一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗及其制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109045291 A(43)申请公布日 2018.12.21

(21)申请号 201811160764.1(22)申请日 2018.09.30

(71)申请人 江苏省农业科学院

地址 210014 江苏省南京市钟灵街50号(72)发明人 冯志新　邵国青　熊祺琰　白昀　

韦艳娜　甘源　袁厅　张珍珍　林家彬　(74)专利代理机构 南京汇盛专利商标事务所

(普通合伙) 32238

代理人 袁静(51)Int.Cl.

A61K 39/02(2006.01)A61K 47/40(2006.01)A61K 9/12(2006.01)A61P 31/04(2006.01)

权利要求书1页 说明书11页

(54)发明名称

一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗及其制备方法

(57)摘要

本发明提供一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗及其制备方法，涉及动物疫苗领域。该气溶胶活疫苗，是将疫苗溶液雾化后得到的，所述疫苗溶液是将猪肺炎支原体弱毒株悬浮于疫苗稀释液后得到的；所述稀释液是含有如下成分的水溶液：聚乙二醇6000 10~50 g/L、环糊精1~10 g/L、硫代硫酸钠5~20 g/L、L-组氨酸10~20g/L，pH值6.8-7.6。本发明还提供该疫苗的制备方法，包括：将猪肺炎支原体弱毒株的菌液或冻干品，用疫苗稀释液配制溶液，通过超声雾化法制成气溶胶活疫苗；所述气溶胶活疫苗的空气动力学质量中位粒径为1-5μm，有效抗原浓度不低于50%。本发明活疫苗，在空气中滞留30分钟后，仍然具有较高滴度，免疫保护率高、免疫持续期长，制备简单，成本低。

CN 109045291 ACN 109045291 A

权　利　要　求　书

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1.一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，是将疫苗溶液雾化后得到的，其特征在于，所述疫苗溶液是将猪肺炎支原体弱毒株悬浮于疫苗稀释液后得到的；所述疫苗稀释液是含有如下成分的水溶液：聚乙二醇6000 10~50 g/L、环糊精1~10 g/L、硫代硫酸钠5~20 g/L、L-组氨酸10~20g/L，pH值6.8-7.6。

2.根据权利要求1所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，其特征在于所述的疫苗稀释液中还含有黏膜佐剂，所述黏膜佐剂为壳聚糖、Gel01、PolyI:C、大肠杆菌不耐热肠毒素、CpG、IL-12、ISCOM中的一种或两种以上的混合物。

3.根据权利要求2所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，其特征在于所述疫苗稀释液中壳聚糖的浓度为0.05-5g/L；所述疫苗稀释液中Gel01的浓度为1-30g/L、所述疫苗稀释液中PolyI:C的浓度为10-1000mg/L;所述疫苗稀释液中大肠杆菌不耐热肠毒素的浓度为1-10mg/L;所述疫苗稀释液中CpG的浓度为1-100mg/L;所述疫苗稀释液中IL-12的浓度为0.1-5mg/L、所述疫苗稀释液中ISCOM的浓度为0.1-1g/L。

4.根据权利要求1或2所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，其特征在于所述猪肺炎支原体弱毒株为168株。

5.权利要求4所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将猪肺炎支原体弱毒株的菌液或冻干品，用疫苗稀释液配制成猪支原体肺炎活疫苗溶液；（2）将步骤（1）所得的猪支原体肺炎活疫苗溶液通过超声雾化法制成气溶胶活疫苗；所述气溶胶活疫苗的空气动力学质量中位粒径为1-5μm，有效抗原浓度不低于50%。

6.根据权利要求5所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，其特征在于所述猪肺炎支原体弱毒株的菌液与疫苗稀释液体积比为1:1-100；所述猪肺炎支原体弱毒株冻干品冻干前体积与疫苗稀释液体积之比为1:1-100。

7.根据权利要求6所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，其特征在于所述超声雾化法所用雾化设备是振荡频率为1.7-2.4 MHz的超声雾化器。

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一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗及其制备方法

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技术领域

[0001]本发明涉及动物疫苗领域，具体涉及一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗及其制备方法。

