药学实践杂志２Ｏ１ ７年３月２５日第３５卷第２期 １２１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２，Ｍａｒｃｈ ２５，２０１７ ・论著・ 缺失错配修复基因ＭＬＨ１的结直肠癌ＨＣＴ一１１６细胞对氟尿嘧啶耐药机 制的研究 王 婧 ，方宏亮 ，黄金路 ，郭 澄 （１．上海交通大学附属第六人民医院，上海２００２３３；２．第二军医大学基础部免疫学教 研室，上海２００４３３） ［摘要］ 目的制。方法研究缺失错配修复基因ＭＬＨ１（ＭｕｔＩ ｈｏｍｏｌｏｇ １）的结直肠癌细胞ＨＣＴ一１１６对氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）耐药机 通过构建ＭＬＨ１缺失的结直肠癌细胞ＨＣＴ一１１６稳定表达ＭＬＨ１细胞株，ＣＣＫ一８试剂检测细胞恢复ＭＬＨ１表达 后对化疗药物５－Ｆｕ耐药性的影响，并通过流式细胞仪检测细胞表面干细胞标志ＣＤ１３３和分化标志ＣＫ２０以及ＣＫ８的表达变 化。结果ＨＣＴ一１１６稳定表达ＭＩ Ｈ１分子后，其对５ Ｆｕ作用的化疗耐受性降低，５－Ｆｕ处理后细胞的活率显著降低（Ｐ＜ 结直肠癌细胞 ０．０１）；流式细胞仪检测结果显示ＣＤ１３３表达显著降低，并伴随细胞分化标志ＣＫ８和ＣＫ２０表达上调。结论缺失错配修复基因ＭＬＨ１引起５－Ｆｕ耐药性可能与其促进肿瘤干细胞样特性密切相关。 ［关键词］结直肠癌；错配修复基因；化疗耐受；ＣＤ１３３ ［中图分类号］Ｒ７３５．３ ［文献标志码］Ａ ［文章编号］ １００６ ０１１１（２０１ ７）０２—０１２１—０５ ［ＯＯＩ］ １０．３９６９／ ．ｉｓｓｎ．１００６—０１１１．２０１７．０２．００６ Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ５－Ｆｕ—ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ＨＣＴ－１ １６ ｃｅｌｌｓ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ 。ＦＡＮＧ Ｈｏｎｇｌｉａｎｇ ，ＨＵＡＮＧ Ｊｉｎｌｕ ，ＧＵＯ Ｃｈｅｎｇ （１．Ｓｉｘｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ ＪｉａｏＴｏｎｇ Ｕ— ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ— ｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ（ＭＭＲ）ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｌｏｒ— ｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ）ＨＣＴ一１１６ ｔｏ ５ ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５ Ｆｕ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭＩ Ｈ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ＨＣＴ一１１６ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｃＤ— ＮＡ３．１－ＭＬＨ１ Ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＬＨ１ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ５－Ｆｕ ｗａｓ ｅｘ— ａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌ１ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ＣＣＫ一８ ｋｉｔｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ ３３（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌ１ ｍａｒｋｅｒ）ａｎｄ ＣＫ８＆ＣＫ２０ （ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｏ ＨＣＴ一１１６ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＨＣＴ一１１６ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ％０．