(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 112501219 A(43)申请公布日 2021.03.16
(21)申请号 202011610653.3(22)申请日 2020.12.30
(71)申请人 天津科技大学
地址 300457 天津市滨海新区经济技术开
发区第十三大街9号(72)发明人 王正祥 牛丹丹 田康明 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人 饶文君 蔡学俊(51)Int.Cl.
C12P 7/56(2006.01)C12P 19/14(2006.01)C12P 19/02(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图2页
(54)发明名称
一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法
(57)摘要
本发明公开了一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法。通过在培养基中加入一定浓度的蔗糖酶，将蔗糖逐步水解为葡萄糖和果糖的同时，由乳酸单体生产菌种将葡萄糖和果糖转化为L‑乳酸或D‑乳酸，蔗糖到乳酸单体的转化率达到100%以上，本发明可以用于蔗糖原料的高效乳酸单体的生物发酵法制备。
CN 112501219 ACN 112501219 A
权 利 要 求 书
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1.一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法，其特征在于：蔗糖经蔗糖酶逐步水解成葡萄糖和果糖后，生产菌种代谢葡萄糖和果糖生产出乳酸单体。
2.根据权利要求1所述的一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法，其特征在于：发酵起始阶段，向发酵培养基中加入10~50 g/L蔗糖和以蔗糖质量计加1~50 U/g的蔗糖酶，培养在30℃~37℃、pH 5.5~7.5、通风0.1~2.0 vvm、1~1000 r/min搅拌下进行；培养时间5~15 h，菌体量达到OD600为1050。
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3.根据权利要求1所述的一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法，其特征在于：发酵产酸阶段关闭通风，降低搅拌速度到1~300 r/min，提高发酵温度到37℃~55℃，以蔗糖质量计补加3~150 U/g的蔗糖酶，流加蔗糖液，流加速度控制在3 g/(L*h)~25 g/(L*h)，同步流加5~35wt.%氢氧化钙悬浊液，控制发酵pH在5.0~8.0之间。
4.根据权利要求1所述的一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法，其特征在于：所述的乳酸单体的光学构型是D‑乳酸或L‑乳酸。
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说 明 书
一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法
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技术领域
[0001]本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法。
背景技术
[0002]乳酸单体是生物可降解材料聚乳酸的生产用单体，分为L‑型乳酸和D‑型乳酸。微生物发酵法是最具工业化生产优势的乳酸单造方法。[0003]近年来，随着“白色污染”治理需求，生物可降解聚乳酸材料发展迎来巨量市场需求。聚乳酸生产所需乳酸单体的大规模工业化生产，已成为聚乳酸产业链中最为关键的一环。前期的研究结果显示，以淀粉或生物柴油副产物甘油为原料，通过代谢工程菌生物代谢已实现乳酸单体（D‑型乳酸或L‑型乳酸）的规模化生产。现有用于乳酸单造的原料，主要包括淀粉、葡萄糖、甘油、木质纤维素水解糖等（Tian, et al, Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113: 181‑188.；Niu, et al, Microbial Cell Factories, 13: 78‑88.；Chen, et al, Green Chemistry, 16: 342‑350.；Zhou, et al. Metabolic Engineering, 14: 560‑568；Chen, et al, Biotechnol Adv, 31:1200‑1223, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 111‑114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1‑10, 2013）。