技术背景

[0002]猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体感染引起的一种接触性慢性呼吸道传染病。本病遍布全球，并且易与其它病原发生混合感染，引起更严重的肺部病变，产生更大的经济损失。疫苗免疫是预防该病的主要方法。目前市场上可供选择的疫苗主要分为进口灭活疫苗和国产弱毒疫苗。由于猪肺炎支原体只局部定植于猪支气管、细支气管等下呼吸道，不随血液循环进入全身。因此猪支原体肺炎灭活疫苗免疫后产生的血清抗体与免疫保护无关，灭活疫苗免疫后也无法阻止猪肺炎支原体野毒对支气管纤毛的定植，因此免疫保护效率一般。而我国研制的猪支原体肺炎活疫苗(168株)直接将疫苗株接种至肺部，可模拟野毒感染产生长期的占位效应，而抑制野毒的感染；同时活疫苗免疫还可产生与免疫保护直接相关的呼吸道特异性黏膜sIgA抗体，免疫保护效果优良，2007在国内市场推广使用以来，临床使用效果显著。然而该活疫苗目前所采用肺内注射免疫途径不利于大规模推广，若能将猪支原体肺炎活疫苗制成雾化剂型，则不仅能提高疫苗接种的方便性，而且大大节省了劳动力和劳动时间，达到更好推广免疫该疫苗的目的，充分实现活疫苗优于灭活疫苗的特质。[0003]要实现气溶胶疫苗的高效免疫就必须保证有足够多的活性疫苗株可以进入猪的下呼吸道。因此必须对气溶胶疫苗的粒径与活性两项参数进行严格监测。由于猪鼻甲骨与气管解剖结构的特点，只有空气动力学质量中位粒径(MMAD)为1～10μm的微粒经气雾以适当的角度可以进入呼吸道，其中粒径为1～5μm的颗粒可较为顺利地随呼吸进入支气管与细支气管，而较粗的颗粒大部分落在上呼吸道鼻腔黏膜上，无法对疫苗起到靶向作用。如果微粒太细(≤0.5μm)，则进入肺泡囊后又随呼气排出，所以必须将猪支原体肺炎雾化活疫苗的粒径控制在1～10μm内，最好是1～5μm之间。除了气溶胶疫苗粒径因素以外，气溶胶在发生过程中会有很多因素影响微生物的活力，比如气溶胶生成过程中的切削力、高压力影响气溶胶微生物活力的因素。气溶胶生成过程中的切削力和高压力越大，雾化粒子越小，但疫苗株的活力也越低。除了切削力、高压力等作用力外，影响气溶胶微生物活力的因素还有环境因素，如在低湿、高温环境下，雾化疫苗中水份快速蒸发，盐代谢失调和急剧的干燥作用、氧化作用使雾化疫苗活力大大降低。随着气溶胶在空气中持续时间的延长，环境对活性的影响会愈发明显。

[0004]专利号为201210275639.1、名称为“一种猪支原体肺炎雾化活疫苗的制备与检验方法”的发明专利，采用吹气式雾化法或水力式雾化法制备出粒径为1～10μm、瞬时滴度下降0.25～1个滴度以内的猪肺炎支原体气溶胶疫苗。在该发明专利中，采用的疫苗定量收集装置仅能收集雾化刚发生时、尚未完全分散并滞留在空气中一定时间的气溶胶疫苗(若雾化结束后收集，收集到的气溶胶疫苗较少，转化成液态苗的效率太低)，无法准确评价环境因素对气溶胶疫苗活性的影响。申请人在后续研究过程中发现，虽然疫苗溶液在刚形成气

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溶胶疫苗时，滴度下降较低，但是随着在空气中滞留时间的延长，活性下降显著，造成了免疫保护率较低。

发明内容

[0005]本发明的目的是提供一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，在空气中滞留30分钟后，仍然具有较高滴度，免疫保护率高、免疫持续期长。

[0006]本发明的另一目的是提供猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，该方法简单，成本低。

[0007]本发明的目的采用如下技术方案实现。[0008]一种猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，是将疫苗溶液雾化后得到的，所述疫苗溶液是将猪肺炎支原体弱毒株悬浮于疫苗稀释液后得到的；所述疫苗稀释液是含有如下成分的水溶液：聚乙二醇6000 10～50g/L、环糊精1～10g/L、硫代硫酸钠5～20g/L、L-组氨酸10～20g/L，pH值6.8-7.6。

[0009]优选的技术方案中，所述的疫苗稀释液中还含有黏膜佐剂，所述黏膜佐剂为壳聚糖、Gel01、PolyI:C、大肠杆菌不耐热肠毒素、CpG、IL-12、ISCOM中的一种或两种以上的混合物。

[0010]优选的技术方案中，所述疫苗稀释液中壳聚糖的浓度为0.05-5g/L；所述疫苗稀释液中Gel01的浓度为1-30g/L、所述疫苗稀释液中PolyI:C的浓度为10-1000mg/L；所述疫苗稀释液中大肠杆菌不耐热肠毒素的浓度为1-10mg/L；所述疫苗稀释液中CpG的浓度为1-100mg/L；所述疫苗稀释液中IL-12的浓度为0.1-5mg/L、所述疫苗稀释液中ISCOM的浓度为0.1-1g/L。