０１）ａｆｔｅｒ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＬＨ１，ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓ— ｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１３３ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ．ｔｈｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ＣＫ８ ａｎｄ ＣＫ２０ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ＨＣＴ一１１ ６ ｃｅ１１ｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＭＬＨ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｏｕｒ ｄａｔａ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＩ Ｈ１ ｗａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕ１ａｔｅｄ ＣＤ１３３ ｓｔｅｍ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ＨＣＴ一１１６ ｗｉｔｈ ＭＬＨ１ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＣＤ１３３ ｓｔｅｍ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＭＭＲ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｕｍｏｒ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈｅｏｒｙ ｔｏ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ５－ＦＵ ｒｅｓｉｓｔ— ａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＭＭＲ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｓ；ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ；ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＣＤ１３３ 结直肠癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ，ＣＲＣ）是最常见的 消化道肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势。我国 结直肠癌发病率已上升至恶性肿瘤的第２位，病死 率居第５位，严重威胁人们的健康和生活质量 。 目前，除了少部分符合手术条件可以局部切除再辅 以放／化疗外，化疗是这类患者的主要治疗手段。随 着对化疗药物的深入研究，新的药物以及不同机制 ［基金项目］ 上海交通大学医学院医院药学科研基金青年项目 （ＪＤＹＸ２０１６ＱＮ００８）；上海交通大学医工交叉研究基金项目 （ＹＧ２０１４ＱＮ０８） 药物的联合应用使肿瘤的化疗不断发展。但是，仍 有相当多种类的肿瘤对化疗药物不敏感，尤其是近 ［作者简介］王婧，硕士，主管药师．研究方向：免疫药理学、临床 药学．Ｔｅｌ：（０２１）２４０５８４４５；Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｅａｒｆｒｉｅｎｄｗａｎｇ＠１６３．ｃｏｒｎ 来不断出现肿瘤细胞原发、继发性耐药以及多药性 耐药。研究肿瘤细胞的耐药机制，以期更好地发挥 化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，成为肿瘤治疗领域 ［通讯作者］郭澄，教授，博士生导师．