一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其用途[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1063994 A (43)申请公布日 2017.02.15

(21)申请号 201610150591.X(22)申请日 2016.03.16(66)本国优先权数据

201510467747.2 2015.07.31 CN

(71)申请人复旦大学

地址200433 上海市杨浦区邯郸路220号(72)发明人刘锋 杨芃原 王晓庆 崔书建

姜英华(74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事

务所(普通合伙) 31268

代理人吴桂琴(51)Int.Cl.

G01N 33/574(2006.01)

C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/68(2006.01)

(54)发明名称

一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其用途(57)摘要

本发明属于基因工程和医学检测领域，涉及一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其用于制备人结直肠癌检测制剂或检测试剂盒中的用途。本发明实验分析COL3A1基因在结肠癌和癌旁组织中的表达，结果表明，COL3A1基因在癌组织中比癌旁组织呈现显著高表达趋势，证明COL3A1在结肠癌发生发展过程中起作用，其在结肠癌和癌旁中的上皮细胞中显著差异表达，但在癌和癌旁的基质部分表达无差异，说明COL3A1蛋白是癌上皮细胞特异的分子标志物；同时，COL3A1基因表达上调与肿瘤进展呈正相关，与结肠癌患者手术后的生存时间相关。本发明为有效判断人结肠癌癌变进程提供了科学依据。

权利要求书1页 说明书28页 附图4页

C N 1 0 6 3 9 9 4 6 4 ACN 1063994 A

权　利　要　求　书

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1.一种人结肠癌蛋白质标志物COL3A1在用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的制剂中的用途。

2.一种人结肠癌蛋白质标志物COL3A1在用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的试剂盒中的用途。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述人结肠癌蛋白质标志物COL3A1在用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌癌细胞扩散、结肠癌淋巴结转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂中的用途。

4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人结肠癌蛋白质标志物COL3A1用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌癌细胞扩散、结肠癌淋巳结转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的试剂盒中的用途。

5.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，COL3A1作为筛选制备诊断、缓解或治疗结肠癌的药剂的靶标。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增COL3A1的引物，或者针对COL3A1蛋白的抗体，以及含有COL3A1标准品。

7.一种人结肠癌标志物COL3A1的检测方法，其特征在于，其包括步骤:(1)分离提取样本中的基因组DNA或者蛋白；和/或

(2)检测(1)所得的基因组DNA或者蛋白中COL3A1的含量。

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一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其用途

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技术领域

[0001]本发明属于基因工程和医学检测领域，涉及一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其用途，尤其涉及其用于制备人结直肠癌检测制剂或检测试剂盒中的用途。背景技术

[0002]根据世界卫生组织GLOBOCAN2012的统计报道，结肠癌在世界范围内已成为第三大男性肿瘤和第二大女性肿瘤，其预后生存很差，其中，在2012年的整体致死率是50.1％(男性)和52.1％(女性)。肿瘤发并影响到个人家庭，并带来严重的社会影响、增加公共卫生支出和财政负担。因此，早发现、早确证、早治疗对于提高结肠癌的治愈率和延长预后生存时间具有非常重要的意义。研究显示，结肠癌的初发阶段一般症状不明显，容易被忽略，一旦确诊后则往往处于中晚期而使治疗效果不佳，更影响手术后的生存。所以，与其他癌症一样治疗结肠癌的一个关键在于尽可能早地发现癌。目前临床实践中，结肠癌的诊断通常包括观察排便习惯的改变、便血、腹痛等，直肠指症，实验室检查包括血常规、尿常规和大便常规、大便潜血试验，影像检查、B超、CT扫描、结肠镜检查等等；而血清血液检查则是最为通行、常规的检查，常用标志物为癌胚抗原(CEA)、结直肠癌抗原(CCA)、CA19-9，但是这些抗原检测的临床效果差异比较大，且检测的灵敏度和特异性有待提高。从这个意义上说，发现新的同时具有高灵敏度、高特异性的血液标志物是一件非常紧迫的任务。利用新型标志物，有望在常规体检筛查中尽早地发现早期结肠癌的存在。[0003]其次，对于手术后或放化疗后病人的预后效果、生存情况的预测，常规方法有赖于病理参数、TNM分期、Dukes分期等方法，但在病理判断上时常有人为因素干扰，临床实践中需要有差异显著、灵敏度高、特异性好、操作方便的分子标志物作为辅助判断手段，因此，寻找结肠癌的有效标志物，准确判断结肠癌的临床分期和预后成为广大医学研究者的迫切任务。基于现有技术的现状，本发明的申请人拟提供一种人结直肠癌分子标志物COL3A1及其在制备人结直肠癌检测制剂或检测试剂盒中的用途。