现有乳酸单体高效生产菌种主要是通过遗传重组技术获得的，其中重组大肠杆菌具有底物代谢谱广、代谢速度快、乳酸单体合成效率高等优点，已具备以葡萄糖为原料工业化生产L‑乳酸或D‑乳酸单体。[0004]蔗糖是自然界中最主要的二糖，一个分子的蔗糖由一分子的葡萄糖和一分子的果糖构成，是发酵工业的重要原料之一。目前淀粉糖产业的迅猛发展，需要就蔗糖为原料的大宗工业品生产技术创新与应用，其中利用蔗糖作为发酵原料用于乳酸单体的发酵生产已呈现出显著的原料优势和巨大的产品应用空间。但是，作为现有乳酸单体生产主要菌株的代谢工程大肠杆菌，往往不能直接代谢蔗糖或者代谢蔗糖的能力极弱。[0005]在以蔗糖为原料生产乳酸单体的已有研究中，以局限于生产菌种或工艺的不足，蔗糖为原料生产乳酸单体，存在效率不高、糖酸转化率较低、简捷生产工艺不完善等。例如，代谢工程大肠杆菌CGMCC 11059和CGMCC 11060（ZL201580000781.7）是优秀的乳酸单体工业生产菌株，但其不具有代谢蔗糖的能力（张桦宇，天津科技大学 硕士学位论文，2020）；再如，利用重组技术获得能够代谢蔗糖的重组大肠杆菌HBUT‑L，以蔗糖为碳源发酵96 h后L‑乳酸的转化率为74.0%，产量仅为60 g/L，生产强度为0.3 g/(L·h)，（赵锦芳等. 大肠杆菌工程菌利用甘蔗糖蜜发酵产L‑乳酸研究. 湖北农业科学, 2016）。这是因为，从自然界获得的野生大肠杆菌大多数不具有代谢蔗糖的能力，部分具有代谢蔗糖能力的野生大肠杆菌多数又为质粒所携带的代谢基因并且多数与大肠杆菌致病性关联，不能将其直接用于工业生产目的（Jahreis K, et al. Adaption of sucrose metabolism in the Escherichia coli wild‑type strain EC3132. J Bacteriol 2002; 184(19):5307–5316）；从自然界中发现的、在其基因组中具有代谢蔗糖相关编码基因的野生大肠杆菌尽管被发现（Sahin‑
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Toth M, et al. Cloning, sequencing, and expression of cscA invertase from Escherichia coli B‑62. Can J Microbiol 1999; 45:418–422），利用这一属性进一步所构建的大肠杆菌HBUT‑D，可以利用蔗糖为原料生产D‑乳酸，但是D‑乳酸的转化率仅为85%，光学纯度为98.3%，特别是发酵强度较低，仅为~1 g/(L·h),（Wang Y, et al. Homofermentative production of D‑lactic acid from sucrose by a metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol Lett 2012; 34:2069–2075）。[0006]为了实现重组大肠杆菌高效代谢蔗糖为乳酸单体，本发明提供了一种以蔗糖为原料进行乳酸单体高效生产的发酵生产技术，运用本发明技术，蔗糖到乳酸单体（包括D‑乳酸和L‑乳酸）的糖酸转化率达到102%以上，乳酸单体的生成浓度达到16%以上，乳酸单体生成的总发酵强度大于5 g/(L·h)，乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.5%。发明内容
[0007]本发明目的是提供一种以蔗糖为原料发酵生产乳酸单体的方法，以蔗糖或含蔗糖的原料，直接代谢蔗糖发酵生产乳酸单体的高效生产技术。[0008]为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
所述方法是以蔗糖为原料同步糖化发酵生产乳酸单体，具体包括以下步骤：（1）在发酵起始阶段，向发酵培养基中加入10~50 g/L蔗糖和1~50 U/g(以蔗糖计)
的蔗糖酶，培养在30℃~37℃、pH 5.5~7.5、通风0.1~2.0 vvm、1~1000 r/min下；培养时间5~15 h，菌体量达到OD600为10~50。[0009]（2）关闭通风，降低搅拌速度到1~300 r/min，提高发酵温度到37℃~55℃，补加3~150 U/g（以蔗糖计）的蔗糖酶。[0010]（3）通过流加方法流加50‑70wt.%蔗糖溶液，流加速度控制在3 g/(L·h)~25 g/(L·h)，使最终糖液总量为起始发酵体积的10%~25%；同步流加5~35wt%氢氧化钙悬浊液，控制发酵pH在5.0~8.0之间，直至发酵结束。[0011]本发明的有益效果：
本发明提供了一种以蔗糖为原料进行乳酸单体高效生产的发酵生产技术，糖酸转
化率达到102%以上，乳酸单体的生成浓度达到16%以上，乳酸单体生成的总发酵强度大于5 g/(L·h)，乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.5%。可用于以蔗糖为原料或含蔗糖的原料进行高效乳酸单体的发酵生产，显著改善乳酸单体发酵生产的原料依存关系，并可改善甘蔗或甜菜种植业的经济效益。
附图说明[0012]图1 连续流加工艺下同步糖化发酵生产L‑乳酸单体的进程。[0013]图2 连续流加工艺下同步糖化发酵生产D‑乳酸单体的进程。
具体实施方式
