RNA干扰Twist基因表达对结直肠癌细胞HCT116增殖和凋亡的影响

增殖和凋亡的影响钱江1 朱春丽1杨钦文1陈鹏1 傅仲学&（1.重庆市垫江县中医院普外科，重庆40 83 00 $.重庆医科大学附属第一医院普外科，重庆40 00 1 0 ）摘 要 目的研究RNA干扰Twist基因对结直肠癌细胞HCT116增殖和凋亡的影响#方法将结肠癌 HCT116细胞分为三组，空白组只加入培养血清，阴性对照组转染无义序列，TwistsiRNA转染组#采用qRT-PRC 和 Western blot从基因和蛋白质水平检测干扰质粒对HCT116细胞中Twist和E-cadherin基因的影响# MTT法

检测HCT116细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况#结果 与空白组和阴性对照组相比较，转

染组TwistmRNA与蛋白表达明显受到抑制（P< 0 . 0 5% , E-cadherinmRNA与 蛋白表达升高（P< 0 . 0 5） # MTT检 测，转染组细胞增殖水平明显低于阴性对照组；流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比（56. 1士 0 .5）高于阴性对照

组（44. 1土 0 . 4） （P< 0 . 0 5） #结论Twist负性调节E-cadherin,抑制HCT116细胞在体外的增殖，并促进其凋亡#关键词 RNA干扰； 结直肠癌； 增殖； 凋亡Effect of RNA interference with Twist gene expression on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HCT116Qzan Jiang1 , Zhu Chunli1 , Yang Qinzven1 , Chen Peng1 , Fu Zhongxue2. 1. Department of General Sur­

gery ,Chongqing Dianjiang County Traditional Chinese Medical Hospital, Chongqing 408300 , China. 2. De­partment of General Surgery , Af filiated the First People - s Hospital, Chongqing Medical University , Chongqing

400010 China.Abstract Objective To study the e fect of RNA interference with Twist gene on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cell line HCT116. Methods HCT116 cells were divided into three groups. The blank group was on- lyaddedwithcultureserum.Thenegativecontrolgroup wastransfected withnonsensesequence andthe Twist

siRNA interference group was used. The effects of interfering plasmids on Twist and E-cadherin genes in HCT116 celsweredetectedbyqRT-PRCand westernblot (WB) atgeneandprote2nlevels.MTTassaywasusedtodetect

theprolferat2onofHCT116cels and flow cytometry wasusedtodetectthechangesofapoptotccycle. Results Compared with the blank group and the negative control group , the expression of Twist and E-cadherin in the trans- fecFedgroup wassignificanFlyinhibied (P<0.05) andFheexpressionofE-cadherin wassignificanFlyincreased

(P<0.05).MTTassayshowedFhaFFhecelproliferaionlevelinFheFransfecFedgroupwassignificanlylowerFhan FhaFinFhenegaFiveconFrolgroup andFhepercenFageofG1phasecelsdeFecFedbyflowcyFomeFry (56.1 \\0.5)

washigherFhanFhaFinFhenegaFiveconFrolgroup (44.1\\0.4)(P<0.05). Conclusion TwisFnegaivelyregulaFes

E-cadherin inhibisFheproliferaionofHCT116celsinviroandpromoFesFheirapopFosis.Keywords RNA interference； Colorectal cancer； Proliferation； Apoptosis中图分类号：R735.+ 7 文献标识码：A 文章编号：1000-744X(2019)10-1522-03结直肠癌（CRC）是国内第三常见的恶性肿瘤 疾病，也是世界第四常见的死亡原因%12&。尽管在早 期诊断率、综合治疗的有效性、手术切除率以及术 后存活率方面都有所提高，但根治CRC的方法仍然 有限,结肠癌细胞的侵袭和转移削弱了治疗效果, 导致高死亡率。转移与细胞逐渐失去上皮表型并 获得间充质表型的生物转化过程密切相关，称为上皮一间充质转变（EMT）旧。EMT的特征是上皮表 面标志物，特别是E-钙粘蛋白（E-cadherin）的丢失。

在乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌中EMT是肿瘤进 展的重要步骤之一，是肿瘤细胞侵袭能力增强的必

