一.技术简介
自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并 降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关, 在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞 内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、 细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、 神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞 自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领 域的一个新的研究热点。
由于自噬体膜形成过程中需要LC3 ,因此通过标记LC3可以识别 自噬体。LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。
LC3 最初被分析鉴定为 microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)O LC3 蛋白家族包括 LC3A、B、C 和 GABARAP 等亚家
族，其中对于LC3B的硏究最为广泛。到目前为止，LC3B被 认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有 125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了 C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名 为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸 经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶(El-like activating enzyme),以ATG3 为 E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme),以 Atgl2-
Atg5-Atgl6 复合物为 E3 样连接酶(E3-like ligase),在C端甘氨酸上共
价连接上磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine,PE)而成为
LC3B-PE 即 LC3BIIO 与胞 质定位的LC3B I不同z LC3B II定位于自噬
体(autophagosome)的 内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II 被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶 所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏 水性，在SDS-PAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表 观分子量分别为14kD和16kDo
在用GFP-LC3B慢病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显 微镜下GFP-LC3B以弥散的形式存在于细胞质中；而在自噬的情况 下，荧光显微镜下GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以斑点的形式表 现出来(LC3B dots or punctae)o
RFP・GFP・LC3B是硏载生物硏发的重组慢病毒，感染后能够在
靶 细胞中有效表达红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的 融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。 自噬小体在与溶酶体融合过程中,溶酶体内的酸性环境会导致GFP 荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。RFP是一 种红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被 溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的RFP因为其 卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达RFP-GFP-LC3B蛋白， 可以非常有效地追踪自噬过程。在用RFP-GFP-LC3B慢病毒感染细 胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下RFP-GFP-LC3B以弥散的 黄色荧光
(RFP和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中;而在自噬的 情况下，
荧光显微镜下RFP-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄 色斑点的开
2式表现出来(LC3B dot or punctae);当自噬体与溶酶体 融合后，因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。