发明内容

[0004]本发明的目的是提供一种人结肠癌蛋白质标志物COL3A1用于制备人结直肠癌检测制剂或检测试剂盒中的用途，[0005]具体的，本发明提供了一种人结肠癌蛋白质标志物COL3A1用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的试剂盒。[0006]更进一步的，本发明的人结肠癌蛋白质标志物COL3A1还可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌癌细胞扩散、结肠癌淋巴结转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌癌细胞扩散、结肠癌淋巳结转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的试剂盒。

[0007]本发明所述的结肠癌蛋白质标志物COL3A1还可作为筛选制备诊断、缓解或治疗结肠癌的药剂的靶标。

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本发明所述的试剂盒中包括特异性扩增COL3A1的引物，或者针对COL3A1蛋白的抗

体；所述的检测试剂盒含有COL3A1标准品。[0009]另一方面，本发明还提供了一种人结肠癌标志物COL3A1的检测方法，其包括步骤:[0010](a)分离提取样本中的基因组DNA或者蛋白；[0011]和/或

[0012](b)检测(a)所得的基因组DNA或者蛋白中COL3A1的含量。[0013]本发明中，实验分析COL3A1基因在结肠癌和癌旁组织中的表达，结果表明，COL3A1基因在癌组织中相比于癌旁组织呈现显著高表达趋势，证明COL3A1在结肠癌发生发展过程中起作用；进一步检测证明COL3A1蛋白主要与结肠癌细胞相关，尤其COL3A1蛋白在结肠癌和癌旁中，在上皮细胞中显著差异表达，但在癌和癌旁的基质部分，表达无差异，说明COL3A1蛋白是癌上皮细胞特异的分子标志物；同时，COL3A1基因表达上调与肿瘤进展呈正相关，其中男性病人COL3A1基因上调更明显；而且，COL3A1基因和蛋白(上皮细胞)的高表达与结肠癌病人手术后的生存时间相关，该表达可作为结肠癌预后生存时间的参考判断指标及预后生存风险预测参考依据。

[0014]本发明提供了一个用于区分人结肠癌组织以及癌旁正常结肠组织、无淋巴结转移结肠癌组织和有淋巴结转移结肠癌组织的质膜蛋白标志物COL3A1，利用该标志物制备判断人结肠癌、结肠癌扩散，结肠癌淋巴结转移、临床分期、结肠癌患者预后和预后的制剂。本发明为有效判断人结肠癌癌变进程提供了科学依据。

附图说明

[0015]图1是利用Oncomine公共数据库中的基因表达芯片数据分析COL3A1基因在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达，其中，

[0016]图1-A是利用Gaedcke Colorectal数据分析COL3A1在65对直肠和直肠癌组织中的表达的散点图，散点下的数字表示病例或正常样本的个数，p值为用Student t test(T检验)分析得到的显著性值，星号代表该T检验用的是配对T检验；

[0017]图1-B是利用Hong Colorectal数据分析COL3A1在12例结肠和70例结肠癌组织中的表达的散点图；

[0018]图1-C是利用Kaiser Colon数据分析COL3A1在5例结肠和100例结肠癌组织中的表达的散点图；

[0019]图1-D是利用Skrzypczak Colorectal数据分析COL3A1在24例结肠、45例腺瘤和36例结肠癌组织中的表达的散点图；

[0020]图1-E是利用Skrzypczak Colorectal 2数据分析COL3A1在20例结肠、10例腺瘤和10例结肠癌组织中的表达的散点图；

[0021]图1-F是利用TCGA Colorectal数据分析COL3A1在22例结直肠组织、22例盲肠腺癌组织、101例结肠腺癌、22例结肠粘液腺癌、60例结肠癌、6例直肠粘液腺癌和4例乙状直肠腺癌中的表达的散点图。

[0022]图2是用Western blot方法检测COL3A1蛋白在各个结肠癌细胞系中的表达。其中，GAPDH是内参。

[0023]图3是利用商业化组织芯片进行COL3A1免疫组织化学分析的结果，其中，

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图3-A展示了COL3A1阴性表达的结肠组织；图3-B是COL3A1阳性表达的癌旁结肠组织；图3-C是COL3A1低表达的结肠癌组织；图3-D是COL3A1高表达的结肠癌上皮细胞；