[0011]在本发明中，所述猪肺炎支原体弱毒株为168株。

[0012]本发明还提供所述猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，包括以下步骤：[0013](1)将猪肺炎支原体弱毒株的菌液或冻干品，用疫苗稀释液配制成猪支原体肺炎活疫苗溶液；[0014](2)将步骤(1)所得的猪支原体肺炎活疫苗溶液通过超声雾化法制成气溶胶活疫苗；所述气溶胶活疫苗的空气动力学质量中位粒径为1-5μm，有效抗原浓度不低于50％。[0015]在本发明中，所述猪肺炎支原体弱毒株的菌液与疫苗稀释液体积比为1:1-100；所述猪肺炎支原体弱毒株冻干品冻干前体积与疫苗稀释液体积之比为1:1-100。[0016]优选的技术方案中，所述超声雾化法所用雾化设备是振荡频率为1.7-2.4MHz的超声雾化器。

[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0018]本发明猪支原体肺炎气溶胶活疫苗，在空气中滞留30分钟后，仍然具有较高滴度，免疫保护率达到60％以上，符合我国新兽药评审对猪支原体疫苗的要求，另外，采用该气溶胶活疫苗免疫后，猪只的免疫持续期达到8个月以上。由于猪支原体肺炎气溶胶活疫苗通过气雾免疫就能对猪只进行免疫，提高疫苗接种的方便性，大大节省了劳动力和劳动时间。[0019]本发明猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备方法，使用的超声雾化，方法更简便、低成本，在养殖场利于规模化推广，并可实现自动化。

[0020]本发明采用更准确的空气动力学质量中位粒径(MMAD)替代以往的空气动力学总

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粒子中位直径(NMAD)来检测气溶胶疫苗颗粒的大小，发现制备的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的粒径更细，MMAD控制在1～5μm内，且粒度分布更集中(几何标准偏差GSD更接近于1)，可保证更多有效气溶胶疫苗进入猪的支气管与细支气管等下呼吸道靶器官，产生更高的免疫保护；

[0021]本发明由于雾化方式的改变，更新了稀释液配方，从而大大减少了因雾化过程对疫苗造成的损伤，尤其是在空气中自然漂浮30分钟后，疫苗滴度仅下降≤0.5个滴度。更多活性疫苗株的存在，保证了更高效、更持续的免疫保护。具体实施方式

[0022]本发明中使用的猪肺炎支原体168株冻干菌种：将2ml猪肺炎支原体168株培养物装入1个5ml的西林瓶中冻干，获得猪肺炎支原体168株冻干菌种。每瓶冻干菌种采用2ml疫苗稀释液复溶后的滴度为5×107CCU/ml。猪肺炎支原体168株是目前国内商业化猪支原体肺炎活疫苗(168株)的疫苗株。猪肺炎支原体168株培养物是指该菌种采用常规培养基培养所得培养物。

[0023]实施例1猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备与检验[0024]1.菌种

[0025]猪肺炎支原体168株冻干菌种，每瓶冻干前装有2ml猪肺炎支原体168株培养物。[0026]2.疫苗稀释液配制

[0027]疫苗稀释液A是含有下列物质的水溶液：0.1g/L壳聚糖(分子量150KDa)、20g/L PEG6000(聚乙二醇6000)、2g/L环糊精、10g/L硫代硫酸钠、10g/L L-组氨酸，pH值7.4。[0028]具体配制方法如下：[0029](1)先将聚乙二醇6000、环糊精、硫代硫酸钠和L-组氨酸溶于水，调节pH值为7.4，得到疫苗保护剂溶液。[0030](2)将壳聚糖粉末投入到适量的醋酸水溶液中充分溶解后，用NaOH溶液调节pH至中性，得到10g/L的壳聚糖母液。[0031](3)将壳聚糖母液加入到疫苗保护剂溶液中，使得壳聚糖的终浓度达到0.1g/L，其他物质的终浓度为：PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，调节pH值至7.4，得到疫苗稀释液。[0032]3.制备气溶胶疫苗

[0033]每瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种采用200ml疫苗稀释液A溶解(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)，得到疫苗溶液。