研究方向：临床药学、抗肿 瘤药物．Ｔｅｌ：（０２１）２４０５８０９８；Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｂｏｓｓ＠ｌ２６．ｃｏｒｎ 药学实践杂志１２２ ２Ｏｌ７年３月２５日第３５卷第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２，Ｍａｒｃｈ ２５，２０ｌ７ 的一个新热点。 为：５ ＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＣＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡ 错配修复基因（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ，ＭＭＲ）是细胞 内负责对碱基错配进行修复的基因，还能修复一些 ＧＧ ３ ，下游引物为：５ ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＣ— ＣＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＴＴ ３ 。ＰＣＲ条件为：９４。Ｃ， ＤＮＡ复制过程中小于４ ｎｔ的核苷酸插入或缺失。 目前已发现的ＭＭＲ基因包括ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、 ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５、ＭＳＨ６等。ＭＭＲ缺失不仅 导致了结直肠癌的发生和发展，而且与结直肠癌的 临床疗效密切相关 ］。ＭＭＲ具有识别ＤＮＡ损伤 并诱导细胞凋亡的功能，因此，该蛋白的表达情况影 响着肿瘤细胞对一些化疗药物，尤其是致ＤＮＡ损 伤的化疗药物的敏感性。体外研究表明，与正常细 胞相比，以５一氟尿嘧啶（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，５ Ｆｕ）处理 ＭＩ Ｈ１缺失结肠癌细胞系明显产生耐药性。其机 制可能在于５－Ｆｕ能够直接作用于ＤＮＡ，造成细胞 非致死性损伤时，ＭＭＲ正常者竭力修复损伤；当无 法修复时，细胞周期就会停滞，导致凋亡。而 ＭＬＨ１缺失者识别ＤＮＡ损伤的能力弱，无法产生 触发细胞凋亡的信号。多数临床回顾性统计也表 明，ＭＭＲ缺失的结直肠癌患者，无法从以５一Ｆｕ为 基础的辅助治疗方案中获益。因此，自２０１１年起， 每一版《ＮＣＣＮ结直肠癌临床实践指南》对于ＭＭＲ 缺失的患者不建议使用５一Ｆｕ类药物，但目前转移性 结直肠癌的一线化疗方案中，５－Ｆｕ仍是主要的化疗 药物之一［６］。因此，研究ＭＭＲ缺失的结直肠癌的 化疗耐药性机制，并通过相关干预治疗，提高ＭＭＲ 缺失患者的临床疗效成为重要的研究方向。 ｌ材料与方法 １．１ 材料 人结直肠癌细胞系ＨＣＴ一１１６购自中 国科学院细胞库；５ Ｆｕ、遗传霉素（Ｇ４１８，德国Ｓｉｇ— ｍａ公司）；转染试剂ＪｅｔＰｅｉ（美国Ｐｏｌｙｐｌｕｓ公司）； ＭＩ Ｈ１过表达质粒ｐｅＤＮＡ３．１－ＭＬＨ１（北京Ｏｒｉｇ— ｅｎｅ公司）；一抗兔抗人ＭＩ Ｈ１单克隆抗体、小鼠抗 人细胞角蛋白（ＣＫ８）单克隆抗体和小鼠抗人肌动蛋 白（Ｂ—Ａｃｔｉｎ）单克隆抗体（美国Ａｂｃａｍ公司）；抗兔 或抗鼠二抗（美国ＣＳＴ公司）；ＰＥ标记的抗人 ＣＤ１３３的流式抗体（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）；ＰＥ标记 抗人ＣＫ８流式抗体、ＣＫ２０流式抗体（美国ＢＤ公 司）；增强型化学发光（ＥＣＬ）试剂盒（美国Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ公司）；细胞活性ＣＣＫ一８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ一 ８）检测试剂盒（日本Ｄｏｊｉｎｄｏ公司）。 １．２ 方法 １．２．１ ＰＣＲ检测ＭＬＨ１重组质粒 以商业化重 组质粒ｐｃＤＮＡ３．１一ＭＩ Ｈ１为模板，聚合酶链式反应 （ＰＣＲ）检测ＭＬＨ１序列是否正确表达。上游引物 ３０ Ｓ；５２。Ｃ，３０ Ｓ；７２℃，１ ｍｉｎ；循环数：３０个。最后 一轮循环结束后，７２℃反应１０ ｍｉｎ，使产物充分扩 增。扩增后的ＰＣＲ产物通过ＤＮＡ琼脂糖凝胶电 泳检测片段的长度。 １．２．２重组质粒转染ＨＣＴ一１１６细胞建立稳定表 达细胞株 采用Ｐｏｌｙｐｉｕｓ公司的ＪｅｔＰｅｉ转染试剂 将ｐｃＤＮＡ３．