新城疫抗体监测-血凝与血凝抑制试验中影响因素及解决办法
作者：唐艳荣 张海云 曹院章 等
来源：《农业开发与装备》 2015年第12期
唐艳荣，张海云，曹院章，张雪梅，齐海霞，王艳红
（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）
摘要：对新城疫抗体监测-血凝与血凝抑制试验中的各种影响因素逐一进行分析，并提出解决办法和具体操作方法。
关键词：新城疫抗体监测；血凝与血凝抑制试验；影响因素；解决办法
近年来，城区养鸡业的发展日益衰减，赛鸽和肉鸽的饲养占据了大半的养禽业的领域，公棚鸽饲养日益兴起，而在公棚中，新城疫极其变异是对公棚鸽最大的危害。为了加强禽类疫情监测工作，及时掌握疫情动态和免疫效果，有效防止疫情发生和传播，减少经济损失。新城疫抗体监测工作是实验室工作的重要部分，血凝和血凝抑制试验是目前实验室监测新城疫抗体中最常用的方法，此方法在实验中操作简单，判定方便，但是很容易因操作不规范，技术不娴熟而影响实验结果的准确性。现对实验结果的准确性的影响因素进行了简单分析讨论，以供大家参考。
1 红细胞的配制
1）由于鸡的个体差异，红细胞对病毒敏感性也不同，从而影响HI效价，一般需要采集至少三只公鸡或无新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液混合在一起，放入离心管中，加入3～4倍体积的PBS混匀，以2 000r/min离心5～10min，去掉血浆和白细胞层，重复洗涤三次，这样可以减少自凝现象的干扰。
2）有抗体鸡提供的红细胞需要多洗涤几次，以便减少血液中的抗体对实验结果的影响。洗好的红细胞，最后吸取压积红细胞用PBS配置成0.5%～1%浓度较为合适，浓度过大时，血点过大，浓度过小时，沉降的血点太小，不易判断，并且沉降速度慢。
2 PBS稀释液的配制
1）稀释液的pH为7.0～7.2时红细胞沉淀最充分，也最易判断。稀释液的pH过于小，一般小于6.0以下，红细胞容易出现自凝现象，pH为7.6以上凝集的红细胞容易洗脱加快。所以最好配制的稀释液pH值为7.2。配制好的稀释液需要在121℃，15min条件高压灭菌后4℃保存备用，时间不宜过长保存，否则会出现污染，对实验结果有影响，出现跳孔现象或试验不成立等等。配置稀释液时要使用无离子水或蒸馏水。
2）如果使用生理盐水代替PBS液时，要选用新开瓶的灭菌生理盐水，用之前，最好标定调制pH至7.2，以便减少实验误差。
3 4单位抗原的标定
血凝血凝抑制试验中必须对抗原进行标定，这一环节很重要，同一批号的抗原最好同时标定两瓶，最好用110°V型版进行标定，重复做几板，以防每板结果的一致性，以减少误差。HA
的标定滴度的准确性都会影响HI结果，配成4HAU抗原后，为防止抗原配制不准确，实验前可做抗原回归试验，如果抗原回归试验不成立，则需调整4HAU抗原的浓度，直至抗原回归试验成立，保证4单位抗原配制的准确性。
4 血清稀释的均匀程度
血清稀释时，要混合均匀，混合均匀程度的不同会造成结果出现差异，因此稀释血清是要来回吹打至少10次。在操作时要事先按下移液器再插入反应版的孔底，来回吹打时手不要完全按下放开，在小范围内吹打，最后再慢慢放开手，吸取后插入第二孔液面下，这样反应版孔内和移液器吸头内不易产生气泡，并且稀释充分，混合均匀。在反复抽吸时，移液器吸头不要离开液面，防止产生气泡和液体溅出孔外，造成混合不均或移液体积不一致，影响检测结果的判断。
5 反应时间和温度
反应时间和温度对实验结果也有影响，要求室内温度在20～25℃进行试验，室内温度不适宜的可放置恒温箱内。若温度过高时，也可放置4℃静置，适当延长反应时间。若温度低于4℃时，红细胞会发生自凝现象，且反应速度慢，过高时，（一般不高于37℃）红细胞沉降速度快，且凝集的红细胞容易洗脱，导致实验不成立，反应时间应在规定的时间内及时观察，时间过短可出现凝集不完全，时间过长出现洗脱现象，或红细胞发生裂解，结果就没有意义了。
6 试验判定时间
1）同样的道理加入红细胞的判定时间也是决定抗体高低的关键因素，早判定和晚判定大多数会高低相差1log2，也就是2倍。因此何时为最佳判定时间呢？我个人认为不能简单的按照书上说的30min后判定，应该按照你的阴性和阳性对照的最佳沉淀和凝集时间，因为你的阴性对照会沉淀，阳性对照会凝集，这个时间是可以随你的加样的准确性和环境的温湿度而变化的，也就是你的最佳坐标，所以红细胞加入后判定结果的时间，就是阴阳性对照成立的那一刻，即为你结果出现的时刻。
2）最好在红血球完全沉降的前后5min内判读试验结果，判读时一定要将微量反应版倾斜45度，孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样完全流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集抑制。
7 微量反应版的选用
反应版的质量和清洁度对凝集反应有着不小的影响，最好使用孔内壁光滑透明，板面水平，透明度好且凹空干净的反应版，实验中不得使用不同角度的V型微量反应版和陈旧反应版，或者反应板内孔不光滑的，对实验结果准确性也会有一定的影响。
总之在进行新城疫血凝及血凝抑制试验时应综合考虑各方面因素，制定一个标准化操作方法，以免对试验结果产生影响，造成不必要的误差。只有把试验标准化，操作规范化，保证实验的准确性，正确评价疫苗免疫存在的实际意义，试验结果才能在实际生产中发挥更大的指导意义。
参考文献
[1] 张智鹏.血凝和血凝抑制试验影响因素分析[J].中国畜牧兽医，2010，（10）：224-226.
[2] 覃开权.鸡新城疫血凝和血凝抑制试验实训实习效果分析[J].安徽农业科学，2014，（18）：5881-5882.
