2013年分子生物学研究生课程考核

考试科目名称：现代分子生物学

姓名： 李谕 学号： S132210003 专业： 生物学

一.简答题（40分，每题10分）

1. 请举出细胞中各种RNA分子的名称, 特征和功能。（至少列出5种） 答：mRNA（信使RNA）

原核生物mRNA一般5′端有一段不翻译区，称前导顺序，3′端有一段不翻译区，中间是蛋白质的编码区，一般编码几种蛋白质。真核生物mRNA（细胞质中的）一般由5′端帽子结构、5′端不翻译区、翻译区（编码区）、3′端不翻译区和3′端聚腺苷酸尾巴构成分子中除m7G构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如m6A等。真核生物mRNA通常都有相应的前体。从DNA转录产生的原始转录产物可称作 原始前体（或mRNA前体）。一般认为原始前体要经过hnRNA核不均-RNA的阶段，最终才被加工为成熟的mRNA。

功能：从 (DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链（RNA），它在上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的排列顺序。 tRNA（转运RNA）

三叶草形二级结构，①5’末端具有G（大部分）或C。 ②3’末端都以ACC的顺序终结。 ③有一个富有鸟嘌呤的环。

④有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子

（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。 ⑤有一个胸腺嘧啶环。

功能：主要是携带氨基酸进入核糖体，在mRNA指导下合成蛋白质。即以mRNA为模板，将其中具有密码意义的核苷酸顺序翻译成蛋白质中的氨基酸顺序。 rRNA（核糖体RNA）rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。rRNA在蛋白质合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。

miRNA：MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。

snRNA (smallnuclearRNA，小核RNA）。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。某些snRNPs和剪接作用密切相关，它们分别与供体和受体剪接位点以及分支顺序相互补。

其中位于核仁内的snRNA称为核小体RNA（small uncleolar RNA），参与rRNA

前体的加工及核糖体亚基的组装。 2. 试述酵母双杂交技术的原理及应用。

原理：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 应用：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基

因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。

3.简述对天然质粒进行人工构建或改造的原则。

答：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。一般可以是： 修改 ORI （复制起始位点） 添加抗生素抗性基因

添加 MCS （多克隆位点）区域 敲除转座子

敲除不用的蛋白编码段

4. 请描述修正后的中心法则内容。

答：中心法则(genetic central dogma)，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。也可以是逆转录过程。

这里遗传信息的转移可以分为两类：第一类用实线箭头表示，包括DNA的复制、RNA的转录和蛋白质的翻译，即①DNA→DNA（复制）；②DNA→RNA（转录）；③RNA→蛋白质（翻译）。这三种遗传信息的转移方向普遍地存在于所有生物细胞中。第二类用虚线箭头表示，是特殊情况下的遗传信息转移，包括RNA的复制，RNA反向转录为DNA和从DNA直接翻译为蛋白质。即①RNA→RNA（复制）；②RNA→DNA（反向转录）；③DNA→蛋白质。RNA复制只在RNA病毒中存在。反向转录最初在RNA致癌病毒中发现，后来在人的白细胞和胎盘滋养层中也测出了与反向转录有

关的反向转录酶的活性。至于遗传信息从DNA到蛋白质的直接转移仅在理论上具可能性，在活细胞中尚未发现。

二. 实验设计题（60分）

运用你所学的分子生物学知识和可能的实验经验，设计如何去研究一个新基因的生理功能。实验设计方案应包括实验目的，实验内容，技术路线，预期结果与讨论，意义等。

实验目的; 研究一个新基因的生理功能

实验内容:通过该基因的表达量对表型影响来观测相关基因的功能。 技术路线：

1．利用生物信息学方法分析基因的功能。主要通过序列比对预测基因功能和利用生物信息学方法分析基因芯片数据分析。根据同源性可从数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。

2．基因失活在基因功能分析的作用 。主要包括基因剔除（knock-out）、反义RNA技术、插入突变、RNA干扰等。

3．基因的超表达用于功能检测。原理：超量表达是指将目的基因全长序列与高

活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。重要逆境调控基因微小的表达变化就可以引起下游基因的积累效应，有可能使生物体表型发生可评估的变化，使其功能凸现。

4．杂交原理的方法检测mRNA表达水平。Northern印迹（Northern blot）与RT-PCR方法。

5．蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化检测目的蛋白的表达。

预期结果：如果该基因缺失，该植株抗寒性减弱，过表达，抗寒性增强，则说明该基因功能与抗寒性有关。

讨论：可能基因的过表达或者缺失与抗寒性表现不明显，可能与抗寒性与多个基因共同作用。

意义：对该信号转导途径有了更深刻理解，了解抗性基因在信号途径中作用。