３７６主竺壁壁堂苤查垫！！生！旦簦！！鲞箜！塑！堕！！垒！！坠！堕！！！丛！！尘！！！！：！！！：！！：塑！：！・重症医学・异丙酚后处理对大鼠氧糖缺失一复氧复糖皮质神经元促凋亡蛋白活性的影响：与ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路的关系马育霞０６１０００张立民张冬雪刘云峰河北省沧州市中心医院老年内科（马育霞、张冬雪、刘云峰），麻醉科（张立民）通信作者：张立民，Ｅｍａｉｌ：ａｚａｉ２０１０＠ｓｉｎａ．ｃｏｉｎＤＯＩ：１０．３７６０１ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４－１４１６．２０１６．０３．０３３【摘要】目的评价异丙酚后处理对大鼠氧糖缺失．复糖复氧皮质神经元促凋亡蛋白Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、出生２４ｈＰｕｍａ活性的影响及其与ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）信号通路的关系。方法内的ＳＤ大鼠，体外培养其皮质神经元并按种于６孔板（２ｍｌ／：ｆＬ），采用随机数字表法将皮质神经元分为４组（ｎ＝４２）：对照组（Ｃ组）、氧糖缺失一复糖复氧组（ＯＧＤ／Ｒ组）、异丙酚后处理组（Ｐ组）和异丙酚后处理＋ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂组（Ｐｓ组）。采用氧糖缺失９０ｍｉｎ，复氧复糖２４ｈ的方法制备皮质神经元氧糖缺失一复糖复氧损伤模型。Ｐ组和Ｐｓ组于复氧复糖郧刻于培养基中加入异丙酚孵育２ｈ，终浓度５０ｌ＾ｍｏｌ／Ｌ；ＰＳ组于氧糖缺失前１ｈ时于培养基中加入ＳＢ２０２１９０，终浓度５０ｉｍｍｏｌｌＬ。采用ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ／ＰＩ双染色法测定神经元凋亡率，采用Ｍ’ｒｒ法测定神经元存活情况，采用比色法测定ＬＤＨ漏出情况；采用ＪＣ一１荧光法测定线粒体膜电位（ＭＭＰ）水平，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达。结果与ｃ组比较，ＯＧＤ／Ｒ组、Ｐ组和Ｐｓ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率升高，神经元存活率和ＭＭＰ水平降低，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达上调（Ｐ＜Ｏ．０５）；与ＯＧＤ／Ｒ组比较，Ｐ组和Ｐｓ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率降低，神经元存活率和ＭＭＰ水平升高，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达下调（ＪＰ＜Ｏ．０５）；与Ｐ组比较，ＰＳ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率升高，神经元存活率和ＭＭＰ水平降低，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达上调（Ｐ＜０．０５）。结论异丙酚后处理可通过激活ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路，抑制促凋亡蛋白Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的活性，减轻大鼠皮质神经元氧糖缺失．复糖复氧损伤。【关键词】二异丙酚；缺血后处理；细胞低氧；氧；大脑皮质；神经元；凋亡调节蛋白质类；ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶类；信号传导Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｏｐｏｆｏｌｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｒａｔｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｓｕｂ—ｊｅｃｔｅｄｔｏＯＧＤ／Ｒ：ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｐ３８ＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙＭａＹｕｘｉａ，ＺｈａｎｇＬｉｍｉｎ，ＺｈａｎｇＤｏｎｇｘｕｅ，ＬｉｕＹｕｎｆｅｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＣａｎｇｚｈｏｕＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｎｇｚｈｏｕ０６１００１，ＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（ＭａＹＸ，ＺｈａｎｇＤＸ，ＬｉｕＹＦ）；ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，ＣａｎｇｚｈｏｕＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｎｇｚｈｏｕ０６１００１，ＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ（ＺｈａｎｇＬＭ）ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＧｎ撬ｏｒ：ＺｈａｎｇＬｉｍｉｎ．