[0034]将疫苗溶液倒入振荡频率为1.7MHz的超声雾化器进行雾化，得到气溶胶疫苗。[0035]4.气溶胶疫苗性质的检测[0036](1)粒径检测

[0037]采用本实施例标题3中方法制备猪肺炎支原体168株的气溶胶疫苗，将该气溶胶疫苗通入雾化箱，将雾化箱底部开孔与气溶胶粒径谱仪检测口连接，气溶胶疫苗喷雾2分钟后，开启气溶胶粒径谱仪电源，对气溶胶疫苗颗粒进行检测。结果如下：气溶胶疫苗颗粒的空气动力学质量中位粒径(MMAD)为2.64微米，几何标准偏差(GSD)为1.28。[0038](2)有效抗原浓度检测

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按细胞增殖示踪荧光探针染料(CFDA-SE)说明书，将猪肺炎支原体168株菌种染

色，洗涤后，按每瓶冻干菌种用200ml疫苗稀释液A(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)进行溶解，将疫苗溶液倒入振荡频率为1.7-2.4MHz的超声雾化器进行雾化，得到气溶胶疫苗。用洁净的盖玻片采集气溶胶颗粒。采样后把盖玻片立即置于附有凹槽的载玻片上，并于激光共聚焦显微镜油镜(60X)下观察。随机挑选20个视野，计数每个视野中的气溶胶颗粒数，以及含有荧光标记的气溶胶颗粒数，根据气溶胶疫苗的有效抗原浓度＝含有荧光标记的气溶胶颗粒数/气溶胶颗粒数*100％，计算有效抗原浓度。结果：气溶胶疫苗的有效抗原浓度为52.32％±4.6％。[0040](3)活性检测

[0041]采用本实施例标题3中方法制备猪肺炎支原体168株的气溶胶疫苗，将该气溶胶疫苗通入雾化箱，将雾化箱底部的开孔与空气微生物采样器(美国SKC)连接。喷雾5分钟后关闭雾化器，30分钟后开启空气微生物采样器，收集雾化箱中疫苗气溶胶2分钟。整个过程控制雾化箱温度在20-30℃，湿度≥40％。

[0042]通过CCU50法测定采样器中疫苗菌株的活性滴度，并通过定量PCR法分别检测雾化前疫苗溶液以及雾化后采样器中疫苗菌株的拷贝数，根据两者拷贝数比例，较正并计算气溶胶疫苗较雾化前滴度下降0.48。具体方法如下：[0043]1)雾化前，通过CCU50法检测疫苗溶液中抗原滴度A1(Litamoi,J.,Palya,V.J.,Sylla,D.,Rweyemamu,M.M.,1996.Quality control testing of contagious bovine pleuropneumonia live attenuated vaccine.In:FAO Animal Production and Health Paper 128.Food and Agriculture Organization of the United Nations,Rome,pp.14–15.)。采用猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法(武昱孜等，猪肺炎支原体P97TaqMan-BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用.中国兽医科学，2012.12:1268-1272.)检测疫苗溶液中抗原的P97基因拷贝数B1。[0044]2)雾化后，采用BioSampler液体生物气溶胶取样器收集气溶胶活疫苗，得到采样液；

[0045]3)检测采样液中抗原的滴度A2和P97基因拷贝数B2，具体方法同步骤1)；通过如下公式计算采样液的理想滴度A3：A3＝B2/B1*A1；

[0046]4)气溶胶疫苗较雾化前滴度下降值＝A3-A2。经计算该气溶胶疫苗滴度A2为2.50 lgCCU50，较雾化前滴度下降值为0.48个滴度(即下降0.48 lgCCU50)。[0047]5.气溶胶疫苗的免疫及效果

[0048]将10头一周龄仔猪(免疫组)置于仔猪雾化箱中，取1瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种按照本实施例标题3中方法在仔猪雾化箱中制备气溶胶疫苗。这样，在雾化箱内实现了仔猪的雾化免疫，免疫剂量为107CCU/头份。待雾化完毕(雾化时间约30分钟)，让仔猪继续在雾化箱中停留30分钟。另设未免疫健康对照组(不免疫不攻毒)与攻毒对照组(不免疫但是攻毒)，每组10头仔猪。气雾免疫后6周，对免疫组与攻毒对照组的猪进行气管内猪肺炎支原体强毒(JS株)攻毒，并于攻毒后4周剖检，按评判方法(Xiong et al.,2014.Protective efficacy of a live attenuated Mycoplasma hyopneumoniae vaccine with an ISCOM-matrix adjuvant in pigs.The Veterinary Journal 199:268-274.)记录肺部病变评分，计算结果如下：免疫组猪只的免疫保护率为65％。

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从本实施例可以看到，稀释液A可以较好的保护168株的活性，气溶胶活疫苗在空

