自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南
背景：
自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作
收到病毒后的处理
（一）、腺病毒的储存
1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装；
（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间超 过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的 小包装病毒产品（购买时请提出）。
（二）、腺病毒的稀释 需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞
用 PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。
感染目的细胞
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 由于腺病毒是自主复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传， 因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体情况具体对待。一般根据 外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒的时间，短时程处理（一周之 内）建议先感染腺病毒之后再进行处理，长时程刺激的建议在刺激结 束前 2~3 天进行腺病毒感染。另外不同细胞的 MOI 不同，所以在将 病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中 加入的病毒数。 （一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到 24 孔板，使细胞浓度为 1×105/ml 细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二 天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50%至 70%直接。
（二）病毒感染
I、贴壁细胞 由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算，因此需要在
高倍镜下拍照，条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，此时需要把细 胞铺被在玻片上面（部分细胞铁壁能力不是很强，此时需要预先在玻 片上包被 galetin 甚至 laminin）。感染实验在 1/2 体积培养液感染 （详见下表格）。加入的病毒量范围在 MOI=20～50 内（具体感染的 操作量参见附录表格），每个 MOI 值加两个孔 2 小时后换液。
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 培养皿 类型 96-well 24-well 12-well 6-well 60mm 100mm 病毒小培养体积感染表 表面积 对应细胞培养液体积 病毒感染对应细胞培 养液体积 2/cm 0.3cm2 2cm2 4cm2 10cm2 20cm2 60cm2 100ul 500ul 1ml 2ml 4ml 10ml 50ul 250ul 500ul 1ml 2ml 5ml 感染 2 小时后直接换液 II、悬浮细胞 上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细
胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿 后，封好口，放入平角离心机后，低速离心 1h，然后放入培养箱中 正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管 代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清， 然后加入适量的病毒液，室温放置 10min（不能超过半小时），然后 将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至 2 小时后换 液即可。
（三）观察感染情况 感染24小时后，可以开始观察到GFP以及
RFP表达，36-48小时
可以进行细胞固定、封片（需要使用防淬灭的固定剂）、拍照分析。
（四）结果分析
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 mRFP-GFP-LC3 串联荧光蛋白腺病毒中表达的 GFP 和 mRFP 用于标 记及追踪 LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬 溶酶体（由 GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后 GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光，原理如下图所 示）。
统计方法
我们在显微镜成像后红绿荧光 merge 后通过 merge 后出现的黄色 斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点 的计数可以清晰的看出自噬流的强弱:一般统计采用人为计数的方
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后做出 bar 图。
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用
指南 法，也就是统计叠加（overlay）之后黄色斑点和红色斑点的数目， 然
如下图:细胞转染 mRFP-GFP-LC3 病毒后给予氨基酸剥夺处理 2 小 时后出现明显增强的自噬以及自噬流（通过 merge 后的红色小点明显 增多可以判定自噬流水平升高）。
实验操作注意事项
Antioxid Redox Signal 14(11): 2179-2190.
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自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1、操作病毒时请尽量使用生物安全柜；
2、操作时需戴上帽子，佩戴双层手套，双层口罩；
3、病毒操作中绝对禁止在安全柜内有任何皮肤直接暴露的情况； 4、剩余的病毒和接种用的注射器等耗材需高压灭菌后才能扔弃； 5、操作完毕要及时用肥皂和水洗手消毒；
6、未尽事宜请咨询汉恒生物技术人员了解详情，汉恒生物全国免费 热线400-092-0065；
7、您可登录汉恒生物官网 www.hanbio.net 观看腺病毒实验操作视 频，并与我们的客服人员互动交流。 参考文献：
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附录
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 汉恒生物腺病毒感染复数（MOI）与体积对应表 规格 大约数目 MOI 值 加入病毒数量 腺病毒 MOI 摸索时的体积梯度 /ul 96well 48well 24well 12well 6well 35mmdish 60mmdish 100mmdish 150mmdish 2-5×101-2×102-3×105×1054 50-100 50-100 50-100 50-100 1-5×106 70.1-0.5ul 0.1；0.3；1 0.5；2；6 1；3；10 2.5；7.5；25 5；15；50 5；15；50 10；30；100 30；100；300 60；180；600 5 0.5-2×101-3×1070.5-2ul 1-3ul 5 7 62.5-5×100.5-2×100.5-2×101-4×108 2.5-5ul 5-20ul 5-20ul 10-40ul 1-2×101-2×102-4×10 50-100 50-100 50-100 8 6 8 6 6-10×101-2×10650-100 50-100 3-10×108 30-80ul 50-200ul 7 0.5-2×10109 腺病毒滴度以 10/ml 为准，其他滴度需相应换算； 大约细胞数目是根据 80%～100%细胞密度估算而出，具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。 注：
1）24板长满了细胞大约有3×105个细胞。 如果一天后要长到70％（2.1×105）， 建议1.2－1.4×105个细胞。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面 及适应新的生长条件，不会达到24小时翻一倍的速度。其他规格培养可参照此 确定相应culture细胞量。
2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含 义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。各种细胞的最适MOI值有差别，请 客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。
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