TMEM16A与p-p38在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义
沈恒石;韩艳春;张骞;马莉;赵塞
【摘 要】目的 探讨TMEM16A和磷酸化p38(p-p38)的相互关系及在乳腺浸润性导管癌组织中表达的临床意义.方法应用免疫组织化学方法检测60对乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织中TMEM16A和p-p38蛋白的表达情况,对TMEM16A和p-p38表达与乳腺癌临床病理特征关系进行统计学分析,并分析TMEM16A和p-p38表达的相关性,探讨其表达与乳腺癌患者预后的关系.结果乳腺浸润性导管癌组织中TMEM16A的表达阳性率明显高于相应癌旁组织中TMEM16A的表达阳性率.TMEM16A表达与乳腺癌患者组织学分级、淋巴结转移显著相关.乳腺浸润性导管癌组织中p-p38的表达阳性率为60％,而相应癌旁组织中未见明显p-p38的阳性表达.p-p38表达与乳腺癌患者TNM分期、淋巴结转移显著相关.乳腺浸润性导管癌组织中TMEM16A和p-p38的表达呈正相关关系.TMEM16A和p-p38高表达的乳腺浸润性导管癌患者术后无复发生存期低于低表达者的生存期.结论TMEM16A与p-p38表达与乳腺浸润性导管癌恶性表型有关,TMEM16A可能通过激活p38促进乳腺浸润性导管癌的转移,TMEM16A和p-p38的表达可辅助用于乳腺浸润性导管癌的预后评估.
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》 【年(卷),期】2019(028)003 【总页数】5页(P252-256)
【关键词】TMEM16A;p-p38;乳腺癌 【作 者】沈恒石;韩艳春;张骞;马莉;赵塞
【作者单位】沈阳市第二中医医院病理科,沈阳 110101;滨州医学院病理学教研室,烟台 2003;滨州医学院病理学教研室,烟台 2003;滨州医学院病理学教研室,烟台 2003;滨州医学院病理学教研室,烟台 2003 【正文语种】中 文 【中图分类】R735.2
乳腺癌是我国女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是我国女性癌症死亡的首要原因。《2017中国癌症报告》数据显示，乳腺癌为城市女性癌症发病率之首，病死率占女性恶性肿瘤第7位，浸润性导管癌是乳腺癌最常见的组织学类型。乳腺癌的发生与遗传、免疫、激素及各种环境因素有关。跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A，TMEM16A）在包括乳腺癌在内多种恶性肿瘤中异常高表达，并与多种肿瘤的不良预后有关[1-3] 。明确TMEM16A在乳腺癌发生发展过程中的作用机制将对乳腺癌的诊断及治疗提供有利的线索。有报道认为，敲除肝癌细胞中TMEM16A可降低p38磷酸化水平[4] ，而TMEM16A和p-p38在乳腺癌中相关关系目前尚未见报道。为此，我们分析了TMEM16A和p-p38在乳腺浸润性导管癌组织中表达的临床意义、TMEM16A 和p-p38之间的关系及其表达与乳腺浸润性导管癌患者预后的关系。 材料与方法 1 临床资料
用于免疫组织化学方法检测的60例乳腺浸润性导管癌组织和相应的距乳腺癌组织5cm以上的癌旁乳腺组织标本收集于沈阳市第二中医医院。所有病人均经手术切除治疗，术前未接受放疗或化疗等治疗。根据所取标本对应住院号，提取所需各项临床病理资料，包括患者性别、年龄、肿瘤最大直径、淋巴结转移情况、肿瘤分化
程度、TMN分期等资料。所有患者均有完整的临床、病理及随访资料，随访时间为30～80个月。其中所有组织标本均来自女性患者；高分化程度者16例，中分化程度者28例，低分化程度者16例；TNM分期Ⅰ期者16例，Ⅱ期者24例，Ⅲ期者20例。无淋巴结转移者29例；有淋巴结转移者31例。 2 试剂
TMEM16A和p-p38的兔抗人多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；DAB显色剂和免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 3 免疫组织化学
自沈阳市第二中医医院病理科收集来的乳腺组织蜡块标本均制成4μm厚的组织切片，采用免疫组织化学S-P法按试剂盒说明书进行免疫组织化学染色。抗TMEM16A（1: 200）、p-p38（1: 200）抗体均4℃ 孵育过夜。用PBS代替TMEM16A，p-p38抗体作为阴性对照，用已知呈阳性染色的乳腺癌组织切片用来作为阳性对照。结果判定：TMEM16A主要于细胞质内表达，p-p38主要定位于细胞核内，按着色细胞比例划分为五个等级，计分标准分别为：无着色为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；而依据染色强度又划分为四个等级，各级计分标准分别为：无染色者为0分，染为淡黄色者为1分，染为黄色或棕黄色者为2分，染为棕褐色者为3分。最后以着色细胞比例与染色强度之乘积所得分数作为其最终得分，得分≥2定为阳性表达。 4 统计学处理