气中滞留30min后，活性降低较少，且免疫猪只后对猪只的免疫保护率达到60％，符合我国新兽药评审对猪支原体疫苗的要求，将使168株的气雾免疫成为现实，较原先的肺内免疫，提高疫苗接种的方便性，大大节省了劳动力和劳动时间。[0050]实施例2不同浓度气溶胶疫苗的粒径检测[0051]稀释液A是含有下列物质的水溶液：3g/L壳聚糖(分子量150KDa)、20g/L PEG6000、2g/L环糊精、10g/L硫代硫酸钠、10g/L L-组氨酸，pH值7.4。[0052]取10瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，用20ml稀释液A(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)溶解，取其中2ml疫苗溶液加入198ml稀释液A(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)稀释。将两种不同浓度的疫苗溶液分别倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，并按实施例1中粒径检测方法分别检测气溶胶疫苗颗粒的空气动力学粒径，作三次重复。同时，用对照疫苗A’(含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液(pH值7.5))，按照相同方法配制冻干前菌种与稀释液体积比为1：1和1：100两种浓度的猪支原体肺炎活疫苗溶液，将该疫苗溶液加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中，将喷雾器连接空气压缩泵，调节压力为0.2MPa后进行喷雾，通过压缩空气吹气法制备气溶胶疫苗。用上述方法测定平均空气动力学质量中位粒径。[0053]结果显示(表1)，采用稀释液A制备的气溶胶疫苗，当冻干前菌种与稀释液体积比为1：1时，平均空气动力学质量中位粒径为4.72微米，平均几何标准偏差为1.54；当冻干前菌种与稀释液体积比为1：100时，平均空气动力学质量中位粒径为4.28微米，平均几何标准偏差为1.44。而对照疫苗A’制备的气溶胶疫苗粒径与采用稀释液A制备的气溶胶疫苗粒径相比显著偏大，且均大于5.0微米。

[0054]表1不同浓度的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗空气动力学粒径检测结果

[0055]

表1中“*”，表示与对照疫苗A’制备的气溶胶疫苗相比差异显著(P<0.05)

[0057]实施例3不同浓度气溶胶疫苗中有效抗原的浓度[0058]稀释液A是含有下列成分的水溶液：CpG(序列为TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)100mg/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.4。[0059]稀释液B是含有下列物质的水溶液：ISCOM(免疫刺激复合物，公开于Xiong et al.,2014.Protective efficacy of a live attenuated Mycoplasma hyopneumoniae vaccine with an ISCOM-matrix adjuvant in pigs.The Veterinary Journal 199:268-274.)0.5g/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0060]对照稀释液1:含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液，pH值7.5。[0061]取10瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，按细胞增殖示踪荧光探针染料(CFDA-SE)说明书，将猪肺炎支原体168株染色并洗涤后，用20ml稀释液A溶解(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)，取其中2ml疫苗溶液用198ml稀释液A(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)稀

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同样方法，将经细胞增殖示踪荧光探针染料(CFDA-SE)标记的10瓶猪肺炎支原体

168株菌种，用20ml稀释液B溶解(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)，取其中2ml疫苗溶液用198ml稀释液B(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)稀释。[0063]另外，将经细胞增殖示踪荧光探针染料(CFDA-SE)标记的10瓶猪肺炎支原体168株菌种，用20ml对照稀释液1(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)溶解成猪支原体肺炎活疫苗溶液，取其中2ml疫苗溶液用对照稀释液1按冻干前菌种与稀释液体积比为1：100稀释。[0064]将采用稀释液A、B配制而成的各浓度的疫苗溶液，分别倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，并按实施例1中有效抗原浓度检测方法分别检测各气溶胶疫苗颗粒中的有效抗原浓度。另外，将采用对照稀释液1配制而成的各浓度的疫苗溶液加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中，将喷雾器连接空气压缩泵，调节压力为0.2MPa后进行喷雾，通过压缩空气吹气法制备气溶胶疫苗，并按实施例1中有效抗原浓度检测方法分别检测各气溶胶疫苗颗粒中的有效抗原浓度。[0065]结果显示(表2)，稀释液A按照冻干前菌种与稀释液体积比为1：1制成的气溶胶疫苗中，有效抗原浓度为88.2％±5.1％；稀释液A按照冻干前菌种与稀释液体积比为1：100制成的气溶胶疫苗中，有效抗原浓度55.6％±4.7％。稀释液B按照冻干前菌种与稀释液体积比为1：1制成的气溶胶疫苗中，有效抗原浓度为81.0％±3.5％；稀释液B按照冻干前菌种与稀释液体积比为1：100制成的气溶胶疫苗中，有效抗原浓度52.3％±4.6％。对照稀释液1按照冻干前菌种与稀释液体积比为1：100制成的气溶胶疫苗中，有效抗原浓度已低于50％(40.6％±0.8％)。