图3-E/F是COL3A1中低表达和高表达的结肠癌基质；

图3-G是COL3A1高低表达的颜色标记(用ImageScope软件分析标记)；

图3-H是COL3A1蛋白在正常结肠组织和结肠癌组织中的上皮细胞中表达差异统图3-I是COL3A1蛋白在正常结肠组织和结肠癌组织中的基质细胞中表达差异统

计；

[0031]

计。

图4是Kaplan-Meier曲线分析COL3A1的基因和蛋白表达与结肠癌生存的关系图，

其中，图4-A是COL3A1基因表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图，基因表达数据来源于Oncomine基因表达公共数据库；

[0033]图4-B是COL3A1基因表达与结肠癌病人无病生存的Kaplan-Meier曲线分析图，基因表达数据来源于Oncomine基因表达公共数据库；

[0034]图4-C是COL3A1蛋白在结肠癌组织中的上皮细胞表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图，

[0035]图4-D是COL3A1蛋白在结肠癌组织中的基质细胞表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。

[0036]图5是COL3A1基因和蛋白检测结肠癌的能力的分析，其中，

[0037]图5-A是ELISA分析结肠癌病人和正常人血浆中的COL3A1蛋白表达，根据标准品的量测定COL3A1在病人和正常人血浆中的量，p值为用Student t test(T检验)分析得到的显著性值，N代表病例数；

[0038]图5-B是COL3A1蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析，横坐标代表假阳性或1-特异性，纵坐标代表真阳性或灵敏度，对角线是参考线，AUC代表线下面积；[0039]图5-C是COL3A1蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析，其中，[0040]图5-D COL3A1蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析；[0041]图5-E是COL3A1蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析；[0042]图5-F是COL3A1蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析。

具体实施方式

[0043]下面结合实施例对本发明作详细说明，而不会本发明。[0044]实施例1

[0045]利用Oncomine公共数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析COL3A1基因在结肠癌和癌旁组织中的表达，分析方法：登录上述Oncomine数据库，输入SPON2基因名，肿瘤类型选择结肠癌，数据类型选择mRNA，差异分析类型选择癌和正常分析，继而分析COL3A1基因在各个数据集中的表达情况，将各个数据集中COL3A1基因在癌和癌旁表达值分别下载、另行分析其表达的差异是否显著；分析结果证明COL3A1基因在癌组织中相比于癌旁组织呈现显著高表达趋势，这被多个数据集的分析所证明，包括Gaedcke 

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[0032]

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Colorectal(图1-A，n＝65,p＝8.5E-13)、Hong Colorectal(图-1B,n＝70,p＝0.037)、Kaiser Colon(图-1C,n＝100,p＝0.029)、Skrzypczak Colorectal 2(图-1D,n＝10,癌与癌旁比p＝0.003)和TCGA Colorectal(图-1E)。COL3A1在结肠腺瘤中上调，并且COL3A1基因在多种大肠癌组织中都显著上升，如结肠腺癌、结肠粘液腺癌、盲肠腺癌、乙状直肠腺癌和直肠粘液腺癌(图-1E)。

[0046]实施例2 用Western blot方法检测COL3A1蛋白在结肠癌细胞系的表达，[0047]1、主要溶液配制：[0048]1)PBS溶液：量取生工20×PBS溶液25mL，超纯水定容至500mL，室温保存，[0049]2)50×Protein inhibitor cocktail(蛋白酶抑制剂母液)：取一粒罗氏蛋白酶抑制剂(complete EDTA-free Protease Inhibitor cocktail tablets)，加入1mL超纯水溶解，分装，-20℃保存，此即为50×蛋白酶抑制剂母液，[0050]3)细胞裂解液：50mM Tris-HCl(pH7.4)，1％SDS，2mM EDTA，分装，-20℃保存，每毫