用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析，采用Chi-Square检验分析
TMEM16A和p-p38分别与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系，用Pearson相关检验进行TMEM16A与p-p38的相关性分析，采用Kaplan-Meier进行TMEM16A和p-p38分别与乳腺浸润性导管癌患者预后的分析，无复发生存率差异检验采用log-rank检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
结 果
1 TMEM16A和p-p38在乳腺浸润性导管癌细胞中表达增强
通过免疫组织化学方法检测了60对乳腺浸润性导管癌组织和相应癌旁乳腺组织中TMEM16A和pp38的表达情况。结果显示，乳腺浸润性导管癌组织中TMEM16A 主要于乳腺癌癌细胞质内呈阳性表达，其表达阳性率为66.7%（40/60），相应癌旁乳腺组织中TMEM16A的表达阳性率为13.3%（8/60）（图1）。乳腺浸润性导管癌组织中p-p38主要于乳腺癌癌细胞核内呈阳性表达，其表达阳性率为60%（36/60），而相应癌旁乳腺组织中未见明显pp38的阳性表达（图2）。进一步统计学分析表明，TMEM16A和p-p38在乳腺浸润性导管癌组织中的表达均高于癌旁乳腺组织中的表达（P＜0.01）。
2 TMEM16A和p-p38与乳腺浸润性导管癌患者的临床病理特征的关系 对TMEM16A和p-p38表达分别与60例乳腺浸润性导管癌患者的临床病理特征的关系分析表明（表1），发生淋巴结转移的乳腺癌患者组织中TMEM16A阳性表达率明显高于未发生淋巴结转移者（P=0.018），且TMEM16A阳性表达亦与乳腺癌的组织学分级有关（P=0.003)，而TMEM16A表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤的直径和TNM分期差异没有显著统计学意义（P＞0.05）。高TNM分期和发生淋巴结转移的乳腺癌患者组织中p-p38阳性表达率明显高于低TNM分期和未发生淋巴结转移者（P=0.019和P=0.004）；而p-p38表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤的直径和组织学分级差异没有显著统计学意义（P＞0.05）。
图1 TMEM16A在乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中表达的免疫组织化学检测。A，乳腺浸润性导管癌组织；B，癌旁组织；比例尺，20μmFig. 1
Immunohistochemical examination for expression of TMEM16A in breast invasive ductal cancer and adjacent non-tumor tissues. A, breast invasive ductal cancer tissue； B, adjacent non-tumor colorectal tissues； scale bar,
20μm
图2 p-p38在乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中表达的免疫组织化学检测。A，乳腺浸润性导管癌组织；B，癌旁组织；比例尺，20μmFig. 2 Immunohistochemical examination for expression of p-p38 in breast invasive ductal cancer and adjacent non-tumor tissues. A, breast invasive ductal cancer tissue； B, adjacent non-tumor colorectal tissues； scale bar, 20μm 3 乳腺浸润性导管癌组织中TMEM16A与p-p38的表达呈正相关
TMEM16A和p-p38在60例乳腺浸润性导管癌组织中均呈阳性表达者28例，均呈阴性表达者12例；40例TMEM16A表达阳性的乳腺癌浸润性导管组织中p-p38表达阳性率为70%（28/40）；20例TMEM16A表达阴性的乳腺浸润性导管癌组织中pp38表达阳性率为40%（8/20）。经Spearman 相关分析得到：TMEM16A与p-p38在乳癌浸润性导管组织中存在正相关关系（表2）。 4 TMEM16A和p-p38表达与乳腺浸润性导管癌患者预后的关系