Ｅｍａｉｌ：ａｚａｉ２００５＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓＢｉｄ，ＢｉｍＴｏｅｖａｌｕａｔｅｒａｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｏｐｏｆｏｌｐｏｓｔｅｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏ—ａｎｄＰｕｍａｉｎｃｏｒｔｉｃａｌｐ３８ｎｅｕｒｏｎｓｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｏｘｙｇｅｎ—ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｓｔｏ—ｒａｔｉｏｎ（ＯＧＤ／Ｒ）ａｎｄｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｎｅｕｒｏｎｓｍｉｔｏｇｅｎ・ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ｐ３８ＭＡＰＫ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇＴｈｅｃｏｒｔｉｃａｌｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＳｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙｒａｔｓ（＜２４ｈａｆｔｅｒｂｉｒｔｈ）ｗｅｒｅｃｕｌ．ｎｅｕｒｏｎｓｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｓｅｅｄｅｄｉｎ６－ｗｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐａｌａｔｅ（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）．Ｔｈｅｅｏｒｔｉｃａｌｉｎｔｏ４ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｇｒｏｕｐｓ（ｎ＝４２ｅａｃｈ）ｕｓｉｎｇａｒａｎｄｏｍｎｕｍｂｅｒｔａｂｌｅ：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＣ），ＯＧＤ／Ｒｇｒｏｕｐ，ｐｒｏｐｏｆｏｌｐｏｓｔｅｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＰ），ａｎｄｐｒｏｐｏｆｏｌｐｏｓｔｅｕｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＋ｐ３８ＭＡＰＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＳＢ２０２１９０ｎｅｕｒｏｎｓｇｒｏｕｐ（ｇｒｏｕｐＰＳ）．Ｔｈｅｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏ０２一ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｆｏｒ９０ｒａｉｎｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｗａｓｏｆ０２一ｇｌｕｃｏｓｅｓｕｐｐｌｙｆｏｒ２４ｈ．ＩｎＰａｎｄＰＳｇｒｏｕｐｓ，ｐｒｏｐｏｆｏｌｗｉｔｈｔｈｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５０斗ｍｏｌ／Ｌ万方数据主竺盎壁堂盘查！！！！生！旦整堑鲞釜！塑坐堕！皇！！！生塑！！！！坠！苎！垫！！！！！！：堑：坠：！ａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆ０２一ｇｌｕｃｏｓｅｓｕｐｐｌｙ，ａｎｄｔＩｌｅｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｃｕｌ一ｔｕｒｅｄｆｏｒ２ｈ．ＳＢ２０２１９０ｗｉｔｈｔｈｅｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５０｜Ｉ，ｍｏｌ／Ｌｗａｓａｄｄｅｄｔｏｔｈｅｃｕｉｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍａｔ１ｈｂｅｆｏｒｅ０２一ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２ｈ．ＴｈｅＤｅｕＦＯｒｔａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃ￡ｅｄｕｓｉｎｇＡｎｎｅｘｉｎＶ・ＦＩＴＣ／ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｉａｂｌｅｎｅｕｒｏｎｓｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍａｓｓａｙ，ａｎｄｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｌａｃｔｉｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｒｅｌｅａｓｅｄｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＭＭＰ）ｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙＪＣ一１ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｉｄ，ＢｉｍａｎｄＰｕｍａｐｒｏｔｅｉｎｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅ．ｓｕｉｔｓＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＣ．ｔｌｌｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅａｎｄａｍｏｕｎｔｏｆＬＤＨｒｅｌｅａｓｅｄｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎ．ｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄＭＭＰｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｉｄ，ＢｉｍａｎｄＰｕｍａＷａＳｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｇｒｏｕｐＯＧＤ／Ｒ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＯＧＤ／Ｒ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅａｎｄａｍｏｕｎｔｏｆＬＤＨｒｅｌｅａｓｅｄｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄＭＭＰｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｉｄ，ＢｉｍａｎｄＰｕｍａｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎ—ｒｅｇｕ—ｌａｔｅｄｉｎＰａｎｄＰＳｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｇｒｏｕｐＰ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅａｎｄａｍｏｕｎｔｏｆＬＤＨｒｅ．１ｅａｓｅｄｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｎｅｕｒｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄＭＭＰｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｉｄ，ＢｉｍａｎｄＰｕｍａｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｇｒｏｕｐＰＳ（Ｐ＜０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＰｒｏｐｏｆｏｌｐｏｓｔｅｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｒｅｄｕｃｅｓＯＧＤ／Ｒ・ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｊｕｒｙｔＯｒａｔｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｔｈｒｏｕｇｈａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐ３８ＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｒｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓＢｉｄ，ＢｉｍａｎｄＰｕｍａ．【ＫｅｙｗｏｒｄｓｌＰｒｏｐｏｆｏｌ；Ｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ；Ｃｅｌｌｈｙｐｏｘｉａ；Ｏｘｙｇｅｎ；Ｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｄｅｘ；Ｎｅｕｒｏｎｓ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ；Ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎ异丙酚是临床常用的镇静药物，研究表明，异丙吸管轻轻吹打２—３下，使用２００目滤网过滤，收集酚后处理可减轻脑缺血再灌注损伤…。细胞凋亡所得细胞悬液，在倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一日。。Ｂｉｄ、Ｂｉｍ下计数神经元，并计算神经元密度，用接种液将神经和Ｐｕｍａ是Ｂｃｌ一２家族重要的促凋亡蛋白，在细胞凋元密度调至ｌ×１０６个／ｉｎｌ，然后接种于预先经多聚赖亡中起重要作用¨１。ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶氨酸处理的６孔板（２ｍｌ／孑Ｌ）；将６孑Ｌ板放入３７℃、（ｐ３８ＭＡＰＫ）是ＭＡＰＫ家族的重要成员，研究表明，５％ＣＯ：的培养箱中培养，２４ｈ后使用无菌的ＰＢＳ冲ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路参与了脑缺血再灌注损伤Ｈ１，其洗杂质，更换为神经元专用培养基（９６％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋机制可能与减少神经元凋亡有关∞１。本研究拟评２％Ｂ２７＋２％谷氨酰胺）（Ｈｙｅｌｏｎｅ公司，美国），以后价异丙酚后处理对大鼠氧糖缺失．复氧复糖皮质神每隔２～３ｄ使用神经元专用培养基，半量换液１次。