[0014]为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
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本发明所采用的大肠杆菌（Escherichia coli）CGMCC NO. 11059和CGMCC
NO.11060（已公开于ZL201580000781.7中），分别为D‑乳酸单体生产菌和L‑乳酸单体生产菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏日期均为2015年7月7日；
本发明所采用的蔗糖酶，为来源于酿酒酵母的蔗糖酶，可以通过购买商品化蔗糖
酶酶制剂获得；所采用的蔗糖酶也可以通过微生物发酵自制获得，如采用黑曲霉菌株进行发酵制备。
[0016]本发明用于同步糖化发酵生产乳酸单体的方法，是在发酵起始阶段，向发酵基本培养基中加入蔗糖至终浓度10~50 g/L和1~50 U/g(以蔗糖计)的蔗糖酶，培养在30℃~37℃、pH 5.5~7.5、通风0.1~2.0 vvm、1~1000 r/min搅拌下进行；培养时间5~15 h，菌体量达到OD600为10~50；关闭通风，降低搅拌速度到1~300 r/min，提高发酵温度到37℃~55℃，补加3~150 U/g的蔗糖酶；流加蔗糖液，流加速度控制在3 g/(L h)~25 g/(L h)，同步流加5%~35%氢氧化钙，控制发酵pH在5.0~8.0之间，直至发酵结束。[0017]本发明采用的主要实施方法如下：
1、蔗糖酶酶活测定
一个蔗糖酶单位定义为，在检测条件下（pH 6.5，温度37℃），每分钟水解产生1 μ
mol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。将底物由蔗糖替换为低聚果糖、果聚糖（菊粉），相同条件下检测待测酶的果糖基水解活性。[0018]将800 μL 6.75%（w/v）蔗糖液置于37℃条件下预热5 min，取200 μL酶液加入其中，37℃下准确反应30 min，85℃加热10 min灭活酶，冷却至室温。使用生物传感仪测定葡萄糖含量。[0019]2、摇瓶发酵生产乳酸单体
在250 mL三角瓶中装50~100 mL发酵培养基（十二水磷酸氢二钠0.5%~2.5%，氯化
钠0.02%~0.1%，磷酸二氢钾0.1%~1.0%，氯化铵0.01%~0.5%，葡萄糖0.1%~1.0%；pH 7.0），接种生产菌，30℃~37℃、pH 5.5~7.5、100~250 r/min培养5~15 h。分别补加终浓度为1%~7%的葡萄糖、蔗糖或果糖和1.0~5.0 g碳酸钙后进入静置培养厌氧产酸阶段，取样测定发酵液中菌体量、残糖和L‑乳酸或D‑乳酸的含量。[0020]3、发酵罐发酵生产乳酸单体
取发酵菌种的单个菌落（CGMCC NO. 11059或CGMCC NO.11060），接种于50 mL的LB
液体培养基（诸葛健 王正祥 工业微生物实验技术手册，北京：中国轻工业出版社，1994）中，30℃~37℃、100~250 r/min摇床培养5~15 h，作为一级种子液。将一级种子液接种于150 mL以葡萄糖或果糖为碳源的M9液体培养基（田康明等，生物工程学报, 29: 111‑114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1‑10, 2013）中，起始糖浓度均为0.1%~1.0%，30℃~37℃、100~250 r/min摇床培养5~15 h，作为二级种子液（即种子液）。将二级种子液按照起始OD值0.1~1.0的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后发酵罐初始体积为工作体积的25%‑60%，发酵按照两阶段发酵法进行（田康明等，生物工程学报, 29: 111‑114, 2013；田康明等，生物工程学报, 29: 1‑10, 2013）。发酵中的起始阶段，温度控制30℃~37℃，维持pH 5.5~7.5，通气量为0.1 vvm~2.0 vvm，转速为1~1000 r/min；当菌体浓度达到OD600为10~50，进入厌氧发酵阶段（即产酸阶段），温度控制37℃~55℃，搅拌转速调为1~300
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r/min，流加5%~35%氢氧化钙悬浊液维持pH在5.0~8.0。发酵产酸阶段的碳源采用分批补料工艺或流加补料方法进行，其中，分批补料方法中，分四次补加终浓度1%~7%的糖液，总补加量为10%~25%（以起始发酵体积计）；流加补料方法中，通过糖液流加速度的控制，维持一定糖浓度，糖液总量为10%25%。
~（以起始发酵体积计）
[0021]4、发酵过程分析
样本制备：取1 mL需检测的发酵液与50 μL的10 mol/L硫酸混匀后12000 r/min离
