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流式细胞仪三标记法检测白细胞介素_10对人树突状细胞表型的影响

来源：华佗小知识

中国微循环2005年6月第9卷第3期　文章编号:1007-8568(2005)03-0185-04

・185・

・临床研究・

流式细胞仪三标记法检测白细胞介素210

对人树突状细胞表型的影响

史桂英,孙桂芝,周　同,金慧芳,张玉梅,赵亚鹏,陈　楠

【摘要】　目的　观察白细胞介素(IL)210对体外培养人树突状细胞(DC)表型的影响,探讨流式细β1、胞术三色荧光标记抗体检测细胞表面抗原的方法及意义。方法　通过SCF、GM2CSF、TGF2Flt23和α体外培养体系,将脐血CD34造血干细胞诱导扩增获得DC,并于成熟过程中用重组人ITNF2L210进行干预。采用流式细胞术的三色荧光标记(FITC2、PE2、CY2)单克隆抗体直接检测技术,分析细胞表型

CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLA2DR。结果　IL210可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80+

△

和CD86的表达。结论　IL210通过抑制DC表面黏附共刺激分子表达,可调节DC的递呈抗原功能;此外,采用流式细胞仪的三色荧光标记检测方法,不仅可以节约DC细胞用量,而且具有快速和准确的优点,值得推广应用。

【关键词】　流式细胞术;树突状细胞;细胞表型;白细胞介素210中图分类号:Q25　　　　文献标识码:BEffectofInterleukin-10onthePhenotypeCulturedHumanDendriticCellsbyFlowCytometryofThreeFluorescenceMarker

SHIGui2ying,SUNGui2zhi,ZHOUTong,etal.　DepartmentofCytobiology,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200025,China

【Abstract】　Objective　Thepresentstudywasdesignedtodetecttheinfluenceofinterleukin(IL)-10

uponthemorphologicfeaturesofculturedhumandendriticcells(DCs),toinvestigatethemethodandthemeaningofphenotypeexaminedbyflowcytometryofthreefluorescencemarker.Methods　CordbloodCD34

stemcellswereisolatedandculturedinIMDMmediumwithSCF、GM-CSF、TGF-β1、Flt-3、TNF-α.DCswereinterferedbyrecombinationofhumanIL-10.HLA-DR、CD1a、CD11c、CD83、CD80andCD86wereassayedbyflowcytometryofthreefluorescencemarker(FITC-、PE-、CY-).Results　TheexpressionofCD11c、CD83、CD80andCD86waslowerinIL-10group.Conclusions　IL-10mightinhibittheexpressionofadhesionandco-stimulationmolecules.ItwaspresumedthatIL-10mightadjusttheantigenpresentingfunctionofDCs.Inaddition,byusingthemethodofthreefluorescencemarker,wecouldsaveDCnumberneeded.Moreoverthismethodisfastandexact,whichisdeservedtobeapplied.

【Keywords】　Flowcytometry;Dendriticcells;Phenotype;Interleukin-10

　　树突状细胞(dendriticcell,DC)是目前所知功能最强的抗原递呈细胞,能够启动和维持包括肾脏在内组织器官的免疫炎症反应。作为免疫调节细胞,DC既有免疫激活作用,也可诱导免疫耐受,

基金项目:国家自然科学基金(39970340)和上海市自然科学基金(02ZB14041,034119916)

作者单位:200025　上海,第二医科大学细胞生物学教研室(史桂英,金慧芳);上海第二医科大学瑞金医院肾内科(孙桂芝,周同,张玉梅,赵亚鹏,陈楠)

第一作者简介:史桂英(1956-),女,汉族,江苏武进人,高级实验师。主要从事分析细胞学技术和研究。

△通讯作者

[1,2]

与其发育成熟状态密切相关。DC在发育成熟

过程中,表面黏附分子和共刺激分子表达上调,以及IL212分泌增加,这些均对其功能发挥起着至关

[1]

