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中国临床神经外科杂志2020年2月第25卷第2期ChinJClinNeurosurg,February2020,Vol.25,No.2
●实验研究●蝎毒耐热蛋白对癫痫大鼠海马组织BDNF及
NPY表达的影响
陈其钻
杨朋范
钟忠辉
林
巧
梅
珍
裴家生
王守森
【摘要】目的探讨蝎毒耐热蛋白（SVHRP）对癫痫大鼠海马组织脑源性神经营养因子（BDNF）和神经肽Y（NPY）表达的影
响。方法健康成年雄性SD大鼠180只，按随机区组法随机分为3组（SVHRP组、模型组、正常组），每组60只动物。经颈部皮下注射FeCl2诱发癫痫急性发作，选取4~5级（Racine的癫痫分级标准）癫痫发作的大鼠。HE染色观察大鼠海马组织形态，免疫印破坏严重，而SVHRP组明显改善。模型组和SVHRP组大鼠海马神经BDNF及NPY表达水平均明显低于正常组（P<0.05），但SVHRP组BDNF及NPY表达水平明显高于模型组（P<0.05）。结论SVHRP能够减轻癫痫大鼠海马组织病理损伤程度，上调海马组织BDNF及NPY表达。
【关键词】癫痫；蝎毒耐热蛋白；FeCl2诱导癫痫模型；大鼠【文章编号】1009-153X（2020）02-0098-03
迹法及荧光免疫组织化学染色检测大鼠海马组织BDNF和NPY的表达。结果HE染色结果显示模型组大鼠海马组织形态结果
【文献标志码】A【中国图书资料分类号】R742.1;Q786
Effectsofscorpionvenomheat-resistantproteinonexpressionsofBDNFandNPYinhippocampaltissuesinratswithepilepsy
CHENQi-zuan,YANGPeng-fan,ZHONGZhong-hui,LINQiao,MEIZhen,PEIJia-shen,WANGShou-sen.DepartmentofNeurosurgery,No.900Hospital,LogisticSupport,Command,PLA,Fuzhou350025,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofscorpionvenomheat-resistantprotein(SVHRP)ontheexpressionsofBDNFandNPYinhippocampaltissuesinratswithepilepsy.MethodsOnehundredandeightyratswererandomlydividedinto3groupsof60animalseach,i.e.SVHRPtreatmentgroup,modelgroupandnormalgroup.TheepilepticmodelsweremadebysubcutaneousinjectionofFeCl2.Theexpressionsofbrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)andneuropeptideY(NPY)inthehippocampaltissueswasdetected
bywesternblotandfluorescenceimmunohistochemicaltechniqueinalltheanimals.ResultsThelevelsofexpressionsofBDNFandweresignificantlyhigherthanthoseinthemodelgroup(P<0.05).ConclusionsSVHRPcanincreasetheexpressionsofBDNFandNPYexpressionsinthehippocampaltissuesintheratswithepilepsy.
【Keywords】Scorpionvenomheat-resistantprotein;FeCl2;Epilepsy;Hippocampalneurons;BDNF;NPY;Rats
NPYinhippocampaltissuesweresignificantlyhigherinthenormalgroupthanthoseintheSVHRPtreatmentgroup(P<0.05),which
全蝎用于治疗癫痫、惊厥在中国已有几千年的历史。研究表明蝎尾中的蝎毒具有明显的抗癫痫、
2]
抗肿瘤、镇痛、促纤溶等作用[1，，其主要成分是蝎毒耐热蛋白（scorpionvenomheatresistantprotein，SVHRP）。癫痫急性发作期，常伴有海马组织脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）、神经肽Y（neuropeptideY，NPY）的表达上调，而通过抑制BDNF的酪氨酸激酶受体信号转导并增强NPY表达可能是癫痫潜在治疗方法，尤其是颞叶癫痫[3]。本研究探讨SVHRP对癫痫大鼠海马组
doi:10.13798/j.issn.1009-153X.2020.02.012基金项目：全军后勤科研计划面上项目（CNJ14J008）作者单位：350025福州，中国人勤保障第900医院神经外科（陈其钻、杨朋范、钟忠辉、林巧、梅、珍、裴家生、王守森）通讯作者：杨朋范，E-mail：neurosurg.yang@163.com织BDNF及NPY表达的影响。1材料和方法
1.1实验动物及其分组健康成年雄性SD大鼠180只，按随机区组法随机分为3组（SVHRP组、模型组、正常组），每组60只动物。①SVHRP组：制作癫痫模型后，每天同一时间腹腔注射一次SVHRP，连续10d。②模型组：癫痫模型制作后，每天同一时间腹腔注射与治疗组等体积的生理盐水，连续10d。③正常组：不制作癫痫模型，连续10d，每天同一时间腹腔注射与治疗组等体积的生理盐水。
