・生物技术・ 北方园艺２０１４（０６）：１０４～１０６ 北沙参愈伤组织诱导及悬浮细胞培养研究 苗晓燕，何富强，张筱梅 （保定学院生化系，河北保定０７１０００） 摘要：以北沙参叶片和茎段为外植体，采用ＭＳ和Ｂ５培养基对其进行愈伤组织诱导，继代 培养后进行悬浮培养，研究了不同浓度碳源、６－ＢＡ和Ｎ从对其细胞生长的影响，以期为进一步 建立北沙参细胞培养体系以及提高其次生代谢物产量奠定试验基础。结果表明：１／２ＭＳ＋ ０．４ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ琼脂培养基为北沙参愈伤组织诱导的较适宜培养基；１／２ＭＳ＋ ０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ为适宜的继代培养基；在细胞悬浮培养过程中，分别添加 ０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ、１．６ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ和２０ ｇ／Ｉ 蔗糖有利于细胞的生长。 关键词：北沙参；愈伤组织；细胞培养 中图分类号：Ｒ ２８２．７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－－０００９（２０１４）Ｏ６一Ｏ１Ｏ４—０３ 北沙参（Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ Ｆｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔｅｘ Ｍｉｑ）属伞形 科沙参属多年生草本植物，又名海沙参、野沙参、羊乳根 验室开展了一系列关于北沙参愈伤组织及细胞培养方 面的研究。该试验以北沙参叶片和茎段为外植体，对北 沙参愈伤组织诱导培养基及细胞悬浮培养条件进行了 研究，旨在为北沙参的优质种苗繁育以及次生代谢产物 香豆素的大规模生产提供一定的试验依据。 等，其主产区为山东、河北、内蒙、辽宁等省。药用始载 于“神农本草经”，列为上品，明代“本草纲目”列为五参 （人参、党参、玄参、丹参、沙参）之一＿＿１一。经研究表明，北 沙参的主要活性成分有欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑 内酯、补骨质素等１４种香豆素，还有一种香豆素苷元、多 糖、生物碱及挥发油等。药理学研究和ｆ临床实践表明， 香豆素类成分是主要的有效成分，具有止咳化痰［２１ Ｊ、抗 突变［ 、抗菌［４］、抗肿瘤 和镇痛镇静［ 等作用。 近年来，由于北沙参的不规范种植，导致其品种退 化、混杂、质量下降和疗效降低，严重影响了药材的质量 稳定。人们关于北沙参的研究主要集中在化学成分［７］ 及药理活性等方面 ］，其组织培养［ｇ 仅见零星报道，而细 胞悬浮培养则尚鲜见报道，因此保定学院生化系细胞实 第一作者简介：苗晓燕（１９８０一），女，硕士，讲师，现主要从事药用植 物次生代谢及等研究工作 Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｉａｏｘｉａｏｙａｎ３２０５＠ １２６．ｃｏｍ． １材料与方法 １．１试验材料 供试材料北沙参采于安国药材种植基地。 超净工作台（苏州市净化设备公司，型号：ＹＪ－８７５ｓ）、 全温振荡器（哈尔滨东联电子科技有限公司）、低速大容 量离心机（上海安亭科学仪器厂）、万分之一电子天平 （上海民桥精密科学仪器有限公司）、光照培养箱。 １．２试验方法 １．２．１愈伤组织诱导ＭＳ培养基诱导愈伤组织：取新 生北沙参的叶片和茎段为外植体，自来水冲洗１０ ｒａｉｎ， 移至超净工作台，用７０ 酒精浸泡２０ Ｓ，无菌水冲洗３ 次，再用０．１ 升汞消毒８ ｍｉｎ，无菌水洗涤３次，无菌滤 纸吸干。用解剖刀将茎段切成０．５～１ ｃｍ，叶片表面划 伤，接种于１／２ＭＳ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋２０ ｇ蔗糖＋７ ｇ／Ｌ 基金项目：保定学院重点基金资助项目（２Ｏ１ＯＺ０３）；河北省教育厅 资助项目（ｚ２０１２００７）。 收稿日期：２Ｏ１３—１２一ｌ１ 琼脂培养基，分别添加不同浓度ＮＡＡ（Ｏ．５、１．０、１．２、 １．５、２．０ ａｇ／Ｌ），调ｐＨ ５．８，（２５±１）℃，暗培养。Ｂ５培养 ｒＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄｓ ｏｆ ９ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ ｅｕｌｔｉｖａｒｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，６－ＢＡ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒａｔｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｓｉｘ ｃｕｈｉｖａｒｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ‘Ｂｅｉｊｉｎｇ ｌｈｈａｏｃｈｉｈｕｏｇｕｏｃａｉ’ｗｉｔｈ １２．３８ ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ ｐｅｒ ｂｕｄ．Ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．３ ｍｇ／ｌ ６－ＢＡ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒａｔｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｆｏｒ‘Ｂｅｒｉｎｇ Ｔｅｈａｏｃｈｉｈｕｏｇｕｏｃａｉ’．Ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０。０１ ｇ／Ｌ ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｎ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ Ｂ５ ｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｓｐ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ￣ｍｉｅｒｏｓｐｏｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｅｍｂｒｙｏｉｄ；ｐｌａｎｔｌｅｔ １ Ｏ４ ・生物技术・ ５０ ４５ ４０ ３５ ３０ －２５ ２０ １５ ｌ０ ０５ Ｏ０ ．．北方园艺２０１４（０６）：１０４～１０６ ３结论 该试验结果表明，适宜诱导北沙参愈伤组织的培 养基为１／２ＭＳ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ６一ＢＡ＋１．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，这 盖 ； ｏ 三 与李森等＿ｇ 进行珊瑚菜愈伤组织诱导的培养基接近，但 不需要添加Ｉ且（Ｎ０３）。・６Ｈ Ｏ一样可以较高效率的诱 导出愈伤组织；最适宜愈伤组织继代的培养基为 １／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｉ ６－ＢＡ＋１．２ ｍｇ／Ｉ ＮＡＡ。同时通过 ｌ｛茁ｌｉ Ｈ＿ 型 器 ．