μL 50×Protein inhibitor cocktail，升裂解液用时再加20

[0051]4)丙烯酰胺溶液：30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，[0052]5)分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8，[0053]6)浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8，[0054]7)SDS：10％(m/v)，[0055]8)过硫酸氨AP：10％(m/v)，[0056]9)电泳缓冲液：192mmol/L甘氨酸，0.1％(m/v)SDS，pH 8.3，25mmol/L Tris，[0057]10)3×SDS凝胶加样缓冲液：150mmol/L Tris-HCl pH 6.8，300mmol/L DTT，6％SDS，0.3％溴酚蓝，30％甘油，-20℃分装保存，一般DTT现用现加，[0058]11)电转缓冲液：25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸，[0059]12)TBST缓冲液：8.766g NaCl(即0.15mol/L)，1mL Tween 20，20mL 1M Tris-HCl(pH7.4)，加超纯水定容到1L，[0060]13)封闭液：称取5g脱脂奶粉溶解于100mL TBST中即为5％脱脂奶粉封闭液；[0061]2、培养细胞全蛋白的提取方法：[0062]1)用真空泵吸掉培养基，加入PBS洗一遍，吸掉，重复一次，[0063]2)将PBS吸掉，培养皿放到冰上，加入适量的细胞裂解液，静置3min，[00]3)充解后，用干净的细胞刮快速地将细胞刮至培养皿一侧，然后用将细胞碎片和裂解液转移至1.5mL离心管中，[0065]4)4℃12000g离心15min，

[0066]5)将离心后的上清分装转移至1.5mL离心管中，-20℃保存；[0067]3、蛋白定量方法：BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天货号:P0010[0068]1)取BSA(Bio-rad)蛋白标准液，PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL，[0069]2)根据蛋白样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B，即50:1配制适量BCA工作液，充分混匀，该BCA工作液室温24h内稳定，[0070]3)将标准液按0，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μL，[0071]4)吸取2μL蛋白样品到96孔板的样品孔中，加PBS补足20μL，[0072]5)各孔加入200μL BCA工作液，37℃培养箱中放置30min，

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6)BioTek Epoch多体积分光光度计OD562nm处测定吸光度。根据标准曲线计算出

样品的蛋白浓度；[0074]4、SDS-PAGE凝胶电泳

[0075]1)取成套Bio-Rad配胶用玻璃板ddH2O清洗干净后于烘箱中烘干，用夹子固定在底座上，

[0076]按以下配方配制10％分离胶和5％浓缩胶。制备分离胶时，上层用ddH2O封胶，室温聚合40min以上；制备5％的浓缩胶时，将上层封胶ddH2O吸净后，加入浓缩胶，插入梳子，并防止产生气泡，10％分离胶配制如表1所示：浓缩胶配制如表2所示[0077]表1

[0078]

[0079]

表2

[0080]

2)待浓缩胶凝固后将凝胶板转移至垂直电泳槽中，使凝胶板凹面向内。加入电泳

缓冲液，拔出梳子，

[0082]3)已测浓度的蛋白样品按体积比为2:1加入3×loading buffer，沸水中煮5min，12000g离心1min，上样(上样量为30μg/泳道)，同时上样预染蛋白Marker，作为分子量对照，[0083]4)电泳：浓缩胶先以45V电压进行电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后转换成65V继续电泳，待指示剂跑至分离胶底部0.5cm左右停止电泳；[0084]5、转膜及Western blot[0085]1)即时准备电转缓冲液，根据凝胶大小，切割PVDF膜和滤纸，甲醇活化PVDF膜1min后，将PVDF膜和滤纸在电转缓冲液中浸泡15min以上；[0086]2)撬开玻璃板，取出SDS-PAGE凝胶，放入电转缓冲液中平衡，按黑板-海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-白板的顺序将凝胶与PVDF膜固定于湿转电转夹内，将夹子的黑面对应槽的黑面方向放入电转槽中，加满电转缓冲液进行转膜(冰浴)。通常使用110V 2h电转分子量较大的蛋白，也可在4℃冰箱中30V恒压电转过夜；[0087]3)封闭：转膜结束后取出PVDF膜，将紧贴凝胶的一面(蛋白面)朝上放入孵育盒中，

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5％脱脂奶粉室温封闭1h；[0088]4)一抗孵育：将抗COL3A1蛋白一抗(购自Sigma-Aldrich)用封闭液1:1000稀释，4℃摇床上孵育过夜；

