辣椒叶脉黄化病毒中国分离物全基因组克隆及基于外壳蛋白移动蛋白RNA依赖RNA聚合酶编码区域的进化分析

刘茂炎1,2 刘湘宁 李讯 张德咏 戴良英* 唐前君*

收稿日期：2015年7月15日/接受：2015年11月15日/在线发表时间：2015年11月30日

摘 要

本实验的辣椒叶脉黄化病毒（pepper vein yellowsvirus，PeVYV）基因组序列（PeVYV-HN，登录号KP326573）是从湖南省蔬菜研究所（湖南长沙，中国）种植的辣椒植物（Capsicum annuum L.）上分离并通过深度测序sRNA获取的。该PeVYV-HN基因组由6244个核苷酸，包含六个开放阅读框（ORF），和日本的分离物（AB594828）类似，同样其基因组结构与马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）的其它成员类似。序列分析表明，PeVYV-HN与日本PeVYV基因组在核苷酸和氨基酸水平上都共享92％的序列同一性。基于其外壳蛋白（Coat Protein, CP）的，运动蛋白（Movement Protein, MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以分成对应于其地理来源的两个主要谱系。相对于非洲分离物，亚洲分离物相具有较高的种群扩张频率。负选择作用和遗传漂变（奠基者效应）被认为是潜在的PeVYV的分子进化驱动力。此外，重组不是PeVYV进化的明显因素。这是在中国PeVYV的完整基因组序列的第一份报告。

关键词：辣椒脉黄化病毒; 深度测序；全基因组；分子进化

马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），属于黄症病毒科（Luteoviridae）其代表品种马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV），当然也包括PeVYV[1–3]。其基因组为单分子线形正义ssRNA，包含大约6000个核苷酸（nt），在5'端具有一个特异性蛋白（VPg）结构。基因组包含六个开放阅读框，ORF 0与ORF 1重叠，ORF 2与ORF 1重叠;ORF 4完全处在ORF 3之中。ORF 5编码76-kDa的通读蛋白，对蚜虫传播至关重要，也有可能是病毒颗粒的稳定因子。PLRV主要感染茄科的植物，是通过蚜虫传播。PeVYV是导致叶脉黄化病 ( yellow vein disease, YVD )的一个重要的病原体，其在西非是一种主要的辣椒病害[4]。1995年PeVYV首次在日本得到确定[5]. PeVYV通过蚜虫（Aphis gossypii）、嫁接等固定的方式传播[5]，对辣椒是一个世界性的难题，并经常在与其它病毒混合侵染中发现。PeVYV可以基于CP序列从其他的病毒容易地区别 [6-8]。辣椒被PeVYV侵染的主要表现症状有叶脉黄化，叶卷曲，叶片变形，叶褶皱和节间缩短等。PeVYV已经在印度，印尼，马里，菲律宾，西班牙，，泰国，以及苏丹[2, 3]等国家和地区的辣椒作物上分离得到。最近，有个新的寄主，龙葵(Solanum nigrum)和在印度[3]得到了鉴定。这些表明，PeVYV具有广泛的地域

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分布，对辣椒以及其它植物构成全球性的威胁[3, 9]。

日本分离的PeVYV核苷酸序列是储存在基因库（GenBank）仅有的全长序列（登录号AB594828），还有一些也可提供包括在CP，MP和RdRp 基因等部分序列，分别来自在亚洲的，泰国，印度，印尼和菲律宾；在非洲的苏丹，马里和突尼斯; 以及在欧洲的土耳其和西班牙（表S2）。 然而，这些不同的PeVYV分离物的进化史是鲜为人知的 [10]。

在2013年，有可能被病毒感染的展示植物矮化，叶片萎缩/畸形，脉间黄化，叶脉变黄，叶片卷曲，叶片褶皱和黄色斑块等症状的辣椒叶片从中国湖南沙市收集。病毒RNA是使用氯化锂法从这些辣椒叶提的[11]，全基因组序列是在Illumina NextSeq 500平台通过小分子RNA（sRNAS）深度测序法得到的。总共得到12910408个读取点。低质量的读取数据（Q<20），读取点包含N，并且读取数小于18核苷酸（nt）的，从数据集中移除。整理好的读取数据集，采用BOWTIE进行BLAST搜索处理， 以具有至少15个核苷酸和18-50 nt长度的5'和3'连接匹配作为标准。在miRBase数据库v.21.0中的初级转录物（pre-miRNA）和成熟miRNA进行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）检索来识别的miRNA。使用RFAM（10.1）数据库