经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ活性的影响及其与ｐ３８ＭＡＰＫ培养至７ｄ的原代大鼠皮质神经元通过神经元特异信号通路的关系，探讨其脑保护作用的机制，为临床表达蛋白ＮＳＥ免疫组化染色，进行神经元鉴定，其研究提供理论依据。阳性表达率超过９５％可继续用于实验。材料与方法将培养成功的大鼠原代皮质神经元采用随机数字表法分为４组（ｎ＝４２）：对照组（ｃ组）、氧糖缺失－出生２４ｈ内的ＳＤ大鼠，由沧州市中心医院中复糖复氧组（ＯＧＤ／Ｒ组）、异丙酚后处理组（Ｐ组）和心实验室提供。参照文献［６］介绍的方法并进行改异丙酚后处理＋ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂组（Ｐｓ组）。良，培养原代皮质神经元。大鼠断头，取脑组织置于ＯＧＤ／Ｒ组、Ｐ组和Ｐｓ组将培养至７ｄ的大鼠原无菌的Ｄ．Ｈａｎｋ液中，剥离大脑皮质，并在Ｄ—Ｈａｎｋ代皮质神经元用ＰＢＳ洗涤３次，并更换为无糖培养液中将皮质剪成１ＩｎｉｎｘｌＩｎｎｉｎｘｌｍｍ大小的组织块，基ＢＢＳ（ＮａＣｌ１１６ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣＩ５．４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＳＯ。放入１５ｍｌ离心管中（以上操作均在冰板上进行）。０．８Ｉｎｉｎｏｌ／Ｌ、Ｎａｉｌ２Ｐ０４１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣ０３２６．２加入等量０．１２５％胰酶（ＨｙＣｌｏｎｅ公司，美国）后，使ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ，１．８ｍｍｏｌ／Ｌ、甘氨酸Ｏ．０２Ｉｎｍｏｌ／Ｌ、酚磺其终浓度为０．０６２５％；于ＣＯ：培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ公司，酞２Ｉｎｇ／Ｌ），向培养基中以２Ｌ／ｉｎｉｎ的速率持续通入美国）中消化１２ｒａｉｎ，期间６ｒａｉｎ时轻摇１次。消化１００％Ｎ：３０ｒａｉｎ，置入低氧培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ公司，美结束后，加入等量接种液（ＤＭＥＭ、１０％胎牛血清、国）中。向低氧培养箱中持续通入９５％Ｎ：和５％１０％马血清）（Ｈｙｅｌｏｎｅ公司，美国）终止胰酶的消化ＣＯ，，９０ｒａｉｎ后取出培养板，更换为神经元专用培养反应。离心５ｍｉｎ弃上清，加入２～３ｍｌ接种液，用基。Ｐ组和Ｐｓ组复氧复糖即刻于培养基内加入异万方数据主堡盎醛堂苤查！！！！至！旦箜！！鲞蔓！塑！！尘！皇！！！尘型！！！丛！！！！垫！！！！生：！！！！！：！丙酚原液（批号：１４０６０４２，四川国瑞药业有限责任公司），终浓度５０ｉｘｍｏｌ／Ｌ，ＯＧＤ／Ｒ组培养基内加入等容量ＰＢＳ，置于３７℃、５％ＣＯ：的培养箱中孵育２ｈ，然后将神经元用ＰＢＳ洗涤３次，更换为神经元专用培养基继续培养２２ｈ；Ｃ组将皮质神经元用ＰＢＳ洗涤３次，置于３７ｑＣ、５％ＣＯ：的培养箱中培养２４ｈ。ＰＳ组于氧糖缺失前１ｈ时培养基内加入ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０２１９０（批号：１３０６９．５５，Ｃａｙｍａｎ公司，美国），终浓度为５０ｔｔｍｏｌ／Ｌ。采用ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ／ＰＩ双染色法测定神经元凋亡情况。每组取６孔神经元，经０．１２５％胰酶消化后，ＰＢＳ洗涤２次，重悬于２００“ｌ缓冲液中；加入５“ｌＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ试剂（Ｓｉｇｍａ公司，美国），室避光温孵育１５～２０ｒａｉｎ；加入５０弘ｇ／ｍｌＰｔ（Ｓｉｇｍａ公司，美国）１０“ｌ，补加缓冲液２００Ｉｘｌ，采用ＦＡＣＳ４２０型流式细胞仪（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司，美国）检测细胞凋亡率，重复测定３次，取其平均值。采用ＭＴＴ法测定神经元存活情况。每组取６孔神经元，加入５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液（批号：ＡＲｌｌ５６，武汉博士德生物工程有限公司）２０斗ｌ孵育４ｈ。弃上清液后，每孔加入１５０“１二甲基亚砜并震荡１０ｒａｉｎ，采用酶标仪（ＢｉｏＴｅｋ公司，美国）于４９０ａｍ波长处测定吸光度值，计算神经元存活率＝（实验组吸光度值一空白组吸光度值）÷（Ｃ组吸光度值一空白组吸光度值）×１００％。每孔重复测定３次，取平均值。采用比色法测定乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）漏出情况。每组取６孔神经元，收集神经元培养液上清，１３０００转／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，离心半径６ｃｍ，取１００¨ｌ上清液转移至９６孔板，按试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）说明书加入反应试剂，采用分光光度计（Ｔｈｅｒｍｏ公司，美国）于４９２ｎｍ波长处测定吸光度值，以６５５ｎｍ波长处作为参照。取细胞悬液，用０．５％Ｔｒｉｔｉｏｎ孵育３０ｒａｉｎ，测定细胞内ＬＤＨ水平。计算ＬＤＨ漏出率＝上清液ＬＤＨ水平÷（上清液ＬＤＨ水平＋细胞内ＬＤＨ水平）ｘ１００％，重复测定３次，取平均值。每组取６孔神经元，用０．１２５％胰蛋白酶消化，１０００转／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，离心半径１３．５ｅｍ；ＰＢＳ洗涤２次，弃上清，加入０．