１一ＭＬＨ１转染至ＨＣＴ １１６细胞内，取 转染２４ ｈ后稀释至单细胞传代。同时向ＭｃＣＯＹ Ｓ ５Ａ培养基中加入终浓度为６００ ｎｇ／ｍｌ的Ｇ４１８筛 选液，每３ ｄ更换一次新鲜的含Ｇ４１８培养基，１周 之后观察有无单克隆细胞团形成。挑出每个单克隆 细胞团，再分别逐渐扩大培养，４周后检测经过 ６００ ｎｇ／ｍｌ的Ｇ４１８筛选后的ＨＣＴ—ｌ１６细胞ＭＩ Ｈ１ 表达情况。 １．２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测蛋白表达 取对数生长 期的细胞，进行蛋白提取，ＢＣＡ法测定细胞裂解物 的蛋白含量，取等量蛋白质以１２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ法 分离，并转移至ＰＶＤＦ膜上，加单克隆抗体于４℃ 下过夜孵育，以检测目标蛋白。洗去一抗，以ＨＲＰ 连接的二抗于室温孵育２ ｈ，洗涤后以ＥＣＩ 试剂盒 显示免疫印迹条带，以￣－ａｃｔｉｎ作为内参。 １．２．４ 流式细胞仪检测细胞ＣＤ１３３、ＣＫ８、ＣＫ２０ 的表达收取待测细胞，离心去上清液。混匀细胞， 加入荧光标记的抗体，４℃孵育３０ ｍｉｎ。ＰＢＳ洗２ 次，用３００ ｌ ＰＢＳ重悬，再用流式细胞仪（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ公司）检测，实验数据采用ＦｌｏｗＪｏ软件 分析。 １．２．５ ＣＣＫ８检测化疗药物处理后的细胞活性 ９６孔板每孔加入５×１０ ／１００ ｌ，于３７℃浮箱培养 过夜使细胞贴壁后，加入０、１０、２０、５０、１００“ｇ／ｍｌ ５一 Ｆｕ作用２４ ｈ，再向孔中加入ｌＯ肚ｌ的ＣＣＫ ８试剂， 在细胞培养箱中继续孵育４ ｈ，再用酶标仪检测，设 置检测波长４５０ ｎｍ，参考波长６３０ ｎｍ（Ａ）。每组设 ３个复孔为实验组，同时设空白溶剂组以及阴性对 照组。 细胞存活率（ ）＝＝＝（实验组Ａ值）／（阴性对照 组Ａ值）×１００ 。 １．２．６统计学方法 采用ＳＰＳＳ１７．０软件处理分 析实验数据。数据以（． ±ｓ）表示，多组间单因素比 较先用单因素分析其正态分布，再以ＬＳＤ法进行统 计。以Ｐ％０．０５为差异有统计学意义。 药学实践杂志２０１７年３月２５日第３５卷第２期 １２３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２，Ｍａｒｃｈ ２５，２０１７ ２ 结果 ２．１ 重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＭＬＨ１的ＰＣＲ鉴 定我们以商业化的重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＭＬＨ１ 为模板，ＰＣＲ检测ＭＩ Ｈ１序列是否正确表达。凝 胶电泳的结果显示，在分子量２ ０００ ０００上方能明显 看到ＭＬＨ１的条带，测序结果也显示ＭＬＨ１正确 插入至表达载体中（图１）。 分子量 ２ ０００ ０００ １ ０００ ０００ ７５０ ０００ ５００ ０００ ２００ ０００ １００ ０００ 图ｌ重组表达质粒ｐｃ∞∞∞∞ ＤＮＡ３．１－０ ＭＬＨ１的ＰＣＲ鉴定 ２．２ ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１稳定表达细胞株的验证 Ｇ４１８药物筛选４周后，选取状态好的克隆株，采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测细胞中的ＭＬＨ１表达情况。结 果如图２所示，我们在对照组ＨＣＴ一１ｌ６ＣＴＲ中，没 有检测到ＭＬＨ１的表达，表明ＨＣＴ一１１６是ＭＬＨ１ 缺失的结直肠癌细胞株；而在筛选的克隆株ＨＣＴ一 １１６ＭＬＨ１组中，明显可以看到ＭＩ Ｈ１的表达条 带，表明ＨＣＴ一１１６稳定表达ＭＬＨ１的细胞株构建 成功。 ＭＬＨ１ ￣－ａｅｔｉｎ 图２ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ检测ＨＣＴ－ ＩＩ６ＭＬＨ１细胞ＭＬＨ１表达 ２．３ ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１稳定表达株对化疗药物５－Ｆｕ 作用的影响 筛选出稳定表达ＭＬＨ１的ＨＣＴ一 １１６ＭＬＨ１细胞株后，进一步检测ＭＬＨ１的表达对 ５一Ｆｕ作用的影响。