旋毛虫包囊形成机制的研究进展

旋毛虫病在我国被列为三大人兽共患寄生虫病之首（旋毛虫病、囊虫病及棘球蚴病），而且是肉类进出口和屠宰动物首检和必检的一项。旋毛虫生活史分为三个时期：成虫期（AD）、新生幼虫期（NBL）和肌幼虫期（ML），并具有期特异性。与成虫和肌幼虫相比，新生幼虫是旋毛虫侵袭力最强的时期，代谢旺盛，在短时间内合成大量蛋白，其分泌的侵袭因子很可能是高特异性和强保护性抗原。与大多数胞内寄生虫不同，旋毛虫寄生在宿主细胞内不但不杀伤宿主细胞，反而能够成功的与宿主形成共生体，正因为这种机制，使得旋毛虫病的防治仍是个棘手的问题。因此，从旋毛虫新生幼虫入手，对于探明旋毛虫侵袭机理、包囊形成机制及旋毛虫病的防治具有重要的意义。

当宿主生食或半生食含有旋毛虫的肉后，旋毛虫在胃液的作用下被消化脱囊释放出来，随继钻入肠粘膜，旋毛虫成虫寄生于宿主小肠，主要在十二指肠和空肠上段，36小时后发育成成虫并进行雌雄交配，96小时后雌虫产出新生幼虫（长0.08mm，直径7μm）。少数新生幼虫可自肠腔排出，绝大多数新生幼虫则侵入局部粘膜内的淋巴管和小静脉，随血液循环和淋巴循环至全身器官、组织及体腔，但只有到达横纹肌的幼虫才能继续发育长大。尽管旋毛虫的宿主特异性很差，但旋毛虫的寄生却具有极强的器官、组织特异性，只有横纹肌才是幼虫寄生的合适组织；但是，极少数可在脑、心肌、肺、肝、肾脏、血液、脑脊液、母乳、淋巴、眼的视网膜及脉络膜中发现旋毛虫的幼虫。成熟的肌幼虫卷曲于横纹肌内的梭形包囊中。包囊大小为0.25mm～0.5mm×0.21mm～0.42mm，其长轴与横纹肌纤维平行排列。一个包囊内通常有1～2条幼虫，有时可多达6～7条。包囊的作用就是保护旋毛虫不受宿主免疫反应的杀伤。成熟的包囊在形态上不同于哺乳动物细胞，没有任何病理状态能够诱导出这种完全不同的功能细胞。保姆细胞-寄生虫复合物能在人体内存活长达30年之久，而在其它哺乳动物体内则会伴随哺乳动物一生。因此，旋毛虫必须对宿主存在免疫抑制，然而我们对旋毛虫如何逃避宿主免疫的机制却一无所知。 1. 包囊形成

旋毛虫新生幼虫进入宿主细胞的机制还不清楚，但是形态上的实验结果对这一侵入过程给出了一些启示。新生幼虫侵入肌肉后，穿透毛细血管，在邻近的肌细胞处虫体伸直绷紧，然后在惯性的作用下，依靠前端的锥刺刺破肌膜，钻入肌细胞内，肌膜的破裂处在新生幼虫钻入肌细胞后立刻复原。我们可以想象整个过

程：就象我们用食指直戳膨胀的气球，然后设法拔除尖尖的指甲使气球爆炸。因此，我们认为旋毛虫没有必要分泌酶类来帮助它从血管钻入肌细胞内。然而，这需要证据来说明最后的结论。因幼虫的机械性刺激及其代谢产物的化学性刺激，使肌纤维受损，出现炎症细胞浸润，纤维组织增生。受累的肌细胞在结构上出现明显变化（如肌丝崩解和肌细胞核增大等），形成了在解剖结构上于其它肌肉组织的保姆细胞（营养细胞，nurse cell）。保姆细胞实际上就是原来的横纹肌细胞，但在形态上与其它任何哺乳动物细胞均不相同。

在新生幼虫进入肌细胞的第1天，虫体的体积会增大1倍。但在随后的2天内，新生幼虫的体积保持不变，到第4天开始生长。而在旋毛虫停止生长期间，宿主肌细胞的收缩功能会被破坏。感染后第3天，受累肌细胞的线粒体空泡化，ATP合成与有氧代谢途径解耦联，并持续至整个感染过程。对于厌氧性生物来说，线粒体功能异常对寄生虫的生长发育是必须的。在包囊形成的前5天里，肌肉的正常结构遭到破坏、收缩功能丧失。肌动蛋白和肌球蛋白开始消失，肌纤维膜开始与收缩成份分离。因此，