图５不同浓度ＮＡＡ对悬浮细胞生长的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＡ ｏｎ 多次继代获得了松散的愈伤组织，以ＭＳ为基础培养基 进行了北沙参的悬浮细胞培养，初步考查了６－ＢＡ、ＮＡＡ 和蔗糖３种因素对悬浮细胞生长的影响。结果发现，３ 种因素浓度分别为０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ、１．６ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ和 ２０ ｇ／Ｌ蔗糖时，细胞的生长状态良好，且生长速度相对 较快。在后续的试验当中应将对这３种因子进行正交 实验以找到最适宜北沙参细胞生长的培养基，该结果将 ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ 的颜色随ＮＡＡ浓度增加由深变浅，细胞团则由大变小， 不定根由多到少，且在１．６ ｍｇ／Ｌ之后，没有不定根长 出。因此，认为１．６ ｍｇ／Ｉ ＮＡＡ为北沙参细胞培养的较 适宜浓度，在此浓度下细胞颜色浅，没有不定根，分散性 良好，细胞增长速度快。 ２．４不同浓度蔗糖对北沙参悬浮细胞生长的影响 图６结果表明，随蔗糖浓度升高，细胞生长速率急 剧上升，当蔗糖浓度为１０ ｇ／Ｌ时，细胞生物量达到最 大，之后随蔗糖浓度升高，细胞生长速度趋缓。但在蔗 糖浓度为１０ ｇ／Ｌ时，悬浮细胞团达最大，之后逐渐减 小，且细胞褐化现象在蔗糖浓度为２０ ｇ／Ｌ后逐渐加重。 为北沙参更深层次的研究以及应用奠定理论和试验 基础。 参考文献 ［１］余椿生．北沙参［Ｊ］．食品与药品，２００５，７（４）：４３—４４． ［２］龚晓健，季晖，李萍，等．沙参提取物镇咳祛痰及免疫增强作用研究 口］．中国现代应用药学，２０００（４）：６－８． ［３］王中民，张永祥，史美育，等．北沙参抗突变实验研究［Ｊ］．上海中医药 杂志，１９９３（５）：４７—４８． 因此综合考虑以上情况，选取２０ ｇ／Ｉ 为北沙参细胞生长 较适宜碳源浓度。 Ｅ４］Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｈ，Ｓａｘｅｎａ Ｇ，Ｆａｒｍｅｒ Ｓ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉｌａ ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｏｌｙｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ ｓｓｐ．１ｅｉｏｃａｒｐａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ， １９９６，６２（３）：２５６－２５９． ［５］Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ，Ｔａｋａｔａ Ｍ，Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ－ｐｒｏ— 曼 呈 言 富 ｍｏｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．ＩＩ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆｔｕｍｏｒ—ｐｒｏ— ｍｏｔｅｒ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ［Ｊ￣．Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９０，３８（４）：１０８４—１０８６． 占 １１田】｛ ［６］Ｏｋｕｙａｍａ Ｅ，Ｈａ￣ｇａｗａ Ｚ Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｇｌｅｈｎｉａ ｒｏｏｔ（Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９８，５２（６）：４９１—５０１． ［７］张样柏，唐旭利，李国强，等．北沙参的化学成分研究ｒＪ］．中国海洋大 蔗糖浓度Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ／ｇ・Ｌ 学学报，２００８，３８（５）：７５７－７６０． 馨 最 ［８３董芳，刘汉柱，孙阳，等．北沙参中佛手柑内酯的分离鉴定及体外抗 图６不同浓度蔗糖对北沙参悬浮细胞生长的影响 Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ 肿瘤活性的初步测定Ｉ－Ｊ］．植物资源与环境学报，２０１０，９（１）：９５—９６． ［９］李森，蔺博超，吕平，等．珊瑚菜组织的培养及无性系的建立［】］．啥尔 滨师范大学自然科学学报，２００８，２４（５）：８５—８６． Ｓｔｕｄｙ Ｏｉｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌｌｕｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ ＭＩＡＯ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＨＥ Ｆｕ－ｑｉａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｍｅｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｏｄｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ ０７１０００） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＭＳ ａｎｄ Ｂｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｇ／ｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ａｆｔｅｒ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，６一ＢＡ ａｎｄ ＮＡＡ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ（２－／ｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ ｅｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １／２ＭＳ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ６一ＢＡ＋１．５ ｍｇ／Ｉ ＮＡＡ；ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．２ ｍｇ／Ｉ ＮＡＡ；ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｅｔｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，１．６ ｒｎｇ／Ｌ ＮＡＡ ａｎｄ ２０ ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ ｔｏ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｌｅｈｎｉａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ；ｃａｌｌｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ；ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ １０６
