双缩脲法测定奶粉中蛋白质的含量
摘 要
测定奶粉中蛋白质含量可用双缩脲法，蛋白质含有两个以上的肽键，在强碱条件下，肽键（—CO—NH—）的质子被解离，二价的铜离子和失去质子的多肽链的氮原子相结合产生稳定的紫色络合物，在540~560nm处测定其光吸收值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。可用来定量测定蛋白质含量，测定范围1~10mg蛋白质。二价的铜离子与除精氨酸以外的所有氨基酸和二肽均不发生反应，仅和1-亚氨基缩脲、2—亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有颜色反应，所以基本上可以认为这是蛋白质的特有反应。
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双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。
关键词：双缩脲 蛋白质含量 奶粉
1.前言
近年来奶粉质量问题在社会上掀起了很大的风浪，作为一名普通的消费者，我们可学习一些实用的方法去了解判断奶粉的质量问题，所以本实验会详细介绍了一种简单快速的测定奶粉中蛋白质含量的方法。蛋白质的含量测定是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。测定蛋白质总量的常用方法有4种：凯氏定氮法、双缩脲法、folin-酚试剂法（lowry）、紫外吸收法。双缩脲法是最简单快速的方法，且不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，该方法在一定程度上还是具有很大的实用意义的。本实验用分光光度计能测定范围内减少样品中蛋白质含量的梯度，增加实验组以提高实验的灵敏度差，同时也用离心机和半透膜等技术减少在操作过程中蛋白质的损失和金属离子的影响。
2.实验目的
学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计和离心机的使用和操作。
3.实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3)是个两分子脲径180（左右加热），放出一个分子氨后得到产物。在强碱性溶液中双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基
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或两个直接连接的肽键或能过一个中间碳原子相连的肽键这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg，干扰这一测定的物质主要有硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸等。（注意样品浓度不要超过10mg/ml）
4.实验设备：紫外分光计，试管数支（7支）。移液管，吸气球，玻璃棒烧杯，电炉
实验材料及试剂：试剂：双缩脲试剂：0.9%生理盐水：固体（NH3）2SO4：饱和溶液（NH4）2SO4：标准蛋白质溶液：奶粉每100g含蛋白质（18.0-24.0g），蒸馏水：氨水：电子天平：滤纸：量筒：
5.试剂的配制
5.1双缩脲试剂 .5gCuSO4-5H2O（硫酸铜）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O-4H2O）用500ml水溶解，在搅拌下加入300,ml10%NaOH溶液，用水稀释到1000ml，储存于塑料瓶，此试剂可长期保存，若储存瓶中有黑色沉淀出现则需要重新配制，
5.2标准蛋白质溶液 称取血清蛋白质（BSA）2.25g溶于0.9%（g/l）Nacl溶液100ml即为配制22.5mg/ml标准蛋白质溶液。
6.材料的处理 半透膜的制备：取数个鸡蛋开一小孔取出蛋清与蛋黄，将空壳置于醋
酸中侵泡数天即可。
7.实验操作步骤
7.1标准曲线的测定 试管标上编号，分别加入0, 0.1, 0.2 0.3, 0.4, 0.5的标准蛋白质溶液，用生理盐水加至0.5ml。然后加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温（20-25度）下放置30min。于540nm处进行比色。用未加蛋白溶液的第一支试管做空白对照夜，取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线 7.2待测奶粉中蛋白质的提取
7.2.1 准确称取100mg奶粉，置于离心管中，加6-7ml温水溶解，振荡，摇匀，直至奶粉全部溶解
7.2.2 离心管放于冰水混合物中冷却2-3min后，取出，往离心管内加入3-4滴氨水，然后加入（NH4）2SO4固体，直至不溶（或者加（NH4）2SO4溶液）。 7.2.3 于冰水中冷却1-2min再放到离心机中离心（4000r/min）离心15min
7.2.4 上清液，取沉淀物，将沉淀物转移到半透膜中用绳子一头扎紧半透膜开口，另一
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头握在手上另一头固定在木板上，将木板侧放，打开自来水开关，让自来水缓慢地流过半透膜，持续10min放入或者在盛有蒸馏水烧杯中，上下移动半透膜约5min一次换一次水，重复一次即可。
7.2.5得到的初产品置于试管中，加入生理盐水至5ml(即稀释5倍)取0.5ml于待测试管中
管号 试剂 1 2 3 4 5 6 标准蛋白0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 质溶液/ml 0.9%NaCl溶液/ml 双缩脲试 4.0 剂/ml 蛋白质含0 0.5（略） 1.0 1.5 2.0 2.5 量/mg/ml A540nm
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 8.结果及计算
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量（ug/ml），按下式计算：
样品蛋白质含量（ug/g）=（mo*V）/(m*Vo) 式中，mo为根据待测样品吸光度从标准曲线上查得的蛋白质的质量（ug）：V为提取液总体积（ml）：m为称取样品质量（g）：Vo为测定所用提取液的体积（ml）
该实验所需要的时间约2h,产品的回收率约为99%。
9. 注意事项
1.润洗比色皿时尽量用少点样品，因为配制的样品不多，以免之外分光检测时样品不够 2.用半透膜提纯蛋白质时应多加小心，以防半透膜破裂，蛋白质漏出 3.在加入（NH4）2SO4固体时尽量在冰水中操作，减少实验误差
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4.准确量取各药品的含量和控制好操作时间
5.标准曲线制定必须在完成配制后1h内完成，延长时间该溶液的吸光值会变大 6.温水的温度不能高于60度，最好在40度左右。
7.注意转移产品时防止残留产品需加适量生理盐水洗涤后再合并 8.第二组标准蛋白质的吸光度可以忽略，不加入标准曲线的制定。
参 考 文 献：
① 李盛贤 刘松梅 赵丹丹 编著 生物化学 哈尔滨工业大学出版社 2005年 ② 王廷华 邹晓莉 蛋白质理论与技术 科学出版社 2005
③ 主编：张龙翔 张庭芳 李玲媛 生化实验方法和技术（第二版）高等教育出版社2003 ④徐小静 张少斌 王俊丽 生物技术原理与实验（第一版）大学出版社2006 ⑤欧阳平凯 胡永红 姚忠 生物分离原理及技术（第二版）化工工业出版社 2010 ⑥王延华 邢如新 游潮 蛋白质理论与技术（第二版）科学出版社2009 ⑦陆建 蛋白质纯化技术及应用 （第一版）2005
⑧J.A.托马斯 R.L.富克斯 生物技术与安全性评估（第三版）科学出版社2007 ⑨张龙翔 张庭芳 李玲媛 生化试验方法和技术（第二版）高等教育出版社2003 ⑩曾富华 生物化学实验技术教程（第一版）2011
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