ＨＣＴ—ｌ１６ＭＬＨ１细胞和ＨＣＴ一 １１６ＣＴＲ细胞（对照）分别给予不同浓度５－Ｆｕ作用 ４８ ｈ后，ＣＣＫ一８试剂盒检测细胞的活率。结果如图 ３所示，经过１０、２Ｏ、５０和１００／￣ｇ／ｍｌ ５－Ｆｕ处理２４ ｈ 后，各组ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１细胞的活率都显著低于对 照组ＨＣＴ一１１６ＣＴＲ细胞（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），提 示ＨＣＴ １１６细胞稳定表达ＭＬＨ１后，细胞对５－Ｆｕ 的耐药性显著降低。 琶 褂 蜒 墓 器 ０ １０ ２０ ５０ １００ 浓度（ｐ ／ｕｇ‘ｍｌ ） 图３ ＣＣＫ一８检测５－Ｆｕ对细胞活性的影响 （Ｔ±ｓ，ｎ一３） Ｐ＜０．０５，一Ｐ＜０．０ｌ， 与ＨＣＴ－１１６ＣＴＲ细胞比较 ２．４ ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１细胞中肿瘤干细胞标志 ＣＤ１３３表达的检测ＨＣＴ １１６细胞高表达肿瘤干 细胞标志ＣＤ１３３已有报道［７］，但ＭＬＨ１缺失的 ＨＣＴ一１１６细胞稳定表达ＭＬＨ１分子后，通过恢复 其基因错配修复的功能，发现其对５一Ｆｕ耐受受到明 显抑制，故进一步通过流式细胞仪（ＦＡＣＳ）检测细 胞表面ＣＤ１３３的表达。结果如图４所示，对照组 ＨＣＴ一１１６ＣＴＲ细胞表面的ＣＤ１３３的表达率为 ９６．１ ，而ＨｃＴ—ｌ１６ＭＬＨ１组细胞表面的ＣＤ１３３ 的表达率为３７．２ ，ＣＤ１３３的表达下调。 ２．５ ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１细胞中分化标志ＣＫ８和 ＣＫ２０表达的检测 ＣＤ１３３的表达与细胞的肿瘤干 细胞特性密切相关，发现ＨＣＴ一１１６稳定表达 ＭＬＨ１细胞的ＣＤ１３３表达显著降低后，进一步检测 ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１细胞表面分化标志ＣＫ８和ＣＫ２０ 的表达情况。结果如图５所示，对照组ＨＣＴ一 １１６ＣＴＲ细胞的ＣＫ８的表达率为３．０ ，ＣＫ２０的 表达率为０．８ ；ＨＣＴ一１１６ＭＬＨ１细胞表面的ＣＫ８ 的表达率为５．９ ，ＣＫ２０的表达率为２．６ ，细胞 表面ｃＫ８与ＣＫ２０的表达出现上调，提示ＨＣＴ一１１６ 细胞稳定表达ＭＬＨ１恢复其ＭＭＲ的功能后，分化 程度增强。 ３讨论 据现有的临床统计结果估计，有１５ ～２０ 的 结直肠癌患者存在着ＭＭＲ的表达缺失。在散发性 结直肠癌中，ＭＭＲ缺失的发生主要与ＭＬＨ１ （ＭｕｔＬ ｈｏｍｏｌｏｇ １）的启动子的高甲基化而不表达 相关，ＭＬＨ１缺失患者占ＭＭＲ缺失患者的９５ 以 上 ］。Ｔａｖｅｒｎａ等筛查了６Ｏ余种肿瘤细胞中 ＭＭＲ基因的表达情况，发现ＨＣＴ一１１６细胞完全缺 失ＭＬＨ１的表达，且和化疗药物的耐受密切相关。 药学实践杂志２０１７年３月２５日第３５卷第２期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２，Ｍａｒｃｈ ２５，２０ｌ ７ ＨＣＴ １１６ ＣＴＲ 臣 糯 ３７． ０ Ｉ－ ， ＨＣＴ １１６ ＭＬＨ１ ’ Ｑ４ 图４流式细胞仪检测ＨＣＴ－１１６ＭＬＨＩ细胞ＣＤ１３３的表达 ＨＣＴ Ｉ１６ ＣＴＲ 山 懈 ＨＣＴ—Ｉ１６ ＭＬＨＩ 图５ 流式细胞仪检测ＨＣＴ—ｌｌ６ＭＬＨ１细胞ＣＫ８和ＣＫ２０的表达 我们的研究结果发现，ＨＣＴ一１１６细胞缺失错配修复 基因ＭＩ Ｈ１的表达，这与文献报道的结果一致ｌ＿８ 。 点 ’ 。ＣＤ１３３是肿瘤干细胞重要的表面分子标志 物之一，２００７年Ｎａｔｕｒｅ同时报道了两篇在结直肠 癌中发现ＣＤ１３３ 肿瘤干细胞的文章，引起广泛关 本研究选择该细胞作为研究对象，细胞转染了重组 质粒ｐｃＤＮＡ３．１－ＭＩ Ｈ１后，通过筛选构建了稳定表 达ＭＩ Ｈ１细胞系，比较研究５－Ｆｕ抑制稳定表达 ＭＨＩ １的ＨＣＴ一１１６细胞和对照组ＨＣＴ－１６细胞的 注 “ Ｊ。ＣＤ１３３肿瘤干细胞由于具有低分化和自 我更新于细胞的特性，其对化疗或放疗都具有抵抗 性。Ｄａｌｌａｓ等＿１ 通过高剂量的５－Ｆｕ处理结直肠癌 细胞ＨＣＴ一１１６筛选出化疗耐受的细胞。发现这些 差别。结果发现，经过不同浓度５ Ｆｕ作用后，稳定 表达ＭＩ Ｈ１的ＨＣＴ一１１６细胞的活率显著低于对照 ＨＣＴ—ｌ１６细胞，说明错配修复基因ＭＩ Ｈ１表达缺 失与细胞对化疗药物５－Ｆｕ的耐药性之间密切相关。 肿瘤干细胞是指肿瘤细胞中存在的－ｄ，部分亚 群，这种细胞具有类似干细胞的特征。