[0066]表2.不同浓度的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗有效抗原浓度检测结果

[0067][0062]

[0068]

实施例4不同浓度气溶胶疫苗的活性

[0070]对照稀释液1:含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液，pH值7.5。[0071]稀释液A是含有下列物质的水溶液：PolyI:C(购自Invivogen)500mg/L、PEG6000 50g/L、环糊精1g/L、硫代硫酸钠5g/L、L-组氨酸20g/L，pH值7.6。[0072]稀释液B是含有下列物质的水溶液：Gel01(法国SEPPIC公司)1g/L、PEG600010g/L、环糊精10g/L、硫代硫酸钠20g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0073]稀释液C是含有下列成分的水溶液：CpG(序列为TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)10mg/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.4。[0074]取10瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，用20ml稀释液A溶解(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)，取其中2ml疫苗溶液加入198ml稀释液A(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)稀释。

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按照本实施例中采用稀释液A制备疫苗溶液的方法，分别采用稀释液B、C制备的不

同浓度的疫苗溶液。[0076]另外，将10瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，用20ml对照稀释液1(冻干前菌种与稀释液体积比为1：1)溶解成猪支原体肺炎活疫苗溶液，取其中2ml疫苗溶液加入198ml对照稀释液1(冻干前菌种与稀释液体积比为1：100)稀释。[0077]将采用稀释液A、B、C配制而成的不同浓度的疫苗溶液分别倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，按实施例1中活性检测方法分别检测气溶胶疫苗在空气中漂浮30分钟后滴度的下降程度。将采用对照稀释液1配制而成的两种不同浓度的疫苗溶液分别加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中，将喷雾器连接空气压缩泵，调节压力为0.2MPa后进行喷雾，通过压缩空气吹气法制备气溶胶疫苗，并按实施例1中活性检测方法分别检测气溶胶疫苗在空气中漂浮30分钟后滴度的下降程度。[0078]结果显示(表3)，采用稀释液A制备的气溶胶疫苗浓度在冻干前菌种与稀释液体积比为1：1时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后，活性下降0.38个滴度；冻干前菌种与稀释液体积比为1：100时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后活性下降0.41个滴度。采用稀释液B制备的气溶胶疫苗浓度在冻干前菌种与稀释液体积比为1：1时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后，活性下降0.40个滴度；冻干前菌种与稀释液体积比为1：100时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后活性下降0.44个滴度。采用稀释液C制备的气溶胶疫苗浓度在冻干前菌种与稀释液体积比为1：1时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后，活性下降0.32个滴度；冻干前菌种与稀释液体积比为1：100时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后活性下降0.48个滴度。采用对照稀释液1制备的气溶胶疫苗，冻干前菌种与稀释液体积比为1：1时，气溶胶疫苗在空气中滞留30分钟后活性下降1.37个滴度；冻干前菌种与稀释液体积比为1：100时，气溶胶疫苗空气中滞留30分钟后活性下降1.82个滴度。稀释液C对168株活性的保护能力较好，气溶胶疫苗在空气中滞留30min后，168株活性只有稍微的降低。对比稀释液1对168株活性的保护能力较弱，气溶胶疫苗在空气中滞留30min后，168株活性显著降低。[0079]表3.不同浓度的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗活性检测结果

[0080]

实施例5不同种类稀释液对气溶胶疫苗免疫保护率的影响

[0082]稀释液A是含有下列物质的水溶液：200mg/L PolyI:C(购自Invivogen)、50g/L PEG6000、1g/L环糊精、5g/L硫代硫酸钠、20g/L L-组氨酸，pH值7.6。[0083]稀释液B是含有下列物质的水溶液：ISCOM 0.5g/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0084]稀释液C是含有下列成分的水溶液：CpG(序列为TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)10mg/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.4。

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[0081]

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稀释液D是含有下列物质的水溶液：壳聚糖(分子量150KDa)0.1g/L、PEG600050g/

