基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110951921 A(43)申请公布日 2020.04.03

(21)申请号 201911378844.9(22)申请日 2019.12.27

(71)申请人 苏州药明检测检验有限责任公司

地址 215104 江苏省苏州市吴中经济开发

区吴中大道北侧(72)发明人 董元舒　刘存昌　苏财忠　童涌　(74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限

公司 31211

代理人 郑权(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书2页 说明书5页序列表2页 附图1页

(54)发明名称

基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法(57)摘要

本发明基于实时荧光PCR技术提供一种检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法。引物和探针由两组，第一组：模板1，如SEQ ID NO:7所示；正向引物1，如SEQ ID NO:1所示；逆向引物1，如SEQ ID NO:2所示；探针1，如SEQ ID NO:5所示；第二组：模板2，如SEQ ID NO:8所示；正向引物2，如SEQ ID NO:3所示；逆向引物2，如SEQ ID NO:4所示；探针2，如SEQ ID NO:6所示。本发明针对所有不同类型人细小病毒B19，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

CN 110951921 ACN 110951921 A

权　利　要　求　书

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1.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物组合，其特征在于，包括：正向引物1：如SEQ ID NO:1所示，逆向引物1：如SEQ ID NO:2所示；正向引物2：如SEQ ID NO:3所示，逆向引物2：如SEQ ID NO:4所示。

2.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针组合，其特征在于，包括：探针1：如SEQ ID NO:5所示；探针2：如SEQ ID NO:6所示。

3.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针及引物的组合，其特征在于，包括：

正向引物1：如SEQ ID NO:1所示，逆向引物1：如SEQ ID NO:2所示；正向引物2：如SEQ ID NO:3所示，逆向引物2：如SEQ ID NO:4所示；探针1：如SEQ ID NO:5所示；探针2：如SEQ ID NO:6所示。

4.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物为：

正向引物1：如SEQ ID NO:1所示，逆向引物1：如SEQ ID NO:2所示；正向引物2：如SEQ ID NO:3所示，逆向引物2：如SEQ ID NO:4所示；所述探针为：探针1：如SEQ ID NO:5所示；探针2：如SEQ ID NO:6所示。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预混液，所述预混液优选为TaqMan Universal Master Mix。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括作为检测时的背景DNA使用的HEK293细胞基因组DNA。

8.一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的反应体系，所述反应体系包括以下成分：

预混液：TaqMan Universal Master Mix(2×)；正向引物：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示；逆向引物：如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示；探针：如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；模板：如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。9.如权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述模板是以质粒的形式存在。

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权　利　要　求　书

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10.如权利要求9所述的反应体系，其特征在于，所述质粒包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的模板靶序列。

11.一种非诊断目的的基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的方法，其特征在于，包括步骤：

1)提取待测样品总DNA；2)制备反应体系，包括预混液、引物、探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和逆向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，所述逆向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

3)将模板梯度稀释制成标准曲线样品；所述模板如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；4)试剂的阴性对照、待测样品的阳性对照以及加入了标准品的待测样品上样；5)QPCR反应；

6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，将两组引物探针放入一个反应管中。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，标准样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：Step1：95℃，10min；Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；Step2执行40cycles。

16.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法用于细胞库中的B19病毒污染检测。

17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，或用于生物制品大批量生产的质控检测。

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说　明　书

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基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂

盒及方法

技术领域

[0001]本发明所属生物检测领域，是运用体外核酸检测法检测生物制品中的病毒污染，特别是涉及一种利用实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法。背景技术