直到第19天，寄生虫的体积以每天39℅的速度增大，而在第14-16天，寄生虫就获得感染性。受累肌细胞的胞浆也发生了变化，溶菌酶活性增强，线粒体、高尔基体和粗面内质网增多，HE染色时胞浆为嗜碱性[1]。在肌肉活检时即使在病理切片上为发现旋毛虫感染的诊断也有重要价值。受累肌细胞的嗜碱性转变与新生幼虫的虫龄有关，将1h、9h和6d龄的幼虫分别肌肉注射小鼠，结果发现1h龄幼虫的诱导能力最强，随着虫龄延长，其诱导能力则逐渐丧失。肌细胞的嗜碱性转变最早见于感染后48h，电镜研究表明1h龄新生幼虫可进入肌细胞的肌浆中，而引起肌细胞的嗜碱性转变[2]。然而，在1h龄新生幼虫感染组小鼠的组织切片上，已发生嗜碱性转变，但不含幼虫的肌细胞数量是含幼虫者的3倍，提示肌细胞的嗜碱性转变可能不需要肌细胞和幼虫的直接接触，而可能与接触幼虫释放的某些物质有关[3]。发生嗜碱性转变后，横纹肌细胞原有的一些典型特征亦丢

失，如某些肌纤维蛋白水平增加及横纹消失等[4]。受累的肌细胞含有大约40个增大的肌细胞核和幼虫从而转变为保姆细胞。保姆细胞核的体积增大，数量增多（15－81个），分布于整个胞浆内[5]。此外，保姆细胞的细胞周期也发生了变化。分化的横纹肌细胞细胞周期终止，维持在G0期，而被旋毛虫幼虫寄生的肌细胞则被诱导重新进入细胞周期，复制其DNA，维持在G2/M期，持续数月至数年[6]。 2. 保姆细胞的形成机制

Despommier[7]针对保姆细胞的形成提出了一种假说：旋毛虫进入宿主细胞后大量分泌一种信号分子，并指导宿主尽可能地利用这种信号分子；宿主细胞对这种信号分子作出反应，促使保姆细胞的形成。即这种信号分子对包囊胶原蛋白的合成起到启动和转录因子的作用。旋毛虫保姆细胞的构建及其维持过程可以说是一个信息交换的过程，在其生命活动期间镜检发现，旋毛虫在它的保姆细胞内经常移动、前后缓慢地摆动并且用前尾探测它周边的环境，消耗能量也是如此，但虫体基本处于安静状态。因此，旋毛虫构建和维持它的保姆细胞的本能几乎完全依靠这种信息交流系统。哺乳动物细胞内的交流系统是靠大量分泌的信号分子（即细胞质），它指导特殊细胞的活动。也许旋毛虫用相似的分子去执行自己的发育过程，然后它必须指导宿主尽可能地利用它们分泌的信号分子，称之为“parakines”。宿主细胞对这种信号分子产生应答，促使保姆细胞的形成，而parakines的存在被预测是在保姆细胞形成期间哺乳动物细胞和虫体之间发生复杂的相互作用时所必需的。

1992年，Vassilatis[8]成功地从旋毛虫中克隆到一个旋毛虫包囊形成相关基因－P43。P43编码泰威糖蛋白，这种分泌物在感染宿主后第12～15天在胞浆中可以观察到。利用免疫组化技术在光学显微镜水平上作组织切片观察发现，编码43kDa多肽的mRNA在寄生虫的任何时期的虫体中都能检测到，因此43kDa多肽的合成和分泌可能是连续的。1996年，Vassilatis[9, 10]进一步对P43基因进行表达及特性研究，结果发现：P43蛋白是在感染后第12～15天分泌到胞浆中，而胶原蛋白（主要是Ⅳ型和Ⅵ型）在感染后第7天开始启动表达，故二者在时间上不一致。免疫组化实验证明，抗P43抗体在虫体和保姆细胞的胞浆以及其细胞核均能着色，而将P43分段表达制备特异性抗-183和抗-95的抗体仅对虫体着色，对保姆细胞的胞浆及其细胞核均不能着色。因此，Vassilatis进一步提出P43虽与包囊形成有关，但并未直接参与包囊形成，而是一种与P43同源性非常高的蛋白参与了包囊形成的。2000年，大学Ko RC[11-13]在研究中发现，旋毛虫

排泄分泌物中具有很强的核酸酶活性，而伪旋毛虫（旋毛虫中一个不能形成包囊的种）中则没有此酶活性，此研究表明旋毛虫包囊的形成很可能与旋毛虫分泌物中的核酸酶有关。NCBI Blast及InterProscan检索表明，P43编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ。因此，Ko RC的实验结果实际上是进一步验证了核酸酶参与包囊形成的相关性。