例如，肿瘤干 细胞具有分化程度低、无限增殖和高致瘤性等特 细胞表面的ＣＤ１３３表达量增加了约１６倍。Ｍａ 等［１ 从人肝癌细胞中分离出ＣＤ１３３ 细胞，发现在 相同浓度的５－Ｆｕ作用下，其细胞活性要显著高于 ＣＤ１３３一细胞。Ｙａｓｕｄａ等¨】朝研究了直肠癌患者放／ 化疗后残存肿瘤细胞中ＣＤ１３３的表达水平，发现残 存肿瘤细胞中ＣＤ１３３表达水平明显高于癌旁的间 药学实践杂志２０１７年３月２５日第３５卷第２期 １２５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．２，Ｍａｒｃｈ ２５．２０１７ 质细胞，并且放／化疗后ＣＤ１３３表达水平增高的患 者无进展生存期（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ—ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ，ＰＦＳ） 明显缩短。 株干细胞ＣＤ１３３ 的影响［Ｊ］．上海交通大学学报（医学版）， ２Ｏｌ６，３６（２）：１６卜１６５． ｕ Ｌ，Ｈａｎｓｏｎ ＡＪ，ｅｔ ｎ ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ 。ｆ Ｅ８］ Ｔａｖｅｒｎａ Ｐ，ＬｉＭＬＨ １ ａｎｄ ＭＳＨ２ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ 目前多数临床回顾性统计结果表明，错配修复 基因缺失的这部分结直肠癌患者，对以５一Ｆｕ为基础 ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０００，４６（６）：５０７ ５１ ６． 的化疗产生耐药性，但具体机制尚不明确Ｅ１６，１ ７３。本 研究发现，ＨＣＴ一１１６细胞稳定表达ＭＬＨ１后，肿瘤 干细胞特异性表达标志物ＣＤ１３３的表达显著降低， ［９］ Ｒｏｓｅｎ ＪＭ，Ｊｏｒｄａｎ ＣＴ．Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｅ— ｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐａｒａｄｉｇｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２４（５９３５）：１６７０— １６７３． ＳＳ，Ｇｒａｈａｍ ＴＡ，Ｗｒｉｇｈｔ ＮＡ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉ— ［１Ｏ］ Ｚｅｋｉ并伴随细胞分化标志物ＣＫ８和ＣＫ２０表达上调，说 明ＭＬＨ１表达降低了ＨＣＴ一１１６细胞的“肿瘤干细 胞样”特性，并抑制了ＨＣＴ—ｌ１６细胞对５ Ｆｕ产生的 ｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａ— ｔｏｌ，２０ｌ１，８（２）：９０—１ＯＯ． ｅｎ ＣＡ，Ｐｏｌｌｅｔｔ Ａ，Ｇａｌｌｉｎｇｅｒ Ｓ，ｅｔ＆Ｚ．Ａ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ［１１］ Ｏ Ｂｒｉｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉ— 化疗耐受。该结果提示结直肠癌细胞缺失错配修复 基因ＭＬＨ１引起５一Ｆｕ的耐药性可能与其促进肿瘤 干细胞样特性密切相关。本研究为阐释错配修复基 ［１２］ ｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４５（７１２３）：１０６一ｌ１Ｏ． Ｒｉｃｃｉ—Ｖｉｔｉａｎｉ Ｉ ，Ｉ ｏｍｂａｒｄｉ ＤＧ，Ｐｉｌｏｚｚｉ Ｅ，ｅｔ ｄｆ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ—ｃａｎｃｅｒ—ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａ ｔｕｒｅ，２００６，４４５（７１２３）：１１１ １１５． 因缺失结直肠癌患者对化疗药物５一Ｆｕ的耐药机制 提供了理论基础。 【参考文献】 ［１］ Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｈ，Ｋｌｏｏｒ Ｍ，Ｐｏｘ ＣＰ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ， ２Ｏ１４，３８３（９９２７）：ｌ４９Ｏ一１５Ｏ２． ［１３］ Ｄａｌｉａｓ ＮＡ，Ｘｉａ Ｉ ，Ｆａｎ Ｆ，ｅｔ ｄＺ．Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｉｌｓ，ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９，６９（５）：ｌ９５１－１９５７． ［１４］ Ｍａ Ｓ，Ｌｅｅ ＴＫ，Ｚｈｅｎｇ ＢＪ，ｅｔ ａ ．ＣＤ１３３ ＨＣＣ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｆｅｒ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ２］ Ｃｈｅｎ Ｑ，Ｉ ｉｕ Ｚ，Ｃｈｅｎｇ Ｉ ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，２００３～２ｏｏ７［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，２ｌ（３）：１７９一ｌ８２． Ａｋｔ／ＰＫＢ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７（１２）： １ ７４９－１７５８． ［１５］ Ｙａｓｕｄａ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｋ，Ｓａｉｇｕｓａ Ｓ，ｅｔ ｄ ．Ｅｌｅｖａｔｅｄ ＣＤ１３３，ｂｕｔ ｎｏｔ ＶＥＧＦ ｏｒ ＥＧＦＲ．ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｃｕｒ— ｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ Ｅ３］ Ｈｓｉｅｈ Ｐ，Ｙａｍａｎｅ Ｋ．ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ！ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈ— ａｎｉｓｍ，ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ，２００８，１２９（７ ８）：３９ｌ一４Ｏ７． ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２００９，２２（４）：７０９ ７１７． ｎｉｃｒｏｐｅ ＦＡ，Ｍａｈｏｎｅｙ ＭＲ，Ｓｍｙｒｋ ＴＣ，ｅｔ ｎｆ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍ— ［１６］ Ｓｉｐａｃｔ ｏｆ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ｓｈ Ｍ，Ｌｏｒｄ ＣＪ，Ｍａｒｔｉｎ ＳＡ，ｅｔ＆ ．Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｔ— Ｅ４３ Ｈｅｗｉｃｉｅｎｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１０，７（４）：１９７—２０８． ［５］ Ｓｉｎｉｃｒｏｐｅ ＦＡ．ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ａｄｊ ｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ａｐｙ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１０，７ （３）：１７４—１７７． ＩＩＩ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｆｒｏｍ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＦＯＬＦＯＸ——ｂａｓｅｄ ａｄ—— ｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１３，３ｌ（２９）：３６６４— ３６７２． ＤＪ，Ｍａｒｓｏｎｉ Ｓ，Ｍｏｎｇｅｓ Ｇ，ｅｔ ｄ ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ［１ ７］ Ｓａｒｇｅｎｔｒｅｐａｉｒ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｌａｃｋ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｆｌｕｏｒｏｕｒａ— Ｅ６］ Ｂｏｌａｎｄ ＧＭ，Ｃｈａｎｇ ＧＪ，Ｈａｙｎｅｓ ＡＢ，ｅｔ ａ１．