[0002]人细小病毒B19(Human Parvovirus B19)是一种能够引起人类多种疾病的非脂包膜单链DNA病毒，属于细小病毒科红病毒属。该病毒主要通过呼吸道分泌物、血液以及血液制品的方式进行传播。人群感染率高达60％-70％以上。孕妇感染该病毒时，易造成胎儿水肿和先天性贫血，严重时导致胎儿死亡；儿童感染该病毒时，会出现慢性溶血性贫血或传染性红斑。近年来大量研究表明诸如关节炎、肝炎、心肌炎、以及脑炎(尤其是儿童脑炎)等疾病可能与B19感染有关。B19病毒体积较小、无囊膜包裹、抵抗力较强，生物制品生产过程中的病毒清除工艺不能有效的将之清除，因而B19在生物制品中污染的可能性较高。为减少B19病毒对生物制品的污染，FDA指导原则要求人源细胞用于生物制品的生产时必须进行B19病毒的检测。生物制药公司非常需要一种具有良好专一性、灵敏性并能覆盖所有B19品系的检测方法。

[0003]B19病毒的检测方法很多，主要包括抗体检测技术、抗原检测技术以及核酸检测技术。抗体检测技术不适用于培养细胞的检测；抗原检测技术检测灵敏度较低。核酸检测技术适用范围广，且灵敏度较高，是B19检测的一种较好的选择。该检测技术主要包括核酸分子检测技术和核酸分子扩增检测技术两种。目前，常用的核酸检测技术为实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法。该方法指在PCR扩增过程中，通过荧光信号的强弱，对PCR产物进行实时检测，从而快速、高效、准确的检测出B19基因组DNA。检测生物制品中的B19病毒的方法需要尽可能多地覆盖B19的变异株。

[0004]目前已报道的B19病毒qPCR检测方法均不能保证覆盖所有类型的B19，覆盖范围不足，用于B19病毒检测时易漏检，准确性低，结果可信度低。发明内容

[0005]本发明所要解决的技术问题在于，提供一种覆盖范围广的检测B19病毒的qPCR检测方法，其能够覆盖所有类型的B19，具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点，特别适用于细胞库中的B19病毒污染的检测以及生物制品大批量生产的繁复的质控检测。

[0006]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物组合，包括：[0007]正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQ ID NO:1所示)，[0008]逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQ ID NO:2所示)；[0009]正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQ ID NO:3所示)，

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逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQ ID NO:4所示)。

[0011]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针组合，包括：[0012]探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQ ID NO:5所示)；[0013]探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQ ID NO:6所示)。[0014]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的QPCR模板，包括：[0015]模板1：5’-GTGGTG GTGAAAGCTC TGAAGAACTC AGTGAAAGCA GCTTTTTCAACCTCATCACTCCAGGCGCCT GGAACAGTGA AACCCCGCGC TCTAGTACAC[0016]CCGTCCCCGGGACCAGTTCA GGAGAATCAT TTGTCGGAAG CCCAGTTTCCT-3’(如SEQ ID NO:7所示)；[0017]模板2：5’-GCTGATGTACAACAGTGGCTTACATGGTGTAATGCACAAAGCTGGGACCA

[0018]CTATGAAAACTGGGCAATAAACTACACTTTTGATTTCCCTGGAATTAATGCAGATGCCCTCC ACCCAGACCTCCAAACCACC CCAATTGTCACAGACAC-3’(如SEQ ID NO:8所示)。[0019]本发明中提供的前述QPCR模板、引物、探针可相对应的分为两组：[0020]第一组：模板1，如SEQ ID NO:7所示；正向引物1，如SEQ ID NO:1所示；逆向引物1，如SEQ ID NO:2所示；探针1，如SEQ ID NO:5所示；[0021]第一组：模板2，如SEQ ID NO:8所示；正向引物2，如SEQ ID NO:3所示；逆向引物2，如SEQ ID NO:4所示；探针2，如SEQ ID NO:6所示。

[0022]本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的探针及引物的组合，包括：

[0023]正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQ ID NO:1所示)，[0024]逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQ ID NO:2所示)；[0025]正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQ ID NO:3所示)，[0026]逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQ ID NO:4所示)；[0027]探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQ ID NO:5所示)；[0028]探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQ ID NO:6所示)。