(http://rfam.sanger.ac.uk/)除去非miRNA，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA。最后，在平均覆盖率达到超过

100倍的情况下，PeVYV基因组用 Velvet组装成了两个线性重叠群[12]。长重叠群（3990个核苷酸长度）具有95％的核苷酸序列同源性与PeVYV-日本的31-4020 nt，而短重叠群（1746 nt）与PeVYV-Japan的核苷酸4261-6006 nt具有85％的同源性 [13，14]。根据这两个重叠群设计八个特异性引物（表S1），然后进行RT-PCR扩增相应的DNA产物。两个重叠群之间的序列也是利用特异性引物（表S1）进行RT-PCR扩增得到的。所有RT-PCR的产物通过1％琼脂糖凝胶进行分离，然后使用DNA提取试剂盒（TiangenBiotech, Beijing, China）提取。纯化的片段克隆到pEASY-T1（TransGen Biotech, Beijing,China），将得到的构体转载到TRANS1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞（TransGen Biotech, Beijing,China），具体操作根据制造商的说明。这八个特异性引物用来通过PCR确定所得到的克隆。 然后五个克隆用来送到BioSune Biotech公司（Changsha,Hunan, China）测序。3'-和5'-末端序列采用3'和5' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）（Invitrogen）得到。在两个连续的片段之间重叠区域的核苷酸序列片段的长度至少为100个基点。这样一个分离物（命名为PeVYV-HN，accession

no.KP326573）通过使用DNASTAR软件（DNASTAR Inc.,Madison, WI, USA）和BioEdit 版本 5.0.9

[15]

组装上述序列

确定。全序列的同源性分析使用ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/ index.html）[16]和BLAST进行。

PeVYV分离物，包括PeVYV-HN的外壳蛋白（CP），移动蛋白（MP）和RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的编码区域序列被用来进行进化分析（表S2）。首先使用 CLUSTAL X 2[17 ]对这些序列和亲缘最近的PLRV分离物的相应区（也担任系统发育分析的外群）进行序列匹配。为了确保所得的氨基酸对应的核苷酸序列正确编译，采用 TRANSALIGN 校准序列。删除缺口（gaps）后，最终得到的CP，MP和的RdRP序列的

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长度分别是339，201和483 nt。从西班牙和土耳其的一些分离物序列经过以上两个步骤后太短，因此，从最后的数据集中移除。所有序列的推测的重组位点使用RDP4软件包[18]和经典的SimPlot程序[19]进行筛选。推定的重组事件（P value<1 *10-6）无统计学支持，因此在随后的分析[20]中删除（视为丢失的数据）。 对齐的序列的系统发育树的构建使用最大似然（ML）方法通过PhyML-3.1[21]来实现。每个数据想核苷酸最适替代模型使用jModeltest0.1.1[22] 确定。结果表明，TrNef+G提供CP序列的最佳拟合，TIM3ef于MP序列，TIM2ef+I+G为RdRP序列最佳拟合。使用基于1000倍重复自举法计算支架支持。此外，采用MEGA5.1[23] 软件1000倍自举法构建了一个邻接（NJ）树。

核苷酸和氨基酸序列的相似性分别使用Kimura two-parameter method [24]和DayhoffPAM 250 matrix [25]来评估，而种群内多样性采用MEGA5.1来衡量[25]。与系统发育关系相关联的非同义（DN）和同义（DS）替换数值的差异各自使用Pamilo-Bianchi-Li (PBL)方法[26]在MEGA5.1中实施计算。进行了Tajima’s D, Fu和Li’sD*,

and F*统计学检测，同时每个PeVYV蛋白编码序列的单倍体多样性，使用DnaSP5.1027估计。PeVYV种群的

[]