重要的作用。IL210是目前公认的免疫炎症病理损伤中负调节因子,在抑制Th1为主的细胞免疫中

[4]

具有重要作用。鉴于我们先前研究证实肾炎时

[5]

肾组织中可见大量DC分布,为此我们通过体外实验,进一步探讨IL210对DC表型的影响,拟为包括肾脏疾病在内的免疫炎症性疾病的防治提供实验依据。但由于目前DC尚无细胞株,血标本来源

[1,3]

・186・

J.ofChineseMicrocirculationJun.2005,Vol.9,No.3不易,且细胞的诱导分化过程中又需大量细胞因

子,实验费用较高,故给科研工作带来不便。因此在细胞的检测工作中选择一种快速、准确、节约标本的方法尤为重要。

材料与方法

1　主要试剂及仪器

MDM购自Gibco公司,CD34抗人磁珠标记抗I

每组各收集三份1×10细胞,所选的单抗有3

对,Ig2FITC/Ig2R2PE/Ig2CY,CD862FITC/CD11c2PE/CD1a2CY,CD832FITC/CD802PE/HLA2DR2CY,取9只试管,按分组每管加入收集的细胞,再依次加入上述3对抗体,加入的抗体量按照试剂说明为10μl或20μl,混匀后室温避光孵育30min,pH7.2的PBS液洗1次,最后加入0.5%甲醛PBS混匀,上机

体购自MiltenviBiotec公司,淋巴细胞分离液Ficoll购自上海生化试剂二厂,rhSCF、rhGM2CSF、rhTGF2β1、α、rhIrhFlt23、TNF2L210均购自Biosource公司,FITC标记的鼠抗人CD83、CD86单抗,PE标记的鼠

检测。

6　统计学方法

每组实验均重复3次,所有数据以均数±标准差(x󰁡±s)表示,组间比较采用t检验,应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析,P<0.05为差异有显著性。

结　果1　DC形态学及活力变化抗人CD80单抗,CY2CHROME标记的HLA2DR、

CD1a单抗均购自BD公司,PE标记的鼠抗人CD11c单抗购自Biosource公司,羊抗鼠Ig2R2PE、Ig2FITC和Ig2CY购自SouthernBiotech公司。所用的流式细胞仪为美国BectonDickinson公司Calibur型仪器,样品分析软件为CellQuestSoftware。2　细胞来源脐血样品采自瑞金医院产科,肝素抗凝终浓度为10～20IU/ml,平均采血量为30～50ml,样品在采集2～6h内分选,细胞经PBE缓冲液稀释,Ficoll梯度离心,收集界面层单个核细胞,PBE洗涤备用。

3　DC诱导分化

利用抗CD34吸附单克隆抗体-磁珠分离系

统(MACS)从单个核细胞中分离出CD34细胞,用20%IMDM培养液,调整其浓度为0.5×10,接种于24孔板中,分为三组。①未成熟组:加SCF(50ng/

倒置显微镜下观察可见,人脐血CD34细胞经

β1联合诱导培养的第5dGM2CSF、SCF、Flt23、TGF2

起,细胞表面开始出现明显的树突状改变,呈典型的DC形态特征,并呈半悬浮状态生长,但未成熟组、成熟组、IL210抑制组三组DC的形态无明显差异(图1,见封2)。此外发现,三组DC分别于培养第14d后数目增加最为明显,可增至细胞培养起始的12倍;另经台盼蓝染色的细胞活力判断,三组DC活细胞均>90%,且三组之间DC活力以及扩增数目无显著不同。

2　DC表型变化

β1(0.5ng/ml)、ml)、GM2CSF(100ng/ml)、TGF2Flt23(75ng/ml)培养至7d。②成熟组:在未成熟组培

α(100ng/ml),培养养基础上于第12d加入TNF2

至14d。③IL210抑制组:在未成熟组培养的基础

上于第7d加入IL210(200ng/ml),且于收集前48

α(100ng/ml)。未成熟组于第7d,成熟h加TNF2

组与IL210抑制组于第14d,分别收获细胞,进行表型分析。

4　DC形态及表型分析

流式细胞仪分析发现,未成熟组DC低表达CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86,呈现未成熟DC