[0029]本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物为：[0030]正向引物1：GTGGTGGTGAAAGCTCTGAA(如SEQ ID NO:1所示)，[0031]逆向引物1：AGGAAACTGGGCTTCCGACA(如SEQ ID NO:2所示)；[0032]正向引物2：GCTGATGTACAACAGTGGCT(如SEQ ID NO:3所示)，[0033]逆向引物2：GTGTCTGTGACAATTGGGGT(如SEQ ID NO:4所示)；[0034]所述探针为：[0035]探针1：TCCCCGGGACCAGTTCAGGAGAATC(如SEQ ID NO:5所示)；[0036]探针2：TGCAGATGCCCTCCACCCAGACCT(如SEQ ID NO:6所示)。[0037]具体的，所述试剂盒还包括预混液。所述预混液优选为TaqMan Universal Master Mix。

[0038]具体的，所述试剂盒还包括QPCR模板。所述QPCR模板如SEQ ID NO:7和/或SEQ ID 

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NO:8所示。

[0039]具体的，所述试剂盒还包括HEK293细胞基因组DNA，可作为检测时的背景DNA使用。[0040]本发明提供一种基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的反应体系，所述反应体系包括以下成分：[0041]预混液：TaqMan Universal Master Mix(2×)；[0042]正向引物：如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示；[0043]逆向引物：如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示；[0044]探针：如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；[0045]模板：如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。[0046]具体的，所述模板是以质粒的形式存在。所述质粒包含如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的模板靶序列。所述质粒使用时经梯度稀释后成为每5μl含有1x105,1x104,1x103,1x102及10个靶序列拷贝的标准样品。[0047]具体的，在干扰实验中，0.5μg HEK293细胞基因组DNA作为背景DNA加入反应体系中。

[0048]本发明还提供基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的方法，包括步骤：[0049]1)提取待测样品总DNA；可将总DNA的浓度调整为0.1μg/μL；[0050]2)制备反应体系，包括预混液、引物、探针；所述预混液为TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和逆向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，所述逆向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；[0051]3)将模板梯度稀释制成标准曲线样品；所述模板如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；

[0052]4)试剂的阴性对照、待测样品的阴性对照以及加入了标准品的待测样品上样；[0053]5)QPCR反应；

[0054]6)绘制标准曲线，分析待测样品的检测结果。[0055]具体的，所述步骤2)中，将两组引物探针放入一个反应管中。[0056]具体的，所述步骤3)中，标准样品的浓度梯度为每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝。[0057]具体的，所述步骤5)中，采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应。[0058]具体的，所述步骤5)中，QPCR反应程序为：[0059]Step1：95℃，10min；[0060]Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；[0061]Step2执行40cycles。[0062]具体的，所述方法用于细胞库中的B19病毒污染检测，或用于生物制品大批量生产的质控检测。

[0063]本方法通过对NCBI数据库中所有B19分离株(共25个)的基因组DNA做同源性比对，设计出2组实时定量PCR的正逆向引物以及探针，能够高效、准确的检测出所有类型的B19DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的B19病毒污染。

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本发明提供的引物、探针、模板及试剂盒能够检测出NCBI数据库中现有的所有B19

病毒分离株的基因组DNA.这同时也说明我们选择的扩增检测区域是B19基因组中非常保守的区域，将来新出现的变异株被该方法检测到的几率很高。

[0065]本发明的检测方法可以将两组引物探针放入一个反应管中，将原本两个反应的工作量减少为一个反应，降低了人工和物料成本，减少了样品使用量。[0066]本发明的引物、探针、模板、试剂盒及检测方法可以检测出低至10个病毒基因组拷贝(附图1-2)，而目前已有的方法检测低限在100-1000个拷贝。本发明的试剂盒及检测方法的高灵敏度能够更好地保证生物制品的安全性。