对60例进行乳腺癌手术患者进行30～80个月的跟踪随访。20例TMEM16A阴性表达者复发率为20%，40例TMEM16A阳性表达者的复发率为62.5%；24例p-p38阴性表达者复发率为29.2%，36例p-p38阳性表达者复发率为61.1%。绘制Kaplan-Meier无复发生存曲线并进行log-rank检验，结果表明TMEM16A、p-p38表达与术后无复发生存率呈负相关（分别log-rank=5.697、5.548，P= 0.017、0.018）（图3）。 讨 论
离子通道的活动是细胞增殖过程顺利进行的必备条件之一，与细胞增殖的关系成为目前研究者关注的热点。钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channels, CaCCs）广泛分布于人体的多种组织，尤其是分泌器官上皮细胞，与众多病理生理过程密切相关[5] 。TMEM16A是TMEM16膜蛋白家族成员之一，是
钙激活氯通道的分子基础。TMEM16A基因定位于人染色体11q13区域上，编码的TMEM16A蛋白含有986个氨基酸[6] 。有研究发现TMEM16A表达较高的肿瘤患者，其组织内 11q13 染色体扩增，对细胞生长增殖的诱导能力增强，肿瘤细胞更加具有侵袭性，肿瘤恶性潜能及恶性程度均更强［7］。目前对TMEM16A的表达机制研究及TMEM16A在乳腺癌发生发展中的作用尚不清楚。 表1 TMEM16A和p-p38表达与乳腺癌临床病理特征的关系Tab. 1 Correlation of TMEM16A and p-p38 expression with clinicopathological features of patients with breast cancerClinicopathological features n TMEM16A p-p38 P值P值- + - +≤45 27 11 16 13 14＞45 33 9 24 11 22 Tumor size (cm)0.099 0.090 Age（years）0.271 0.244＜3 27 12 15 14 13≥3 33 8 25 10 23 TNM stage I 16 9 7 9 7 II 24 7 17 12 12 III 20 4 16 3 17 Histological grade 0.062 0.019*I 16 10 6 7 9 II 28 9 19 14 14 III 16 1 15 3 13 Lymph node metastasis 0.018* 0.004*0.003* 0.118 No 29 14 15 17 12 Yes 31 6 25 7 24
表2 TMEM16A和p-p38表达的相关性分析Tab. 2 Correlation analysis of TMEM16A and p-p38 expression in the breast cancerp-p38 TMEM16A r P value- +- 12 12 0.2 0.025+9 28
图3 TMEM16A和p-p38表达与患者术后无复发生存率的关系Fig. 3 Correlation of TMEM16A and p-p38 expression with the recurrence-free survival rate of breast cancer
TMEM16A在胃肠道间质瘤、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，并与多种肿瘤的不良预后有关[8-9] 。我们实验结果表明，TMEM16A在乳腺浸润性导管癌中的表达高于相应癌旁乳腺组织中的表达，且发生淋巴结转移和组织学分级低的乳腺浸润性导管癌患者组织中TMEM16A蛋白表达水平高于未发生淋巴结转移和组织学分级高者，TMEM16A高表达的乳腺浸润性导管癌患者
术后无复发生存期低于TMEM16A低表达者的生存期。以上结果提示TMEM16A表达增强可能对乳腺浸润性导管癌的恶变和转移有促进作用。
MAPK信号通路参与调节多种细胞生物过程，如凋亡、增殖、生长和迁移，并在肿瘤的进展中发挥了重要作用。p38是MAPK家族重要成员，在多种因素的刺激下磷酸化而被激活，可促进细胞的恶性转化[10] 。我们实验结果表明，p-p38在乳腺浸润性导管癌中的表达高于相应癌旁乳腺组织中的表达，且发生淋巴结转移和高TNM分期的乳腺浸润性导管癌患者组织中p-p38蛋白表达水平高于未发生淋巴结转移和低TNM分期者，p-p38高表达的乳腺浸润性导管癌患者术后无复发生存期低于p-p38低表达者的生存期。以上结果提示p-p38表达增强可能对乳腺浸润性导管癌的演进和转移有促进作用。
Deng等敲除肝癌细胞SMMC-7721中TMEM16A后，p38的磷酸化水平降低，肝细胞癌的生长也受到抑制，表明TMEM16A激活了p38 信号通路，促进肝癌细胞生长[4] 。另有研究表明，TMEM16A 通过激活 MAPK 信号转导通路来促进 HNSCC 的发生和发展[11] 。我们在乳腺浸润性导管癌组织水平研究了
