实验数据计算出从自变量X的值推算的函数关系，找出经验公式，此即回归分析。如果相关是直线相关，求算的经验公式是直线方程称为直线回归分析。（一）相关系数与直线回归

1．相关系数及其显著性检验两个变量分不清哪一个是自变量，哪一个是因变量时，通常计算其相关系数测定其显著性以了解其相关的密切程度。直线回归资料的两变量应是密切相关的。

rxyxy/xx2(x)2/ny2(y)2/n （n’=n-2）

查相关系数表以判断其显著性。