L、环糊精1g/L、硫代硫酸钠5g/L、L-组氨酸20g/L，pH值7.2。[0086]稀释液E是含有下列物质的水溶液：Gel01(法国SEPPIC公司)10g/L、PEG6000 10g/L、环糊精10g/L、硫代硫酸钠20g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0087]对照稀释液1:含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液，pH值7.5。[0088]分别用稀释液A、稀释液B、稀释液C、稀释液D、稀释液E和对照稀释液1各溶解1瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，每种稀释液的用量均为20ml，得到疫苗溶液。[0089]将稀释液A、稀释液B、稀释液C、稀释液D、稀释液E配制而成的疫苗溶液分别倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，按实施例1中免疫方法分别免疫10头仔猪，免疫剂量为1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)，在免疫后第14、28、42天采集免疫猪鼻拭子，按专利号为ZL 201510239712.3(名称为抗猪SC蛋白单克隆抗体及其在制备猪肺炎支原体SIgA抗体ELISA检测试剂盒方面的应用)中公开的方法检测特异性sIgA抗体的转阳率，并按实施例1中方法检测气溶胶疫苗免疫仔猪对强毒攻击的保护率。将采用对照稀释液1配制而成的疫苗溶液加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中，将喷雾器连接空气压缩泵，调节压力为0.2MPa后进行喷雾，通过压缩空气吹气法制备气溶胶疫苗，免疫剂量和检测方法同稀释液A、B、C、D、E制备成的气溶胶疫苗。[0090]结果表明(表4)，采用稀释液A制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率可达80％，免疫后42天转阳率为100％，该气溶胶疫苗对免疫猪的保护率为65.3％。采用稀释液B制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率可达70％，免疫后42天转阳率为100％，该气溶胶疫苗对免疫猪的保护率为62.9％。采用稀释液C制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率可达70％，免疫后42天转阳率为100％，该气溶胶疫苗对免疫猪的保护率为70.6％。采用稀释液D制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率可达80％，免疫后42天转阳率为100％，该气溶胶疫苗对免疫猪的保护率为68.3％。采用稀释液E制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率可达70％，免疫后42天转阳率为100％，气溶胶疫苗对免疫猪的保护率为61.5％。而采用对照稀释液1制备的气溶胶疫苗，在1瓶冻干菌种接种10头猪(即1×107CCU/头份)的剂量下，免疫后28天，特异性sIgA抗体的转阳率仅为50％，免疫后42天转阳率为80％，对免疫猪的保护率为47.2％。因此，稀释液B、C、D、E制备的气溶胶疫苗的保护率较高。对照稀释液1对168株活力的保护能力较弱(实施例4)，从表4中也可以看出对照稀释液1制备的气溶胶疫苗保护率较低，显著低于猪支原体肺炎疫苗保护效率评审的最低要求60％。[0091]表4.不同稀释液配制的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗免疫保护率检测结果

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实施例6不同种类稀释液对气溶胶疫苗粒度分布与活性差异的比较

[0094]稀释液B是含有下列物质的水溶液：ISCOM 1.0g/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0095]稀释液E是含有下列物质的水溶液：Gel01(法国SEPPIC公司)10g/L、PEG6000 10g/L、环糊精10g/L、硫代硫酸钠20g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.2。[0096]稀释液F是含有下列物质的水溶液：50mg/L PolyI:C(购自Invivogen)、50g/L PEG6000、1g/L环糊精、5g/L硫代硫酸钠、20g/L L-组氨酸，pH值7.6。[0097]对照稀释液2是含有下列物质的水溶液：50mg/L PolyI:C(购自Invivogen)、10g/L明胶，pH值7.6。

[0098]对照稀释液3是含有下列物质的水溶液：50mg/L PolyI:C(购自Invivogen)、50g/L蔗糖，pH值7.6。

[0099]分别采用稀释液B、稀释液E、稀释液F、对照稀释液2和对照稀释液3各溶解1瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，每瓶冻干菌种中稀释液的加入量均为20ml，即冻干前菌种与稀释液的体积比为1：10。

[0100]将6种不同稀释释液配制的疫苗溶液分别倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，按实施例1中粒径检测方法分别检测气溶胶疫苗颗粒的平均空气动力学质量中位粒径，作三次重复。同时按实施例1中活性检测方法分别检测各稀释液配制成的气溶胶疫苗在空气中漂浮30分钟后滴度的下降程度。[0101]结果表明，稀释液B配制成的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为4.56微米，平均几何标准偏差为1.84(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降0.39个滴度(表6)；稀释液E配制成的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为4.88微米，平均几何标准偏差为1.68(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降0.48个滴度(表6)；稀释液F配制成的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为3.14微米，平均几何标准偏差为1.38(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降0.45个滴度(表6)；配制成的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为4.26微米，平均几何标准偏差1.35(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降0.43个滴度(表6)；用对照稀释液2配制的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为3.89微米，平均几何标准偏差1.54(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降2.06个滴度(表6)；用对照稀释液3配制的气溶胶疫苗，平均空气动力学质量中位粒径为4.68微米，平均几何标准偏差1.88(表5)，在空气中滞留30分钟后活性下降1.87个滴度(表6)。因此，稀释液B、E、F能较好的保护168株的活性，气溶胶疫苗在空气中滞留30min后，活性损失较小。对照稀释液2、3对168株的活性保护能力较弱，气溶胶疫苗在空气中滞留30min后，活性损失较大。