要条件。我们前期研究也证明了 Twist和Ecad- herin蛋白的表达可能与结直肠癌的发生发展和侵

基金项目！重庆市卫生计生委医学科研计划指导项目（20143074）

袭转移相关，Twist和E-cadherin蛋白表达呈负相 关关系提示，在上皮-间质转化过程中可能是通过抑 制E-cadherin蛋白的表达来实现的⑷。E-cadherin 在胚胎发育和形态发生、细胞增殖、存活、侵袭和迁贵州医 2019 10 43 10期中起重要作用。 通过Twist基因shRNA慢病 达载体转染人结直肠癌HCT116 ，观察在体外 凋亡的影响，为结直肠癌基因靶 。1材料和方法1. 1材料 人结肠癌细胞株HCT116由中科院上海 研究 ,pTracer-CMV/BSD-Twist和pTracer-CMV/BSD质粒来源于重庆医科 大学生科院实验室。上海吉凯基因化学技术 I计 pGenesil-Twist-shRNA、pGenesil-GFP Vector 和 pGenesil-shRNA 三种质粒。成功 粒,DH5# ，从大肠杆菌中提取纯化。DNA 的双 NheI、BsaI、Sad 和EcrI,并且我们进行琼脂 胶电泳以 离的DNA。 均经上海吉凯基因化学技术 。1. 2方法1.2.1 染用含二甲基 (DM -SO)低温保护 温 的 2细胞，参照说明书, 脂质体 Lipo2000 (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA)转染细胞。实验分组为：空白 对照(control)组，阴性 siRNA (negative siRNA)组 TwistsiRNA 转染组。#.2.2 Real-time PCR Twist、E-cadherin 基 因mRNA的表达 5 (Invitrogen)从转染中提取总RNA,采用高容量cDNA(Invitrogen)进行cDNA合成，定量实时PCR JTwist和E-cadherin的 达水平。测定三个基因mRNA的 达，并标准 考基因GAP-DH的表达。引物用于PCR 的引物有：Twist上游弓［物：5 -GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3，；下

物:5 -TCTGGAGGACCTGGTAGAGG 3，； E- cadherin 上游弓 | 物：5 -GTGTCATCCAACGG- GAATGC-3 '，下 物:5 -TGGCGGCATTG- TAGGTGTTC-3 - 光定量实时PCR仪和SYBR选择母体混合液进行40个周期的qPCR扩 ，包括三个 ：变性温度为1 min,引物退火温度为54 C为45 s,延伸温度为72 C为2 min。用 △△Ct法计算mRNA 含量1. 2. 3 Western blot 法 HCT116 结肠癌细胞中Twist、E-cadherin的表达 转染48 h的 在 上在 缓冲液中 30 min。 取的量 应用于十二烷基胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，并转歪(PVDF)膜。在 4 C下，将抗 Twist、抗 E-cadherin 和GAPDH(1 : 1 000 )— 起 。膜是用辣根过氧化物酶(HRP)偶联多克隆抗体(1 : 1 000) 在室温下洗涤 2 h0用Bradford蛋白测定试-1523 -剂盒测定 。1.2.4 MTT法测定HCT116细胞增殖活性 胰数生长期 ，制备浓度为1〜108cells/L单 悬液，96 每孔接种100 %L,基因沉默方 法同前，MTT比色法检测转染后1、2、3、4、5、6和 7 d 性 。1.2.5 术 周期绿色荧光 丨(GFP)编码的DNA质粒在转染后48 h在 光显 IX70下表达绿色荧光。 处于数生长期时，采 法获饕周期。1.2.6统计学方法 采用SPSS 24. 0软件进行统 计分析处理，实验数 布，计量资料以(一士s)表示，采用t检验,P<0.05为差异有统计学

意义。2结果#2. Real-time PCR Twist、E-cadherin 基因的表达 病毒感染HCT116结肠癌 后，通Real-time PCR 可见转染组Twist基因表达明显 于 组 性 组 中 Twist 基因的表达水平，有明显的 作用(P<0.05)(图1)染组 E-cadherin 基因 达明显高于 组性 组 中 E-cadherin 基因的 达水平 (P<0. 05),见图 2。0.8 0.60.2°空白对照组阴性对照组图1 Twist基因沉默在结肠癌 图 2 E-cadherin 基因

HCT116 细胞 Twist mRNA 表达在结肠癌 HCT116E-cadherinmRNA 达2.2 Westernblot Twist 基因在 HCT116 结肠癌 中 达 pGCSIL-GFP-shTwist 慢病 Twist 达的 ，与空载体组 ，转染组Twist 的表达量显' (图3)(P< 0. 0 5)。与 载体组 染组 E-cadherin 的达量显 高( 4)(P< . 5)。2.3转染 的MTT 验结果 HCT116Twist 基因后明显在 染 pGCSIL-GFP-shTwist'且 组 长度较另外两组细胞缓慢，在第4、5、6天与第7天，显 差异(”=3,P< 0. 0 5), 性 组与 组间吸光度值无显著差异(” = 3,P> 0. 0 5)。实验结果表 明，转染pGCSIL-GFP-shTwist慢病毒载体后，对结