[0067]细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染。用PCR方法做检测时，检测样本DNA中也包含大量的细胞DNA与微量的病毒DNA(如果病毒污染存在)。大量的细胞DNA常常会抑制PCR反应。本发明的试剂盒及检测方法检测不被细胞基因组DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染。

附图说明

[0068]图1为分别用一组引物探针及两组引物探针扩增模板1的扩增曲线图。图中数字(10-105)为模板拷贝数；结果表示检测体系可检测到10拷贝的模板1；两组引物探针在同一个反应管中不影响检测灵敏度。

[0069]图2为分别用一组引物探针及两组引物探针扩增模板2的扩增曲线图。图中数字(10-105)为模板拷贝数；结果表示检测体系可检测到10拷贝的模板2；两组引物探针在同一个反应管中不影响检测灵敏度。

具体实施方式

[0070]下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0071]1.取1x107 HEK293细胞，5000rpm离心5分钟收集细胞。[0072]2.用0.5mL PBS重悬细胞。用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit提取细胞DNA。

[0073]3.用Nanodrop检测DNA OD260及OD280吸收值，计算细胞DNA浓度，并将浓度调整为0.1μg/μL

[0074]4.梯度稀释DNA模板1及模板2至每5μl含有1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝

[0075]5.制备反应体系，包括：[0076]TaqMan Universal Master Mix预混液(终浓度1x)[0077]正向引物1或/和2(每种终浓度0.5μM)[0078]反向引物1或/和2(每种终浓度0.5μM)[0079]探针1或/和2(每种终浓度0.25μM)[0080]6.在样品孔中分别加入：[0081]水(试剂对照)

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HEK293细胞DNA 0.1μg(阴性对照)

[0083]模板1 1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝，[0084]模板2 1x105，1x104，1x103，1x102及10个靶序列拷贝，[0085]模板1 1x103拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg[0086]模板1 1x102拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg[0087]模板1 1x103拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg[0088]模板2 1x102拷贝+HEK293细胞DNA 0.1μg[00]7.采用ABI 7500实时PCR系统进行QPCR反应[0090]QPCR反应程序为：[0091]Step1：95℃，10min；[0092]Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；[0093]Step2执行40cycles。[0094]8.结果分析[0095]结果表明，QPCR能够检测出低至10个拷贝的模板DNA。将第一组引物探针和第二组引物探针放在同一个反应中不影响模板DNA的检出(如附图1-2)。细胞基因组DNA不产生任何阳性信号，且不影响目的DNA的检出。[0096]综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

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序　列　表

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序列表<110> 苏州药明检测检验有限责任公司<120> 基于实时荧光PCR技术检测人细小病毒B19的引物、探针、试剂盒及方法<130> CPC-NP-19-101756<160> 8<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 正向引物1<400> 1gtggtggtga aagctctgaa 20<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 逆向引物1<400> 2aggaaactgg gcttccgaca 20<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 正向引物2<400> 3gctgatgtac aacagtggct 20<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 逆向引物2<400> 4gtgtctgtga caattggggt 20<210> 5<211> 25<212> DNA<213> 探针1<400> 5tccccgggac cagttcagga gaatc 25<210> 6<211> 24

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序　列　表

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<212> DNA<213> 探针2<400> 6tgcagatgcc ctccacccag acct 24<210> 7<211> 147<212> DNA<213> 模板1<400> 7gtggtggtga aagctctgaa gaactcagtg aaagcagctt tttcaacctc atcactccag 60gcgcctggaa cagtgaaacc ccgcgctcta gtacacccgt ccccgggacc agttcaggag 120aatcatttgt cggaagccca gtttcct 147<210> 8<211> 149<212> DNA<213> 模板2<400> 8gctgatgtac aacagtggct tacatggtgt aatgcacaaa gctgggacca ctatgaaaac 60tgggcaataa actacacttt tgatttccct ggaattaatg cagatgccct ccacccagac 120ctccaaacca ccccaattgt cacagacac 149

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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