1.2癫痫模型的制作暴露颈部皮肤，经颈部皮下注射FeCl2诱发癫痫急性发作，选取4~5级（Racine的癫痫分级标准）癫痫发作的大鼠。
1.3HE染色观察海马组织形态学乙醚麻醉后，冰中国临床神经外科杂志2020年2月第25卷第2期ChinJClinNeurosurg,February2020,Vol.25,No.2
-99-上断头处死大鼠，分离双侧海马组织，吸水纸吸去表面血渍，4%多聚甲醛浸泡、固定24h，经脱水、透明、浸蜡、包埋等操作后，制备5.0μm厚度的海马组织石蜡切片，1.4达在裂解缓冲液添加苯甲基磺酰氟用于提取大鼠免疫印迹法检测海马组织行常规HE染色。
BDNF、NPY蛋白的表海马组织总蛋白，10%偏氟乙烯膜上；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并测定蛋白浓度。取等量蛋白行冲洗3次后，置于含5%然后转移至聚
脱脂牛奶的含吐温-20磷酸盐缓冲液室温封闭2h；按1：1000比列加入兔抗小鼠BDNF抗体、兔抗小鼠NPY抗体、兔抗小鼠β-肌动蛋白抗体4℃孵育过夜；磷酸盐缓冲液洗膜3次，加入1：5000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2h；含吐温-20磷酸盐缓冲液洗膜，化学发光法成像分析免疫条带，凝胶电泳图分析软件分析目的条带与内参条带的灰度值，两者之比则可表示目的蛋白相对表达量。
1.5NPY荧光免疫组织化学染色检测海马组织等过程，的表达制备多聚甲醛固定5.0μm厚度的海马组织石蜡切片，24h，经脱水、透明、BDNF包埋及兔抗小鼠actionBDNF抗体、兔抗小鼠NPY羊抗兔二抗来为抗体进行免疫荧光一抗孵育，抗体、β-action抗原显色，使用兔抗小鼠异硫氰酸荧光Cy3标记的β-素标记的羊抗兔二抗来为BDNF、NPY显色，荧光显
微镜下观察切片组织形态，采用ImageJ软件进行定量分析。
1.6资料采用统计学分析x±s表示，
应用采用单因素方差分析、SPSS20.0软件进行分析；LSD-计量t检验、Dunnett-t检验；计数资料采用Fisher精确概率法检验；检验水准α=0.05。2结果
2.1经元排列整齐，海马组织病理形态学改变胞浆淡染，轮廓完整，正常组大鼠海马神无周围组织细胞水肿（图1A）；模型组大鼠海马神经元排列紊乱，间隙增宽、数量减少，胞体变形、缩小，胞浆浓缩深染，出现核固缩、碎裂、溶解（图1B）；SVHRP组大鼠海马组织神经元细胞损害情况有明显好转，虽细胞排列依旧紊乱，间隙相对较大，细胞数量减少、细胞深染等，但变形、深染细胞数量及细胞碎片明显减少，2.2可观察到正常细胞形态结构（疫印迹法检测可见模型组和SVHRP对海马组织BDNF图1C）。
SVHRP、NPY表达的影响组大鼠海马组免织BDNF及NPY表达水平均明显低于正常组（P<
0.05显高于模型组，图2），而（SVHRPP<0.05，
组图BDNF2）。免疫荧光定量分析结及NPY表达水平明果显示，模型组和SVHRP组荧光强度较对照组明显
减弱（P<0.05，
图3、表1），而SVHRP组大鼠海马组织荧光强度较模型组明显增高（P<0.05，图3、表1）。3讨论
癫痫的病因及症状复杂多变，治疗仍以控制癫
痫急性发作为主。由于癫痫长期反复发作，为控制癫痫反复发作，需长期服用大量的抗癫痫药物，不仅给病人家庭带来极大的经济负担，而且对自身身心及意志都是极大的摧残。有研究证实，蝎尾中提取的SHRPV不仅能够降低癫痫反复发作敏感性，而且对癫痫反复发作也有明显治疗功效。但是，由于
图1SVHRP对癫痫大鼠海马组织病理形态的影响（HE，×40）
A.正常组；B.模型组；C.SVHRP组；SVHRP.蝎毒耐热蛋白
图2SVHRP对癫痫大鼠海马组织BDNF和NPY蛋白表达的影响
与模型组相应值比，*P<0.05；与组相应值比，#P<0.05；SVHRP.蝎毒耐热蛋白；BDNF.脑源性神经营养因子NPY.神经肽Y
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图3SVHRP对癫痫大鼠海马组织BDNF和NPY蛋白表达的免疫荧光染色（×400）
SVHRP.蝎毒耐热蛋白
表1SVHRP对癫痫大鼠海马组织BDNF和NPY蛋白表达的免疫荧光染色定量结果组别模型组正常组48.73±9.94BDNF#
55.35±7.38NPY#
SVHRP组101.24±19.87138.56±28.74
*#
119.43±28.921.39±31.47
*#
注：与模型组相应值比，#P<0.05；与正常组相应值比，*P<0.05；SVHRP.蝎毒耐热蛋白；BDNF.脑源性神经营养因子NPY.神经肽Y
SVHRP离、纯化困难，富含神经毒素，成分较为复杂，药用成分分
能对抗BDNFBDNF增加可以相应地诱导了其在抗癫痫中的应用。
在癫痫发生、发展中的负面作用NPY高表达，[7]后者。在匹罗卡品所致海马脑片的癫痫模型中，癫痫放电后即出现BDNF的增高，且随之出现NPY的增加，二者保持了时间上的一致性[8]。NPY基因过度表达能在遗传性全面性失神发作的癫痫大鼠模型中产生持续的抗癫痫作用，NPY基因治疗可能是治疗遗传性全面性癫痫的一种新方法[9]NPY。在大鼠颈部皮下注射间、发放幅度均有不同程度缓解，发现癫痫大鼠癫痫发作症状的频率、[10]，进一步证实持续时NPY具有显著的抗癫痫作用。
FeCl总之，本文结果表明白表达。然而，诱导的癫痫大鼠癫痫海马组织SVHRP干预可明显上调2BDNF、NPYNPY，改善癫痫症状，是否可以通过外源性给予有待后续进一步研究。
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