α诱导培养后细胞表面的表型;成熟组经TNF2

CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86的表达明显增高,表现为特征性的成熟DC表型;IL210抑制组DC的CD11c、CD83、CD80、CD86表达明显下降,除CD11c外其它标志仍高于未成熟组;而HLA2DR则无明显变化(图2、3)。

倒置显微镜及电镜下观察DC的形态、数目。

台盼兰染色观察细胞活力,将1滴细胞悬液与2滴2%台盼蓝混合后,滴入细胞记数板,2min后显微镜下记数至少200个细胞,未着色的为活细胞,呈蓝色的为死细胞,计算活细胞百分比。

5　DC单抗标记

注:3P<0.05(与成熟组比较)图2三组DC表型变化(x󰁡±s)

中国微循环2005年6月第9卷第3期　・187・

图3　三组DC表面标志的FACS分析结果

讨　论

流式细胞仪是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞技术就是对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术,可以高速度分析上万个细胞,具有高灵敏度、高准确度、高精确度等特点。目前流式细胞仪已普遍应用于生物学和医学的各个研究领域,其用于细胞表型的检测简便易行,并能够提高实验检测和临床诊断的准确性。

研究表明,DC是体内唯一能激活初始T细胞的专职抗原递呈细胞,其免疫调节作用与发育成熟状况密切相关

[1,3]

在某些特定的细胞因子作用下,可体外诱导扩增DC。GM2CSF能刺激DC前体细胞分化,是体外诱

α可增强G导扩增DC的必要条件;TNF2M2CSF作用并能加速DC的成熟。本研究结果显示,细胞培养5至7d,形态学上虽已出现典型的DC形态,但细胞表面CD1a、CD11c、CD83、CD80及CD86仍低

α表达,表现为未成熟DC特征。经炎症因子TNF2刺激诱导后,细胞表面黏附共刺激分子表达明显增强,表现出特征性成熟DC的表型。

近年对DC及其在免疫炎症反应及多种相关疾病中作用,尤其与之密切相关的其炎症组织迁移,及伴随着由未成熟向成熟细胞分化的发育成熟机制已被关注

[6,7]

。已证明未成熟DC炎症组织迁移

[7]

主要依赖黏附分子选择素介导脏疾病关系不甚清楚

[2]

。迄今对DC与肾

。未成熟DC具有极强的抗原内。经我们初步研究发现,肾

吞及处理能力,但低表达黏附共刺激分子,而诱导T细胞低反应性或免疫耐受;成熟DC可高表达抗原递呈分子及黏附共刺激分子,递呈外来或自身抗原并激活于T细胞,可启动或维持免疫炎症反应

[1]

炎时肾组织中可见大量DC分布,可能与P2选择素介导有关,且DC肾炎组织迁移聚集又与肾小管间质病变及疾病严重程度密切关联

[5]

。这进一步证

。实了肾脏疾病尤其肾小管间质病变系由免疫介导或引发,提示DC等激发的细胞免疫可能是引起肾小管间质病变的主要机制。IL210作为重要抗炎因

因此,DC表面抗原的检测可能具有十分重要的意义。已知髓系DC主要来源于CD34造血干细胞,

・188・

J.ofChineseMicrocirculationJun.2005,Vol.9,No.3子,其在病理情况下主要分布在病变肾小球及小管

[8]

间质部位,起抑制炎症的作用。我们研究发现,

α作用的炎性状态下,经过I在TNF2L210处理后的

DC其形态和细胞活力均无明显变化,但其表型CD11c、CD83、CD80、CD86明显下调,提示IL210可通过抑制DC表面黏附共刺激分子表达,使T细胞缺乏相应的第二信号而不能被充分活化,从而抑制了随后DC诱发的细胞免疫应答。