基因漂流和遗传分化还采用DnaSP5.10计算。

PeVYV-HN的组装全长序列是6244个核苷酸长度。PeVYV-HN与其他完整的基因组序列的核苷酸序列比较表明PeVYV-HN的1-6244 nt具有最高的身份（92％），与来自日本的分离物序列，同时核苷酸PeVYV-HN的1-5059 nt与辣椒黄化曲叶病毒序列（pepper yellow leaf curl virus，PYLCV，HM439608来自以色列）[28]具有最高的同源性（93％），和序列辣椒黄化病毒（pepper yellows virus，PYV，FN600344）在核苷酸位置2613-4243 nt具有最高94％的同源性。 另外，PeVYV-HN与日本的分离物共享最高氨基酸序列同源性在ORF0，ORF1，ORF1-ORF2，ORF3，ORF4及ORF3-ORF5（分别是86，92，93，99％，99％，和88％）。 对29个CP，29个MP和20个RdRP序列进行分析，采用SimPlot 和 RDP4软件鉴定重组事件。在PeVYV分离物的三个编码区没有发现重组位点。三个编码区比较短，因此，分析有可能有低估了重组事件。使用这些CP，MP和的RdRP序列来计算构建进化树。在这些树中所有的序列被一致地分配成相同的两个谱系（I和II）（图1，2，3）。大多数来自亚洲的分离物聚类在谱系 I，而那些来自非洲的则聚在谱系 II。HN分离物显然属于谱系 （I亚洲种群），并且在CP进化树上（图1）该分离物聚集在分离物 JP（来自日本）旁边。

在CP，MP和的RdRP基因区域分离株间的核苷酸序列差异分别为0.03979±0.00651，0.02418±0.00721和0.05734±0.00630，（表S3）。在非洲和亚洲PeVYV分离物之间的量级和阈值的差异也被计算了，在非洲的分离物比亚洲的似乎更可变。然而，这一结论需要通过收集更多的亚洲和非洲的各个地点的分离株进行确认。

隔离位点的分子多样性模式使用Tajima’s D, Fu and Li’s D*, 以及F*statistical tests 进行了评估(Table 1)。结果表明：在亚洲分离株的RdRP编码区，CP编码区域的Tajima’s D，Fu and Li’s D* 及 F*statistical tests 检验值都为负值，这表明最近PeVYV种群在扩张。相反，在所有MP编码区和非洲的CP编码区分离物，

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Tajima’s D，Fu and Li’s D* 和F*statistical tests 测试呈正值，说明种群纯化（负选择）作用于PeVYV种群。

亚洲和非洲PeVYV分离物之间的单倍体和核苷酸序列多样性进行了比较（表2）。来自CP和MP编码区的结果表明，该非洲分离物的单倍体多样性均小于亚洲的; 然而，针对于RdRP编码区的结果指出，非洲和亚洲的单倍体多样性是大致相等的。非洲分离物的MP核苷酸序列多样性值介于0.01358±0.00531至0.05734±0.00630之间，说明是最保守的区域，而亚洲分离物的RdRP编码区域是最可变区。总体而言，在独特的地理分组里面进行三个蛋白质编码区的中性平衡模型偏差分析，连同其高单倍体多样性及低核苷酸多样性，暗示着最近PeVYV种群在扩张。

在亚洲和非洲的PeVYV分离物之间的基因交流和遗传分化使用了Ks*，Z和SNN statistics（表3）进行确定。对CP，MP和的RdRP编码区进行比较发现有明显的遗传分化在这两个种群之间。所有的Fst值均大于0.33，表明基因漂流的频率在这两个种群之间是非常低的[29，30]。 所有的 Nm均小于1，这表明PeVYV种群是受遗传漂变[29，30]的影响。

我们分别计算了DN值和DS值（表2）来估量CP，MP和的RdRP编码区的选择压程度。 Ds值总是大于DN值，并且随着不同的基因组区域变化，指明了负选择针对于大多数氨基酸位置的变化。