肠癌 HCT116 的 长 明显 作 ( 5)。 ・1524・天数（d）图5 转染HCT116细胞Twist基因MTT增殖结果2.4

术 周期 HCT116 周期在Twist基因 后发

，Twist转染组G/G1期 与阴性

组 ，明显增加（P<0. 05）,S期 性 组 ，有所减少，G2/M期

于 组（34.2 士0.6）。上述结果表明：沉默Twist基因能够将细胞

阻滞于G°/G1期' 明显缓慢，见表1）表1三组结肠癌HCT116细胞周期各期百分率比较（J士s）组别G。/ G1SG2/M转染组56. 1 士0. 5a17. 1 士 0 . 2a25. 3 士 0 . 3a性组44. 1 士 0. 425.4士 .534.2士 .6组44. 5 士 0 . 524.3士 .233.7士 .5注：与阴性对照组比较，aP<0. 05。3讨论结直肠癌是世界上最常见的疾病之一，其发病 率呈 上 ％5&。 在病因和病 学存在着差异，但两者都 病生物学 起至关重要 的作用。其中之一就是上皮一 （EMT），它在人体发 中起重要作用，参与结直肠癌的发 发展，在组织 中起重要作用「6&。与EMT的

形 征 ，如：附力丧失、E- 的加%7&。同时， 的 或升高，N- 蛋、波形 、纤维连接 、锌指结构域性 结构域 的上调，同时Twist基因表达与 样 「8&。在基础研究中，这些基因常被作为EMT的标志物，表明 的运性和侵袭性。体外和体内实验研究表明，EMT 在原发性 性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌 [腺癌等恶性肿瘤

发性 中起重要作用。关于Twist基因在诱导 中的作用以及在结肠疾病发病 中的作用的数据在科学 中 [少。因此，本研究选择了与肿瘤进展 的Twist 基 因 。Guizhou Medical Journal,2019 , Vol. 43,No. 10实验在结肠癌HCT116细胞应用RNA 〔

技术，下调Twist基因的表达，shRNA慢病毒载体

染后，结肠癌HCT116 中TwistmRNA | 达量明显 ，E-cadherinmRNA 达量明显 ，说明结直肠癌发生与EMT ，本实验表明，干扰Twist基因 水平 达后可明显 结 肠 癌 的 。 Twist 基 因 后 'HCT116Twist 基 因 后 可在 以G/G1

期 'Twist， 提示基 因 可炎是 起 周期 ' 在 结 肠 癌 的 恶 性中发 重 的作 。总之，从目前的实验结果

，Twist基因的上可促进EMT 件发生，增强肿瘤 的转TwistTwistshRNA 基因 的 达 ' 高 E-cadherin地 HCT116 基 因 的达 ' 进 上 的 ' 结 肠 癌的迁移和侵袭。Twist和E-cadheii n表达在

CRC的发生发展中起着重要作用。Twist和E-

cadherin 在 CRC 中 的

失 可 以 作 后 因癌 靶点，并为下一步的动物实验打下基础。（

3 〜4 见 ）参考文献%1& Arnold M,Sierra MS,Laversanne M,et al. Global pat-

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1420-1428 .%4&钱江,韩佳,陈鹏,等.Twist与E-cadhenn在结直肠癌

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2017353：1-57（收稿日期：2019-07-21）小鼠慢性牙周炎模型中脾脏细胞表面分子及Thl、Th2型细胞因子的检测50M00-I5OH阴性对照图1小鼠脾脏细胞表面分子CDllb表达率RNA干扰Twist基因表达对结直肠癌细胞HCT116增殖和凋亡的影响（正文见第1522页）1 2 3Twist12 3E—cadherinGAPDHGAPDH注：1. Blank control group ； 2. Negative control group ；注:1. Blank control group；. Negative control group；3. Twist siRNA group。3. Twist siRNA group。图3 Twit基因沉默在结肠癌HCT116细胞Twist蛋白表达图4 Twst基因沉默在结肠癌HCT116细胞E-cadherin蛋白表达俯卧位摄片在提高子宫输卵管造影检查效率

及诊断准确率中的观察（正文见第1610页）注:A.右侧输卵管峡部阻塞，左侧输卵管壶腹部积水；B.双侧壶腹部及伞端积水；C.双侧输卵管通畅，盆腔粘连并包裹性积液造影

剂弥散，左侧输卵管峡部阻塞。图1俯卧位造影