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｔｒｅａｔ ｍｅｎｔ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｎ ｃｉｌ—ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２０１０，２８（２０）：３２１９－３２２６． ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ，２０ｌ３，１１９（８）：ｌ５９３ ｌ６Ｏ１． ｒ－７］ 祝利民，沈克平，周浩，等．胃肠安及四藤方对人结肠癌细胞 ［收稿日期］２Ｏｌ６—１Ｏ一２８［修回日期］２Ｏ１７ ０卜Ｏ９ ［本文编辑］李睿曼 （上接第１２Ｏ页） ［ｉｏ］Ｎｅｔｚｅｒ Ｎ，Ｓｔｒｏｈｌ Ｋ，Ｆａｕｌｈａｂｅｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｈｙｐｏｘｉａ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｌｔｉ— ｒｔｓｃｈｉｎｋ Ｐ，ＫｒｅｋＷ．Ｈｙｐｏｘｉａ—ｄｒｉｖｅｎ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏ— ［１３］ Ｍｉｌｙｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｓ：Ｐｉｖｏｔａｌ ｔｏ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓ— ｔｕｄｅ ｉｌｌｎｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｔｒａｖｅｌ Ｍｅｄ，２０１３，２０（４）：２４７ ２５５． ［１１］ｌｍｒａｙ Ｃ，Ｗｒｉｇｈｔ Ａ，Ｓｕｂｕｄｈｉ Ａ，ｅｔ ｎｚ．Ａｃｕｔｅ ｍｏｕｎｔａｉｎ ｓｉｃｋ— ｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０１６，２（１１）：１８２２—１８２８． ［１４］ 马慧萍，何蕾，王昕，等．藏紫菀总黄酮对模拟高原缺氧小 ｎｅｓｓ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ。ｇｙ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓ，２０１０，５２（６）：４６７—４８４． 鼠的保护作用［Ｊ］．医药杂志，２Ｏｌ６，２８（６）：１—４． ［１５］ 景临林，马慧萍，樊鹏程．矮垂头菊乙醇提取物的体外自由基 清除活性及其对高原缺氧小鼠的保护作用研究［Ｊ］．天然产物 研究与开发，２ｏ１５，２７：１８ｌ５－１８２０． ［１２］Ｃｏｌｌｉｅｒ ＤＪ，Ｗｏｌｆｆ ＣＢ，Ｈｅｄｇｅｓ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｎｚｏｌａｍｉｄｅ ｉｍ— ｐｒｏｖｅｓ ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｕｔｅ ｍｏｕｎｔａｉｎ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｄｕｒ— ｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ—ａｌｔｉｔｕｄｅ ｔｒｅｋ ａｎｄ ｈａｓ ｆｅｗｅｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｔｈａｎ ａｃ— ［收稿日期］２０１６—１１ １４［修回日期］２０１６—１２—０７ ［本文编辑］李睿曼 ｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ ａｔ ｓｅａ ｌｅｖｅｌ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，２０１ ６，４ （３）：１ １２．