５ｍｌＰＢＳ混匀，再加入５ｉｘｍｏｌ／ＬＪＣ一１（Ｓｉｇｍａ公司，美国），３７℃避光孵育３０ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤３次，ＦＶ３００型激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）下观察荧光强度，激发波长为４９０ｎｍ，发射波长为５３０ｎｍ，以荧光指数反映线粒体膜电位（ＭＭＰ）水平。采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定皮质神经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和万方数据Ｐｕｍａ的表达。每组取１８孔神经元，加入细胞裂解液，煮沸法使蛋白变性，使用ＢＣＡ蛋白定量试剂盒（碧云天生物制剂有限公司）检测蛋白浓度。取５０仙ｇ蛋白上样后，６％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电流恒定进行电泳，电压恒定湿转至ＰＶＤＦ膜，５％脱脂奶粉室温封闭１ｈ；ＴＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｍｉｎ，分别滴加Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｐｕ－ｍａ的多克隆抗体（稀释度均为１：５００，ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，美国），３７℃孵育ｌｈ；ＴＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｒａｉｎ，加入山羊抗兔二抗（稀释度１：１０００，武汉博士德生物工程有限公司），２５ｏＣ孵育１ｈ；ＴＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｒａｉｎ，ＥＣＬ发光。采用ＩｍａｇｅＪ２．１软件（Ｎａ—ｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｌｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ公司，美国）测定条带积分光密度值，以目的蛋白条带积分光密度值与内参ＧＡＤ・ＰＨ条带积分光密度值的比值反映目的蛋白的表达水平。采用ＳＰＳＳ１１．５统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ｘ＋ｓ）表示，组问比较采用单因素方差分析，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结果与Ｃ组比较，ＯＧＤ／Ｒ组、Ｐ组和ＰＳ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率升高，神经元存活率和ＭＭＰ水平降低，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达上调（Ｐ＜０．０５）；与ＯＧＤ／Ｒ组比较，Ｐ组和ＰＳ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率降低，神经元存活率和ＭＭＰ水平升高，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达下调（Ｐ＜Ｏ．０５）；与Ｐ组比较，ＰＳ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率升高，神经元存活率和ＭＭＰ水平降低，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达上调（Ｐ＜Ｏ．０５），见表Ｉ，２。表Ｉ四组大鼠皮质神经元凋亡率、存活率、ＬＤＨ漏出率及ＭＭＰ水平的比较（１７．＝６，ｉ±ｓ）注：与Ｃ组比较，８Ｐ＜Ｏ．０５与０ＧＤ／Ｒ组比较，“Ｐ＜０．０５与Ｐ组比较，。Ｐ＜０．０５表２四组大鼠皮质神经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ表达的比较（ｎ＝１８，ｉ±ｓ）注：与Ｃ组比较，１Ｐ＜Ｏ．０５与ＯＧＤ／Ｒ组比较，６Ｐ＜Ｏ．０５与Ｐ组比较，。Ｐ＜Ｏ．０５！堡壁醛堂盘查！！！！生ｉ旦塑堑鲞釜！塑璺！！！！！！塑生型！！！塑！堕！！！！：∑！！：！！：型！：ｉ３７９讨论与原代培养大鼠海马神经元比较，原代培养的大鼠皮质神经元活力强，分离纯度高，因此本研究参照文献［６］介绍的方法并进行改良，培养大鼠原代皮质神经元。本研究参照文献［７］并结合预实验结果，采用氧糖缺失９０ｍｉｘ，复氧复糖２４ｈ的方法制备大鼠皮质神经元氧糖缺失一复氧复糖损伤模型，结果表明，与Ｃ组比较，ＯＧＤ／Ｒ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率升高，神经元存活率和ＭＭＰ水平降低，提示模型制备成功。本研究参照文献［８］，选择异丙酚后处理的浓度为５０ｔｘｍｏｌ／Ｌ，时问为２ｈ，结果表明，与ＯＧＤ／Ｒ组比较，Ｐ组神经元凋亡率和ＬＤＨ漏出率降低，神经元存活率和ＭＭＰ水平升高，提示异丙酚后处理减轻了大鼠皮质神经元氧糖缺失－复氧复糖损伤。作为Ｂｃｌ一２家族中的唯ＢＨ３域蛋白，Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｐｕｍａ可通过激动Ｂａｋ、Ｂａｘ或者使Ｂｅｌ・２、Ｂｃｌ－ＸＬ和ＭＣＬ．１失活，促进Ｂａｋ和Ｂａｘ形成寡二聚体，介导细胞色素ｃ从线粒体释放入细胞质，激活ｃａｓｐａｓｅ家族，从而促进细胞凋亡一‘１…。本研究采用经典的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定皮质神经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达，保证了收集数据的客观性。