采用流式细胞仪分析细胞时,可以从一个细胞中获得多种表型信息。由于流式细胞仪采用的光源不断改进,从开始的单一的激光器或紫外激光器,至目前发展为采用2～3个激光器,或再加一个紫外光器。有的采用立体空间激光系统,实现多荧光分析,最大程度的减少荧光信号间的补偿,提高检测灵敏度和多参数的分析质量。采用488nm激发波长可以同时激发样品中三种或四种不同波长的发射光,可用于同一细胞不同成分的同步分析。因此在一个细胞中,同时检测三种荧光参数,较单标记或双标记法,更能显著增加流式细胞仪分析的[9,10]

信息量,提高了工作效率和科学性。DC作为机体功能最强的抗原递呈细胞,其在免疫应答及多种相关疾病中的作用日益受到重视,体外研究中其细胞表型的检测尤为重要。但目前尚无DC细胞株,且血标本来源不易,细胞的诱导分化过程中又需大量细胞因子,因此采用三标记流式细胞仪检测技术,简便易行,不仅可节约标本,减少费用,而且较其他细胞分析等方法更具有快速、准确性,值得推

广应用。

参　考　文　献

1　BanchereauJ,BriereF,CauxC,etal.Immunobiologyofdendritic

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2　孙桂芝,吴开胤,周同,等.树突状细胞与肾脏[J].上海免疫学

杂志.2003,23(6):425～428

3　SteinmanRM,HawigerD,Liuk,etal.Dendriticcellfunctionin

vivoduringthesteadystate:aroleinperipheraltolerance[J].AnnNYAcadSci.2003,987:15～25

4　ChoiYK,KimYJ,ParkHS,etal.Suppressionofglomerulosclerosis

byadenovirus-mediatedIL-10expressioninthekidney[J].GeneTher.2003,10(7):559～568

5　周同,李晓,孙桂芝,等.树突状细胞在人类肾炎肾组织中分布特

点及临床意义[J].中国微循环.2003,7(4):208～210

6　刘巍,周同,孙桂芝,等.细胞黏附与树突状细胞迁移机制[J].

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cellsenterinflamedtissue,aprocessthatrequiresE-andP-selec2tin,butnotP-selectinglycoproteinligand1[J].Blood.2002,99(3):946～956

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cytometer:opticalandelectricalcellanalysisincombinationwithvid2eomicroscopyinflow[J].Cytometry.1999,35(4):291～30110史桂英,石学耕,龚艳春,等.高血压患者服用丹芎通脉颗粒后的

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822～825

(收稿:2004-12-20　　修回:2005-02-28)

・消息・

南通医学院第二附属医院

消化内科介绍

江苏省南通市第一人民医院

本院消化内科是江苏省重点专科,现有医师11名,其中享受津贴专家1名,主任医师2名,副主任医师2名,主治医师5名。该科技术力量雄厚,拥有全套的电子胃镜、肠镜、十二指肠镜、超声内镜、高频电治疗仪、微波治疗仪、C氢气呼吸试验、24小时食道pH测定等先进设备。该科床位40张,具有解决消化系统疑难、复杂问题的能力。专科专家常年开设门诊,内镜下诊疗技术为专科特色,已开展了ERCP、EST、ENBD、PTC和PTCD、超声胃镜诊断早期消化道肿瘤、胆胰管内超声检查以及小肠造影、腹腔镜、急诊内镜下止血、消化道息肉切除,食道狭窄的扩张术及食管支架术,食道静脉曲张硬化剂注射或多环套扎术等先进诊疗技术,部分技术达省内领先水平。该科已获多项省、市科研成果奖、新技术奖。近年来,在国家级、省级杂志上发表的论文达到100余篇。承担南通医学院的本、专科教学及临床带教任务,并承办了多期消化病及内镜诊疗专科进修班。医疗辐射面广,在本地区具有广泛的影响。

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