PeVYV有402 nt 位于3'-NCR 以及基因间的 NCR 199 nt位于ORF2和ORF3之间。基因间区域已被称为是在黄症病毒科[31，32]家族成员的重组事件的热点。因此，重组事件很可能是发生在PeVYV的基因间区域。事实上，在该区域重组位点的识别已经通过分析序列与其他 poleroviruses 序列的比较研究[33，34]。因此，除了给CP，MP和的RdRP区域，其他标记的区域，比如该基因间区域，有可能与PeVYV分子变异有关。

遗传分化和系统发育分析显示，在这些PeVYV分离物中有两个分别发源于非洲和亚洲的明显不同的种群。 这个种群结构可能归因于PePYV的传播特征，因此可能反映非洲和亚洲PeVYV分离物之间的物理和检疫壁垒。

计算的DN/ DS比率，提供了一个强大的证据线索表明对氨基酸变化的负选择可作为 PeVYV 进化的驱动力。比较DN位置对比DS位置的核苷酸多样性的比率，揭示了在蛋白质编码区选择压。一个被人们普遍接受的观点是，大多数动物和植物病毒是处于强的负选择[35]。在PeVYV里面，所有的分离物的DN/ DS的比率比1小，这表明它们正处在负选择或种群纯化。DN/ DS的比率在亚洲和非洲的分离物的CP，MP和RdRP编码区域是普遍变化的，这表明这些蛋白质编码区是处在不同的进化约束下。这些在CP，MP和的RdRP编码区的变化的 DN/ DS 比率可能由于高度变化的地理环境引起的。然而，重新估计这些比率是有必要的，通过从世界各地的收集更多的分离物以及更长的基因组序列成为可用的用来进一步界定负责这些变化的精确的遗传机制。

总之，基于其外壳蛋白（CP）的，运动蛋白（MP），和RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）的进化分析表明，PeVYV可以明显地分成对应于其地理来源的两个主要谱系，揭示了他们可能已经分别进化。两个

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种群之间的遗传分化系数暗示了这两个群体可能属于两个不同的病毒小种。我们的分析表明，非洲分离物的种群膨胀频率比亚洲的低。这种较低的频率可能是归结于种群流动性差。 此外，这项研究还表明，重组不是PeVYV进化的显著原因，而负选择和遗传漂变（奠基者效应）似乎是潜在的驱动PeVYV分子进化的动力。

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Table 1 Neutrality tests of pepper vein yellows virus

辣椒叶脉黄化病毒的中性检测

Protein coding region Coat protein 外壳蛋白

Lineage Number of sequences Africa Asia All

Movement protein 移动蛋白

Africa Asia All

RNA-depend RNA Polymerase RNA依赖RNA 聚合酶

a

Tajima’s D 1.17780 -1.22451 0.03908 0.76807 0.73249 3.34815a -0.16142 -0.094 -0.50274

Fu & Li’s D* 0.587 -1.62346 -0.52566 0.76976 0.44294 1.74023b -0.16142 -0.221 -0.48424

Fu & Li’s F* 0.85874 -1.74170 -0.40255 0.87873 0.59948 2.669b -0.17333 -0.74004 -0.57168

14 15 29 14 15 29 5 15 20

Africa Asia All

P<0.001; bP<0.02. Tajima’s D test compares the nucleotide diversity with the proportion of polymorphic sites, which are expected to be equal under selective

neutrality. Fu & Li’s D* test is based on the differences between the number of singletons (mutations appearing only once among the sequences) and the total number of mutations. Fu & Li’s F* test is based on the differences between the number of singletons and the average number of nucleotide differences between the sequence pairs. The lengths of the nucleotide sequences for the CP, MP and RdRP regions are 339, 201 and 483 nt, respectively.

a

P <0.001; b P<0.02。Tajima’s D test 用多态位点的比例比较核苷酸多样性，目的是在中性选择下匹配。Fu & Li’s D* test是基于单体（在序列中出现突变只有一次）数目和突变的总数之间的差异。Fu & Li’s F* test是基于单体的数目和在序列对之间的核苷酸差异的平均数量之间的差异。CP，MP和RdRP区域的序列长度分别是339，201和483个核苷酸。