保姆细胞的形成可能与旋毛虫幼虫的ES产物有关。在保姆细胞的肥大核仁和胞浆中发现有肌幼虫的ES抗原[14-16]，感染后第6天，幼虫杆细胞产生的抗原出现在受累的肌细胞中，感染后第9天则出现在肌细胞核中[14,17]，提示幼虫的ES抗原可在细胞核水平直接与宿主的肌细胞互相作用。感染后第8天幼虫开始合成并分泌泰威糖[tyvelose，或称为3,6－双脱氧已糖（3,6－dideoxyhexose）]修饰的蛋白到受累的肌细胞周围，在所有发育中的保姆细胞的核浆中均发现至少存在4种泰威糖修饰的蛋白，应用抗旋毛虫蛋白的抗体亦发现分子量为79kDa、86kDa和97kDa的核抗原（nuclear antigen）定位在细胞核内。抗旋毛虫糖蛋白表位的单抗可与上述核抗原结合，此类糖蛋白可能与诱导宿主的肌细胞核增大并调节肌细胞的表型有关[18]。

将肌幼虫ES产物经肌肉注射小鼠，可引起广泛的肌肉组织变性与再生，包括肌纤维溶解、单核细胞核多形核白细胞的移动、血管生成、肌核肥大、肌管形成、有丝、肌束变圆并互相分离[19,20]。将肌幼虫和新生幼虫的ES产物加入大鼠肌细胞的培养基中，可引起肌小管形态和结构的改变，如肌小管呈颗粒状、管壁变薄且不能成网，其中最明显的损害是形成沿肌小管分布的结节状结构，每个结节内含有增大的核和一些被完整肌纤维膜包裹的空泡；将肌细胞与新生幼虫共同培养亦可引起前者结节的形成；免疫荧光和激光共聚焦显微镜检查（laser confocal microscopy）发现结节中存在旋毛虫抗原表位，但成虫的ES产物对肌小管则无影响[21]。

Gounaris等[22]从感染性幼虫ES产物中鉴定出了一种分子量为17kDa的核苷二磷酸激酶，被认为与调节宿主肌细胞功能有关。为了进一步研究旋毛虫在肌细胞转变为保姆细胞过程中的作用，在感染宿主肌细胞前对新生幼虫进行放射照射（48krad和80krad）处理，以抑制幼虫在肌细胞内的生长和发育，照射过的幼虫虽能进入骨骼肌细胞，但照射处理则抑制了幼虫随后的生长和杆状体发育，包括α、β杆细胞的发育。然而，被感染的肌细胞还能再进入细胞周期并在其周围形成胶原囊，表明保姆细胞的形成与α、β杆细胞的正常发育无关。

3. 幼虫包囊的结构及形成过程

保姆细胞周围被一层来源于宿主的胶原所覆盖，胶原囊周围由毛细血管网包裹，由此形成了保姆细胞－感染性第1期幼虫复合体（nurse cell-infective first stage larva complex），亦称为保姆细胞－肌幼虫复合体（nurse cell-muscle larva complex），国内常称之为旋毛虫幼虫包囊。对幼虫包囊结构的电镜研究表明，在包囊形成的各个时期均有蛋白多糖（proteoglycans）和胶原纤维的存在。蛋白多糖和胶原纤维形成了包囊的内层，通过基底膜与外层分开。包囊的外层含有间质组织细胞尤其是成纤维细胞和血管内皮细胞合成的胶原纤维和基质[23]。胶原的合成是在感染后第10天开始的，胶原囊继续增厚并持续至感染后第26天。应用抗胶原抗体和特异性RNA探针发现在胶原囊中存在有两型胶原蛋白，即Ⅳ型和Ⅵ型，分别起支架和将其结合在一起的作用。Northern印迹分析和原位杂交表明，Ⅳ型胶原的合成是在感染后第10天开始，第26天结束。肌幼虫ES产物在体外可诱导小鼠肌肉中的成纤维细胞大量合成Ⅳ型胶原[24]。Ⅵ型胶原的合成也是在感染后第10天开始，但持续至整个感染过程[25]。保姆细胞的胞浆里浸润着许多未知的单核细胞。这些细胞在保姆细胞的形成和维护过程中的作用仍是个谜。最初的研究表明，宿主细胞进入保姆细胞的过程是持续不断的。但是利用光学或电子显微镜对包囊进行仔细观察时，在包囊的表面未发现明显的小洞。感染后第10天，宿主的单核细胞就不断的被运送出入保姆细胞的细胞质，这个过程很可能需要侵入细胞至少损坏小部分胶原囊，以便于单核细胞更容易出入。假如这个设想被证实，那么胶原囊的修复过程必然也是个持续过程。因此，假设的模型解释了需要胶原蛋白Ⅵ持续的合成。相反，胶原蛋白Ⅳ是一种比较松弛的分子填充在包囊里，至少在电镜下它是这种状态。因此，一旦它们将胶原蛋白Ⅳ和Ⅵ分离开，细胞很可能会在不损坏原纤维网的情况下穿过胶原囊进出保姆细胞。