本研究参照文献［１１］选择ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０２１９０的浓度为５０Ｉｘｍｏｌ／Ｌ，作用时间为１ｈ，结果表明，给予异丙酚后处理的氧糖缺失一复糖复氧皮质神经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达下调；而ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路被阻断后，皮质神经元Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的表达上调，提示异丙酚后处理可通过激活ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路，抑制促凋亡蛋白Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的活性，减轻大鼠皮质神经元氧糖缺失一复糖复氧损伤。本研究中即使加人了ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０３５８０，异丙酚后处理的神经保护作用仍不能完全消除，表明异丙酚后处理还可能通过其他信号通路发挥神经保护作用。综上所述，异丙酚后处理可通过激活ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路，抑制促凋亡蛋白Ｂｉｄ、Ｂｉｍ和Ｐｕｍａ的活性，减轻大鼠皮质神经元氧糖缺失．复糖复氧损伤。参考文献［１］ＳｈｉＳＳ，ＹａｎｇＷＺ，ＣｈｅｒｔＹ，ｅｔａ１．Ｐｒｏｐｏｆｏｌｒｅｄｕｃｅｓｉｎｆｌａｍｍａ・万方数据ｔｏｒｙｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｉｓｃｈｅｒｎｉｃｂｒａｉｎｄａｍａｇｅｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｃｈｅｍＲｅｓ，２０１４，３９（５）：７９３—７９９．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１０６４－０１４—１２７２．８．［２］ＥｋｓｈｙｙａｎＯ．Ａｗ１＇Ｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎａｃｕｔｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｎｅｕｒｏｌｏｇｉ－ｃａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｅｉ，２００４，９：１５６７—１５７６．［３１ＲｅｎＤ，ＴｕＨＣ，ＫｉｍＨ，ｅｔａ１．ＢＩＤ，ＢＩＭ，ａｎｄＰＵＭＡａｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢＡＸ．ａｎｄＢＡＫ・ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｄｅａｔｈｐｒｏｇｒａｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３３０（６００９）：１３９０－１３９３．ＤＯＩ：ｌＯ１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１９０２１７．［４］ＰａｒｋＳＹ，ＪｉｎＭＩ．，ＫｉｍＹＨ，ｅｔａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｈｅｉｎｅｏｘｙｇｅ．ｎａｓｅ・１ｉｎｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｙｓａｎｇｕｉｎａｒｉｎｅａｇａｉｎｓｔｇｌｕｔａｍａｔｅ－ｔｒｉｇ－ｇｅｒｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎ１１Ｔ２２ｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＴｏｘｉｅｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１４，３８（３）：７０１—７１０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｅｔａｐ．２０１４．０８．０２２．［５］ＷａｎｇＹ，ＺｈｅｎＹ，ＷｕＸ，ｅｔａ１．Ｖｉｔｅｘｉｎｐｒｏｔｅｃｔｓｂｒａｉｎａｇａｉｎｓｔｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｖｉａｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏ・ｔｅｉｎｋｉｎａｓｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，２２（３）：３７９・３８４．ＤＯＩ：１０．１０１６１ｊｐｈｙｍｅｄ．２０１５．０１．００９．［６］ＺｈａｎｇＬ，ＺｈａｏＸ，ＪｉａｎｇＸ．Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅｐｏｓｔ・ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏ・ｔｅｃｔｓｐｒｉｍａｒｙｒａｔｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓａｇａｉｎｓｔｏｘｙｇｅｎ＋ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａ．ｔｉｏｎ／ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅｓｏｆｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅｌ／２ａｎｄＢｉｄ，Ｂｉｍ，Ｐｕｍａ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｃｈｅｍＲｅｓ，２０１５，４０（８）：１６０９－１６１９．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１０６４－０１５・１６３９—５．［７］ＺｈａｎｇＬＭ，ＺｈａｏＸＣ，ＳｕｎＷＢ，ｅｔａ１．Ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅｐｏｓｔ－ｃｏｎｄｉ—ｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓｐｒｉｍａｒｙｒａｔｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓａｇａｉｎｓｔｏｘｙｇｅｎ—・ｇｌｕ・－ｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ，ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎｖｉａｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉ－ａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｘｉｓｏｆＢｉｄ，Ｂｉｍ，Ｐｕｍａ－ＢａｘａｎｄＢａｋｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＥｒｋｌ／２［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｌＳｅｔ，２０１５，３５７（１－２）：８０－８７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｎｓ．２０１５．０６．０７０．ｆ８］ＢｅｒｎｓＭ，ＳｅｅｂｅｒｇＬ，ＳｃｈｍｉｄｔＭ，ｅｔａｌ，Ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅｐｒｏｐｏｆｏｌｔｒｉｇｇｅｒｓｓｈｏｒｔ・ｔｅｒｍｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａ・・ｔｉｏｎｉｎｐｒｉｍａｒｙｎｅｕｒｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｓｆｒｏｍｒａｔｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．ＪＩｎｔＭｅｄＲｅｓ，２００９，３７（３）：６８０－６８８．：９］ＬｅｔａｉＡ，ＢａｓｓｉｋＭＣ，ＷａｌｅｎｓｋｙＬＤ，ｅｔａ１．ＤｉｓｔｉｎｃｔＢＨ３ｄｏ—ｍａｉｎｓｅｉｔｈｅｒｓｅｎｓｉｔｉｚｅｏｒａｃｔｉｖａｔｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｓｅｒｖｉｎｇａｓｐｒｏｔｏｔｙｐｅｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ，２００２，２（３）：１８３—１９２．ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：∥ｄｘｄｏｔ．ｏｒｇｌｌ０．１０１６／Ｓ１５３５・６１０８（０２）００１２７．７．［１０］ＫｕｗａｎａＴ，Ｂｏｕｃｈｉｅｒ・ＨａｙｅｓＬ，ＣｈｉｐｕｋＪＥ，ｅｔａ１．ＢＨ３ｄｏｍａｉｎｓｏｆＢＨ３一ｏｎｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｇｕｌａｔｅＢａｘ—ｍｅｄｉａｔｅｄｍｉｔｏ—ｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｏｔｈｄｉｒｅｃｔｌｙａｎｄｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ［Ｊ】．ＭｏｌＣｅｌｌ，２００５，１７（４）：５２５—５３５．ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：∥ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｒｎｏｌｃｅｌ．２００５０２，００３．ＬｕｏＹ，ＺｈｕＷ，ＪｉａＪ，ｅｔａ１．ＮＭＤＡｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔＰＧＣ一１ａｌｐｈａｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｃｔｓｔｈｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎａｇａｉｎｓｔｏｘｙｇｅｎ—ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．ＪＭｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，３９（１—２）：２６２—２６８．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１２０３１－００９・９１９６—５，（收稿日期：２０１５－０７－２７）（本文编辑：王娟）