Table 2 Haplotype and nucleotide diversities of pepper vein yellows virus

辣椒叶脉黄化病毒的单倍体和核苷酸多样性

Protein coding region

Lineage Number

of

sequences

Haplotype diversity

Nucleotide diversitya d

dN

dS

dN/dS

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Coat protein

Africa Asia All

14 15 29 14 15 29 5 15 20

0.879(0.079) 0.981(0.031) 0.968(0.022) 0.670(0.126) 0.962(0.034) 0.916(0.040) 1.000(0.126) 0.990(0.028) 0.995(0.018)

0.03485(0.00731) 0.00484(0.00466

) 0.02330(0.00440) 0.00529(0.00271

) 0.03979(0.00651) 0.00967(0.00541

)

0.01358(0.00531) 0.02141(0.00865

) 0.02418(0.00721) 0.01925(0.00785

) 0.02104(0.00819) 0.02025(0.06914

)

0.02285(0.00491) 0.009(0.00247

) 0.05557(0.00654) 0.00342(0.00391

) 0.05734(0.00630) 0.01104(0.00434

)

0.10578(0.02560) 0.030814 0.06142(0.01304) 0.124261 0.10926(0.02175) 0.080281 0.02397(0.04425) 0.3200 0.03502(0.01511) 0.495004 0.01742(0.06771) 0.968174 0.07036(0.01546) 0.038556 0.17003(0.02147) 0.083606 0.17259(0.02147) 0.087367

Movement protein

Africa Asia All

RNA depend RNA

polymerase

Africa Asia All

a

d, nucleotide diversity estimated by the Kimura’s two-parameter method; dN and dS, nucleotide diversity at non-synonymous and synonymous positions,

respectively, estimated by the Pamilo-Bianchi-Li method. Standard deviations are shown in parentheses. Haplotype diversities were analyzed using DnaSP, and nucleotide diversities were analyzed using MEGA 5.0. Lineages or countries with more than five sequences were analyzed.

a

d, 核苷酸多样性是用Kimura’s two-parameter 方法建立的；dN and dS，分别是同义位点和非同义位点的核苷酸多样性，采用Pamilo-Bianchi-Li 构建。在括弧中显示的是标准差。单倍体多样性是使用DnaSP 分析，而核苷酸多样性是用MEGA 5.0. 分析。系谱或国家超过5个序列用来分析。

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Table 3 The gene flow and genetic differentiation of pepper vein yellows virus

辣椒叶脉黄化病毒的基因流动和遗传分化

Protein coding region

Lineage and Number of sequences

Coat protein

Africa(n=14) vs. Asia(n=15)

Parameter Ks* (P-valve) 2.02150 (0.0000***)

ba

Z (P-valve)

145.99071(0.0000***)

Snn (P-valve) 1.00000 (0.0000***)

Fst 0.41618

Nm 0.35

Movement protein RNA depend RNA polymerase

Africa(n=14) vs. Asia(n=15) 1.32774 (0.0000***) 96.83194 (0.0000***) 1.00000 (0.0000***) 0.97314 0.01

Africa(n=5) vs. Asia(n=15) 3.05298 (0.0000***) 70.79092 (0.0000***) 1.00000 (0.0000***) 0.38210 0.40

a, Ks* and Z are the sequence-based statistics considered by Hudson (2000). Snn is the nearest-neighbor statistic. Fst is the interpopulation component of genetic variation, indicating the standardized variance in allele frequencies across populations. An absolute value of Fst <0.33 suggests frequent gene flow. N, the population size of each subpopulation. M, the migration fraction per generation. b, P < 0.05 was considered the criterion of rejecting the null hypothesis that there was no genetic differentiation between the two subpopulations. *, 0.01a, Ks* and Z 是用Hudson (2000) 考虑基于数据的统计。Snn 是最临近值。Fst 是遗传变异的种群内组分，指明种群间的

等位基因频率上的标准差。一个Fst <0.33的绝对值暗示了基因漂流的频率。N，各个亚种群的种群规模。M，每一代的迁移分数。b, P < 0.05 被认为是拒绝虚无假设的标准，没有基因差异在两个亚种群之间。*, 0.01第 10 页 共 13 页