旋毛虫在维持新陈代谢过程中要与宿主保持长期的寄生关系，有两个必不可少的条件：一是营养的要求；二是废物的排泄。旋毛虫通过血管的高渗透作用确保小分子代谢物有稳定的来源；同时排出代谢产物。旋毛虫在此过程中引发了血管的生成[26]。这个过程也与保姆细胞内最初缺氧有关。在许多情况下（例如伤口治愈过程和肿瘤生成过程），组织缺氧能够导致血管内皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的正调节作用，从而导致新血管的形成。Despommier等通过原位杂交方法已检测到了VEGF的mRNA：先是在开始感染的肌细胞内即保姆细胞开始形成的第7天的肌细胞的胞浆中，直到肌细胞感染后

8个月。在第9天可以观察到VEGF多肽的出现。因此，VEGF基因在整个感染期间都保持转录，其mRNA 信号在第15天最强。当血液循环网完全形成之后，VEGF多肽的合成水平有所下降，但基本保持恒定，这表明血管渗透增加的状态是临时的，这对旋毛虫维持自己与宿主长期共生有明显的优势。现已知道血液循环网的血管是来源于其相临的小静脉，而不是以前认为的小动脉[27]。毛细血管网由扁平曲折的血管组成，比一般的毛细血管宽大，类似于构成静脉窦的血管，其中一些血管为盲端[28]。它们有窦状小管的直径，这样可以通过这些小管促进物质的快速流动。与毛细管相比这些血管直径较大，也有利于营养和废物的交换。但是，通过此循环提供的交换要比由保姆细胞和血红细胞间气体有效交换的最佳情况少得多，这些试验说明幼虫与保姆细胞的能量代谢是厌氧性的[29]。这个新陈代谢机制解释了被感染的宿主死亡后，最后在厌氧环境下，腐烂的肌肉组织内的旋毛虫几周甚至几年仍具有感染性[30]。

包囊形成时间的长短与感染的

旋毛虫种类及被感染动物的种类有关。就T.spiralis种而言，人体感染后第五周包囊已接近完成；而大鼠则在感染后第13天才开始形成包囊；豚鼠于感染后第17天开始形成包囊；小鼠于感染后第20～21天；猪于感染后第15～22天；山羊于感染后第13～40天形成卵圆形初期包囊；牛于感染27天以后形成初期包囊

[31]

。

4. 幼虫包囊的功能及幼虫的寿命

约在感染后1个月内（最早在感染后第19天），幼虫周围形成梭形包囊。成熟包囊对宿主具有感染性，被新宿主吞食后，则又可重复其生活史。多数研究均已发现在感染旋毛虫动物的血清中存在肌幼虫抗原及抗肌幼虫抗体，但肌幼虫周围的胶原包囊阻止了抗体进入囊内，幼虫则安然无恙[32,33]。故旋毛虫幼虫包囊的功能可能是给幼虫提供所需的营养物质、保护幼虫免遭宿主免疫反应的破坏及运输幼虫的ES产物。约经半年包囊两端开始出现钙化，幼虫则逐渐丧失感染能力并随之而死亡，最后整个包囊钙化，但有时钙化包囊内的幼虫可继续存活数年以上，据文献记载，在人体内幼虫最长可存活39年[34]，在其它哺乳动物体内则可

存活到动物死亡。 5. 结语

对旋毛虫幼虫包囊的结构及其形成机制的了解，对于旋毛虫病的病理学、免疫学及治疗药物的筛选等均具有重要意义。虽然近年来对幼虫包囊的结构已进行了较深入的研究，但对其形成机制目前尚未完全弄清。要解决这一问题，需要从基因水平进行研究。近年来有人已发现有包囊的旋毛虫和无包囊的伪旋毛虫的两个高度保守的基因（tsJ5和tsmyd-1）在肌幼虫期具有差异表达，tsJ5为旋毛虫的发育调节基因，免疫印迹亦显示该基因在旋毛虫有大量的蛋白表达产物，而tsJ5在伪旋毛虫则为下调节基因，其蛋白表达产物较少；tsmyd-1不是旋毛虫的发育调节基因，而该基因在伪旋毛虫的表达产物则有所增加[35,36]，提示幼虫包囊的形成与旋毛虫tsJ5基因的表达有关。

旋毛虫包囊的形成是在虫体的下，由宿主单个肌细胞形成的，旋毛虫寄生在宿主细胞内不但不杀伤宿主细胞，反而能够成功的与宿主形成共生体，因此从旋毛虫包囊形成机制入手，对研究寄生虫与宿主之间的信号转导有重要的意义。

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