TMEM16A表达与p-p38表达的关系，我们的结果分析表明，TMEM16A表达与p-p38表达呈正相关关系，均与乳腺浸润性导管癌的淋巴结转移有关。以上提示，TMEM16A可能通过激活p38信号通路而促进乳腺癌的转移，而TMEM16A与p38在乳腺浸润性导管癌中具体的关联和机制如何则有待于深入的研究。 参考文献
【相关文献】
[1] Wu H, Wang H, Guan S, et al. Cell-specific regulation of proliferation by Ano1/ TMEM16- A in breast cancer with different ER, PR, and HER2 status. Oncotarget, 2017, 8
(49):84996- 85013.
[2] Cao Q, Liu F, Ji K, et al. MicroRNA-381 inhibits the metastasis of gastric cancer by target- ing TMEM16A expression .J Exp Clin Cancer Res, 2017, 36 (1): 29-35. [3] Liu W，Lu M，Liu B，et al. Inhibition of Ca(2+)-activated Cl(-)channel
ANO1/TMEM16A expression suppresses tumor growth and invasiveness in human prostate carcinoma.Cancer Lett, 2012, 326 (1): 41-51.
[4] Deng L，Yang J，Chen H，et al. Knockdown of TMEM16A suppressed MAPK and inhibited cell proliferation and migration in hepatocellular carcinoma. Onco Targets Ther,2016, 9: 325-333.
[5] Lastraioli E，Iorio J，Arcangeli A. Ion channel expression as promising cancer biomarker. Biochim Biophys Acta, 2015,1848 (10): 2685-2702.
[6] Oh U，Jung J. Cellular functions of TMEM16/anoctamin.Pflugers Arch, 2016, 468(3): 443-453.
[7] Shi ZZ，Shang L，Jiang YY，et al. Consistent and differential genetic aberrations between esophageal dysplasia and squamous cell carcinoma detected by array comparative genomic hybridization. Clin Cancer Res, 2013, 19(21): 5867-5878.
[8] Mokutani Y，Uemura M，Munakata K，et al. Down-Regulation of microRNA-132 is associated with poor prognosis of colorectal cancer. Ann Surg Oncol, 2016, 23(Suppl 5): 599-608.
[9] Dam VS，Boedtkjer DM，Nyvad J，et al. TMEM16A knockdown abrogates two different Ca(2+)-activated Cl (-)currents and contractility of smooth muscle in rat mesenteric small arteries. Pflugers Arch, 2014, 466(7): 1391-1409.
[10] 韩艳春，于宁，张骞，等. Livin和p-p38MAPK在乳腺癌中的表达及意义. 中国组织化学与细胞化学杂志，2015，24（3）：70-74.
[11] Romanenko VG, Catalán MA, Brown DA, et al. Tmem16A encodes the Ca2+-activated Cl-channel in mouse submandibular salivary gland acinar cells. J Biol Chem, 2010,285(17): 12990-13001.