心5 min，吸取适量的上清液并加入等体积浓度为20%的三氯乙酸，混匀后在4℃静置4 h，12000 r/min离心5 min，上清液用ddH2O适当稀释后经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，进行相关组分的分析测定。[0022]（1）葡萄糖浓度测定：将样品适当稀释后使用SBA‑40C型生物传感仪进行葡萄糖浓度的测定，取三次平行数据的平均值。[0023]（2）果糖浓度测定：用3,5‑二硝基水杨酸法（DNS）法测定还原糖的浓度，测定值减去其中的葡萄糖含量即为样品中果糖的浓度，取三次平行数据的平均值。[0024]（3）蔗糖浓度测定：采用HPLC方法进行测定，色谱分析条件：色谱柱为grace prevail carbohydrate ES 5u液相色谱柱，柱温为30℃，柱压为90 bar，流动相为65％乙腈（v/v），流速为1.0 mL/min，检测器漂移管温度为90℃，空气载气流速为2.2 mL/min，进样量为15 μL。[0025]（4）D‑乳酸、L‑乳酸、丙酮酸、甲酸、乙酸和丁二酸含量测定：采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为HPX‑87H有机酸分析柱，柱温为65℃，检测波长为210 nm，流动相为5 mmol/L浓度的硫酸溶液，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。[0026]（5）乳酸单体光学纯度测定：采用HPLC进行，色谱检测条件为：色谱柱为Astec CLC‑L光学纯度分析柱，柱温为25℃，检测波长为254 nm，流动相为5 mmol/L浓度的硫酸铜溶液，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。[0027]实施例1 先糖化后发酵生产乳酸单体
在10 L反应罐中，加入1 L热水，然后边加热边溶解加入5.75 kg蔗糖，完全溶解后
制备70%（w/w）的蔗糖糖浆。将蔗糖糖浆置于65℃下保温30 min，加入60 U/g蔗糖添加量的蔗糖酶并于65 ℃水浴摇床中反应18 h，获得转化糖液，备用。将D‑乳酸或L‑乳酸生产菌种的种子液（即上述方法中的二级种子液），接种于150 mL以葡萄糖为碳源的M9液体培养基中，起始糖浓度均为0.5wt.%，37℃、200 r/min摇床培养10 h，然后取培养液按照起始OD值0.3的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后50 L发酵罐初始体积为25 L，初始转化糖浓度为30 g/L；发酵开始阶段，温度37℃，通气量为1.5 vvm，搅拌转速为1000 r/min，用氨水维持pH 6.5；当菌体浓度达到OD600为30，进入厌氧发酵阶段，采用分批补料方式时按照总补加糖量分四批补加（以起始发酵体积计，补加糖液到终浓度为6wt.%，以起始发酵体积计，总糖的添加量大约为240 g/L）；或采用连续流加补料方式发酵时按照20 g/(L h)速度进行流加蔗糖糖浆，以起始发酵体积计，总糖的添加量大约为240 g/L，并控制葡萄糖浓度不高于10 g/L。发酵过程中，同步流加30%氢氧化钙，控制发酵pH为7.0。[0028]分批补料方式下，以转化糖为原料发酵D‑乳酸和L‑乳酸平均产酸速率分别为3.36g/(L*h)和3.45 g/(L*h)，糖酸转化率分别为98.5%和99.2%。连续流加补料方式下，以
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转化糖为原料发酵D‑乳酸和L‑乳酸平均产酸速率分别为4.43 g/(L*h)和4.66 g/(L*h)，糖酸转化率分别为101.2%和101.5%。两种补料方式下，D‑乳酸和L‑乳酸的光学纯度均高于99.9%，化学纯度均高于98%（表1）。[0029]表1 转化糖为原料生产D‑乳酸和L‑乳酸
实施例2 连续补料同步糖化发酵工艺生产乳酸单体
将D‑乳酸（CGMCC NO. 11059）或L‑乳酸（CGMCC NO.11060）生产菌种的种子液（即
二级种子液），接种于150 mL以葡萄糖为碳源的M9液体培养基中，起始糖浓度均为0.5%，37℃、200 r/min摇床培养10 h后，取培养液按照起始OD值0.3的接种量接种于含有M9液体培养基的发酵罐中，接种后50 L发酵罐初始体积为25 L，初始蔗糖浓度为30 g/L，加入15 U/g（按蔗糖质量计）蔗糖酶。发酵过程中菌体生长阶段（起始阶段），温度控制37℃，用氨水维持pH 6.5，菌体生长过程中调节通气量为1.5 vvm，搅拌转速为1000 r/min；当菌体浓度达到OD600为30，进入厌氧发酵阶段，补加入45 U/g（按蔗糖质量计）蔗糖酶，按20 g/(L h)速度流加蔗糖溶液（蔗糖溶液的浓度为50wt.%，以起始发酵体积计蔗糖总添加量大约为240 g/L），发酵温度控制为40℃，搅拌转速为200 r/min，同时流加25%氢氧化钙悬浊液维持pH在7.0，发酵结束前残糖浓度低于0.5 g/L后结束发酵。运用上述发酵技术，发酵结束时，L‑乳酸的积累量为163.0 g/L，L‑乳酸单体生产的平均总发酵强度为5.09 g/(L·h)，L‑乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.5%，糖酸转化率不低于102%（图1）。发酵结束时，D‑乳酸单体积累量为160.5 g/L，D‑乳酸单体生产的平均总发酵强度为5.02 g/(L·h)，D‑乳酸单体的光学纯度高于99.9%、化学纯度高于98.5%，糖酸转化率不低于102%（图2）。
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