A 66 pTH13 JX427540637672 pIN1 JX427534 pTH1 JX427539 nIN1 JX427531 pTH4 JX427541 pMA3 JX42753684 pMA2 JX427535LineageⅠ

pID10 JX427532 pID12 JX427533578370 pTW1 JX427542 pPH2 JX427537.1 HN KP3265736559 JP AB594828 pTW3 JX427543 pPH3 JX427538 Ma2 KC685314 S2 KC685320 S7 KC6853229483 Ma6 KC68531869 Ma5 KC685317 Ma4 KC685316 Ma3 KC685315LineageⅡ

S10 KC685325 Ma7 KC685319 Ma1 KC68531391 VIF8 KC68532698

S6 KC68532188 S9 KC68532477 S8 KC685323 PLRV KC4560540.05

Fig. 1 Neighbor-joining tree calculated based on the coat protein(CP) of pepper vein yellows virus. Numbers at each node indicate thepercentage of bootstrap support. The sequence from an isolate ofpotato leafroll virus (PLRV) was used as an outgroup. Horizontalbranch lengths are drawn to scale, with the bar indicating 0.05 ntreplacements per site. The HN isolates is indicated by a red square。

图1.基于辣椒叶脉黄化病毒外壳蛋白（CP）采用邻接法构建树。在每个节点处的数字表示

自举值的百分率。马铃薯卷叶病毒（PLRV）用作外群。水平分支的长度参照0.05的标尺按比例绘制。HN分离物是由一个红色方块表示。

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B pPH3 JX427538 pIN1 JX42753474 pID12 JX427533 pID10 JX427532 pTH1 JX427539 pTH4 JX427541 nIN1 JX427531 pTH13 JX42754098 pMA2 JX427535 pMA3 JX427536 JP AB594828 HN KP326573 pTW1 JX427542 pPH2 JX427537 pTW3 JX427543 PLRV KC456054LineageⅠ

71 VIF8 KC685326 S6 KC685321 S8 KC685323 S9 KC685324100 Ma1 KC685313 Ma7 KC685319 S10 KC68532585 S7 KC685322 S2 KC685320 Ma6 KC68531861 Ma5 KC685317 Ma4 KC685316 Ma3 KC685315 Ma2 KC6853140.2LineageⅡ

Fig. 2 Maximum-likelihood (ML) tree calculated based on themovement protein (MP) coding region sequences of pepper veinyellows virus. Numbers at each node indicate the percentage ofbootstrap support. The sequence from an isolate of potato leafrollvirus (PLRV) was used as an outgroup. Horizontal branch lengths aredrawn to scale, with the bar indicating 0.2 nt replacements per site.The HN isolates is indicated by a red square

图2.基于辣椒叶脉黄化病毒移动蛋白（MP）采用最大似然法构建树。在每个节点处的数字表示

自举值的百分率。马铃薯卷叶病毒（PLRV）用作外群。水平分支的长度参照0.2的标尺按比例绘制。HN分离物是由一个红色方块表示。

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C 92 Tunisia151 HE9782 Tunisia45 HE9782629992 Ma4 KC692833 Ma2 KC692834LineageⅡ Tunisia7 HE978261 pID12 JX427533987269 pTH13 JX427540 pTH4 JX427541 pTH1 JX427539 pPH3 JX427538 pIN1 JX427534 nIN1 JX427531 pPH2 JX427537 pMA3 JX4275367499 pMA2 JX427535LineageⅠ

JP AB5948286394 pTW3 JX427543 pTW1 JX427542 pID10 JX427532 HN KP326573 PLRV KC4560540.05

Fig. 3 Neighbor-joining tree calculated based on the RNA-dependentRNA polymerase (RdRP) coding region sequences of pepper veinyellows virus. Numbers at each node indicate the percentage ofbootstrap support. The sequence from an isolate of potato leafrollvirus (PLRV) was used as an outgroup. Horizontal branch lengths aredrawn to scale, with the bar indicating 0.2 nt replacements per site.The HN isolates is indicated by a red square

图3.基于辣椒叶脉黄化病毒移动蛋白（RDRP）采用邻接法构建树。在每个节点处的数字表示

自举值的百分率。马铃薯卷叶病毒（PLRV）用作外群。水平分支的长度参照0.05的标尺按比例绘制。HN分离物是由一个红色方块表示。

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