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表5.不同稀释液配制的气溶胶活疫苗的平均空气动力学质量中位粒径

气溶胶活疫苗所用稀释液气溶胶活疫苗平均质量中位粒径(MMAD±GSD)稀释液B4.56±1.84稀释液E4.88±1.68稀释液F3.14±1.38对照稀释液23.89±1.54对照稀释液34.68±1.88

[0104]表6.不同稀释液配制的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗活性检测结果

[0105]

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实施例7不同免疫剂量气溶胶疫苗免疫保护率差异的比较

[0108]稀释液A是含有下列物质的水溶液：0.1g/L壳聚糖(分子量150KDa)、20g/LPEG6000、2g/L环糊精、10g/L硫代硫酸钠、10g/L L-组氨酸，pH值7.4。[0109]对照稀释液1:含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液，pH值7.5。[0110]取20瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，其中10瓶用100ml稀释液A溶解，倒入超声雾化器雾化；另外10瓶用100ml对照稀释液1溶解，加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中进行雾化，两种雾化疫苗按实施例1标题5中方法进行免疫、攻毒并计算攻毒后的保护率，不同之处在于免疫剂量均为1×108CCU/头份。[0111]取2瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，其中1瓶用100ml稀释液A溶解，倒入超声雾化器雾化；另外1瓶用100ml对照稀释液1溶解，加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中进行雾化，两种雾化疫苗按实施例1标题5中方法进行免疫和攻毒并计算攻毒后的保护率，其中免疫剂量均为1×107CCU/头份。[0112]结果表明(表7)，采用稀释液A并用超声雾化方法制成的气溶胶疫苗，在免疫剂量为1×108CCU/头份时，其免疫保护率为75.6％；而当免疫剂量为1×107CCU/头份时，其免疫保护率为65.0％。采用对照稀释液1并用吹气法制成的气溶胶疫苗，在免疫剂量为1×108CCU/头份时，其免疫保护率为55.8％；而当免疫剂量为1×107CCU/头份时，其免疫保护率为47.2％。用吹气法制成的气溶胶疫苗无论是用哪种剂量免疫后，保护率均未达到60％。[0113]表7.不同免疫剂量的猪支原体肺炎气溶胶活疫苗免疫保护率检测结果

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[0114]

实施例8气溶胶疫苗免疫持续期的检测

[0116]稀释液A是含有下列物质的水溶液：0.1g/L壳聚糖(分子量150KDa)、20g/L PEG6000、2g/L环糊精、10g/L硫代硫酸钠、10g/L L-组氨酸，pH值7.4。[0117]稀释液C是含有下列成分的水溶液：CpG(序列为TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)10mg/L、PEG6000 20g/L、环糊精2g/L、硫代硫酸钠10g/L、L-组氨酸10g/L，pH值7.4。[0118]对照稀释液1:含5％甘油、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮的去离子水溶液，pH值7.5。[0119]取60瓶猪肺炎支原体168株冻干菌种，其中20瓶用200ml稀释液A溶解，倒入超声雾化器雾化，振荡频率为1.7MHz，按实施例1标题5中方法免疫20头仔猪，免疫剂量为1×108CCU/头份，检测免疫保护率。另外20瓶用200ml稀释液C溶解，倒入超声雾化器雾化，用同样的方法进行免疫，免疫剂量为1×108CCU/头份。最后20瓶用200ml对照稀释液1溶解，加入到医用下呼吸道沉积型喷雾器(德国百瑞)中进行雾化，免疫剂量为1×108CCU/头份。分别在免疫后4个月和8个月，按实施例1中标题5中攻毒方法进行猪肺炎支原体强毒攻毒，并检测对强毒攻击的保护率。[0120]结果表明(表8)，采用稀释液A制备的气溶胶疫苗，在免疫后4个月的保护率为70.8％；在免疫后8个月的保护率为64.3％。结果说明，稀释液A制成的气溶胶疫苗，免疫持续期在8个月以上。采用稀释液C制备的气溶胶疫苗，在免疫后4个月的保护率为64.3％；在免疫后8个月的保护率为62.4％。结果说明，稀释液C制成的气溶胶疫苗，免疫持续期在8个月以上。采用对照稀释液1制备的气溶胶疫苗，在免疫后4个月的保护率为32.6％；在免疫后8个月的保护率为11.5％，均未达到免疫保护标准。

[0121]表8.猪支原体肺炎气溶胶活疫苗免疫持续期检测结果

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