实验六 阿司匹林原料药中水杨酸的液相色谱分析测定
一、实验目的
1. 掌握高效液相色谱定性、定量的原理及方法。 2. 了解高效液相色谱仪的结构和操作。 3. 了解高效液相色谱一般实验条件。
二、实验原理
1. 高效液相色谱分离的基本原理
分析试样中各组分在流动相推动下，通过装有固定相的色谱柱到达检测器。由于不同化合物分子结构和物理化学性质不同，与固定相及流动相的作用力不同，在两相中具有不同的分配系数，各组分在两相中进行反复分配而被分离。在同一色谱条件下，标准物质与待测样品中同一化合物保留时间一致是色谱法定性的基本依据。
定量分析首先要选择合适的色谱柱和洗脱液系统及对被分析物反应较为灵敏的检测器。被测组分要与其他成分有足够的分离度。一般要求被定量的物质与相邻组分的分辨率要大于1.5，分辨率Rs用下式计算：
2（tR2-tR1） Rs= —————— ω1+ω2
式中：tR2-tR1为两个组分的保留时间之差；ω1、ω2为两个谱带基线宽度。当Rs≥1时，峰面积重叠小于2%，定量结果比较准确。
2. 外标校正曲线法定量
校正曲线是通过测定一系列已知浓度的标准样品，经曲线拟合而得到的含量-响应值（峰面积或峰高）的曲线。测定待分析样品的响应值后，用校正曲线进行含量计算的方法为外标法。
3. 水杨酸含量分析
阿司匹林（乙酰水杨酸）为常用的解热镇痛药，并被用于防治心脑血管病。由于其很容易降解为水杨酸，药物中水杨酸含量测定被用于阿司匹林的质量监测。用液相色谱法可以很好地分离阿司匹林和水杨酸，水杨酸的含量可用外标法进行定量测定。
三、仪器与试剂
1. 高效液相色谱仪（包括高压输液泵、进样阀及紫外检测器）
固定相：C18键合多孔硅胶小球，5μm。 柱尺寸：150mm×4.6mm I.D.。 20μL定量环。
2. 试剂
双蒸水；甲醇（色谱纯）；冰醋酸（分析纯）；水杨酸（标准品）；乙酰水杨酸（阿司匹林）（原料药品）。
四、实验步骤
1.标准溶液及样品溶液的配制
（1）水杨酸标准溶液的配制
称取水杨酸标准品8.1mg，溶解后，转移至1000mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为水杨酸储备液。分别吸取此储备液1.00mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
（2）阿司匹林样品溶液配制
称取阿司匹林原料药10mg，用流动相溶解后，转移至100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为阿司匹林样品储备液。吸取此储备液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
2.色谱分析
（1）色谱条件
检测波长：300nm。
流动相：甲醇-水-冰醋酸（体积比60:40:4）
流速：1 mL∕min。 温度：室温。 （2）操作程序
当基线温度后通过进样阀进行水杨酸标准溶液色谱分析，用数据处理系统绘制标准曲线。标准曲线的相关系数应为0.998以上。进行阿司匹林样品溶液色谱分析，用外标法计算样品中水杨酸含量。
五、实验数据及结果
利用色谱工作站软件，按外标校正曲线法计算阿司匹林中水杨酸的质量分数。
1. 用数据处理系统绘制标准曲线
在“method”文件中选择外标法（ESTD）。 在菜单中选择“data analysis”，用“load signal”调出最低浓度的水杨酸标准样品数据文件。从“calibration”中选择“new calibration table”，并在显示的窗口中输入“1”作为校正级数（level），在“calibration table”中填入样品浓度值。一个校正水平为一个浓度校正点。用“load signal”依次调出其他浓度的水杨酸标准样品数据文件，同时用“add level”输入其他校正点的校正级数（level）和样品浓度值数据。所得到的校正曲线及相关系数自动显示与右侧窗口。
2. 计算阿司匹林样品中水杨酸的含量
用“load signal”打开阿司匹林样品数据文件，数据处理系统自动根据校正曲线计算出阿司匹林样品溶液中水杨酸的含量（注意：在建立标准曲线时若输入浓度单位为μg∕mL，所得到的浓度单位仍为μg∕mL，在下面的计算中要转换为mg∕mL）。根据下式计算阿司匹林原料药中水杨酸的含量：
水杨酸的含量（%）=（c×10×100∕m）×100
式中：c为阿司匹林样品溶液中水杨酸浓度（mg∕mL）；m为阿司匹林原料药称量质量（mg）。
六、注意事项
（1）实验步骤按照Agilent 1100液相色谱仪器具体操作方法写
成，不同的色谱仪在操作指令上会有所不同。
（2）实验条件（主要是流动相配比）可以根据实际情况进行调整。 （3）实验结束后，以甲醇-水（体积比60:40）为流动相冲色谱柱约30min。
七、思考题
1、使用C18色谱柱时，如果采用甲醇-水（体积比50：:50）作为流动
相，求该流动相的强度因子。如果改用乙腈-水作为流动相，若保持相同的强度因子，其体积比应为多少？
2、在其他HPLC色谱条件不变，仅改变下列一种条件，色谱峰的保留时
间与峰形将发生怎样的变化？ （a） 流动相流速增加； （b） 柱温升高； （c） 色谱柱增长； （d） 固定相粒径变大；
（e） 在线性范围内增大进样量
3、什么是化学键合固定相？有何优点？