[00]5)TBST洗涤3次，每次5-10min；[0090]6)二抗孵育：将与一抗相对应的羊抗兔二抗用封闭液稀释到适当浓度(1:5000-1:8000)，室温摇床上孵育1h；[0091]7)TBST洗涤3次，每次5-10min；[0092]8)剪取合适大小的封口膜，在上面加入200-400μL Thermo SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate超敏显色液(按1:1现用现配工作液)，室温静置1min，使用Las-3000成像系统获取Western blot结果；；[0093]结果显示：COL3A1蛋白在大部分所检测的细胞系里有表达，包括结肠癌细胞系SW620、SW480、Caco-2、HCT-116、HT-29，只有LoVo例外；而在SW620、SW480、HCT-116中丰度比较高，证明COL3A1蛋白主要与结肠癌细胞相关(如图-2所示)。

[0094]实施例3 用免疫组化方法分析COL3A1蛋白在结肠癌和癌旁正常组织中的表达[0095]1、组织芯片：使用商业化组织芯片(上海芯超生物公司)，HCol-Ade180Sur-04包括90例、180点癌和癌旁组织，临床信息包括性别、年龄、TNM、肿瘤大小、分期、分级、随访信息等。芯片样本点的直径都为1.5mm，固定方式为固定；[0096]2、烘蜡

[0097]1)将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时；[0098]2)配制试剂：10×PBS缓冲液(配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na2HPO4、2g KH2PO4，用纯水定容至1000毫升)：将10×PBS缓冲液稀释至1×PBS缓冲液，再在1×PBS缓冲液中加入占总体积0.05％的吐温试剂；抗原修复液：82mL 0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18mL 0.1mol/L的柠檬酸溶液+900mL的纯水置于高压锅中；[0099]3、抗原修复

[0100]1)片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；[0101]2)脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；90％酒精1缸，7分钟；80％酒精1缸，7分钟；70％酒精1缸，7分钟；[0102]3)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次3分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电炉上开始加热；[0103]4)抗原修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却至室温；[0104]4、阻断

[0105]配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4mL无水甲醇+12mL 30％浓度的H2O2+9.6mL纯水；将片子放入阻断剂中10分钟；[0106]5、加入一抗[0107]1)取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；[0108]2)冰箱中取出COL3A1抗体，放入离心机里7200转离心30秒；[0109]3)取出抗体，按照稀释度用DAKO抗体稀释液1：800稀释(稀释度用预实验确定，分别测试2种稀释度)；

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4)滴加抗体；

[0111]5)将湿盒放入冰箱，4℃过夜；[0112]6、加入二抗

[0113]1)从冰箱里取出湿盒，静置1小时待其恢复到室温；[0114]2)将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；

[0115]3)滴加EnVisionTM+/HRP兔工作液(来自DAKO公司)，30分钟；[0116]4)时间到后用PBS冲洗3次，一次5分钟；[0117]7、DAB显色：从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mL DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)。在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗15分钟；[0118]8、苏木素复染

[0119]1)在片子上滴加苏木素2分钟，时间到后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；

[0120]2)将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片；[0121]3)脱水过程：75％酒精1缸，3分钟；85％酒精1缸，3分钟；95％酒精1缸，3分钟；无水乙醇两缸，每缸5分钟；二甲苯两缸，每缸5分钟；[0122]9、扫描：用芯片扫描仪Scanscope XT(Aperio公司)扫描；[0123]10、芯片染色的软件分析

[0124]1)用软件Aperio ImageScope v.12打开芯片扫描文件，用软件的注释工具，分别选取上皮细胞部分和基质部分，将不需要的部分用反向选取工具剔除；有的样本点，缺乏肿瘤上皮细胞，无法统计表达情况，这样的点放弃；

[0125]2)用软件自带的positive pixel count algorithm(v9.1)工具，采用默认参数，计算选取部分的像素点及光密度值，像素点统计分为4类：阴性，弱阳性，阳性和强阳性。表达高低用软件计算的阳性率表示，阳性率＝所有阳性像素点个数/(所有阳性像素点个数+所有阴性像素点个数)；[0126]3)癌的上皮细胞，癌的基质部分，癌旁的上皮细胞，癌旁的基质部分，这4种组织部分分别统计；

[0127]4)为比较，COL3A1蛋白表达按照阳性率的中位数分为2部分，即低表达和高表达；[0128]5)用GraphPad Prism 6软件作图；[0129]结果显示，癌旁COL3A1阴性表达的样本如图-3A所示，癌旁COL3A1阳性表达的样本如图-3B所示，结肠癌COL3A1阴性表达的样本如图-3C所示，结肠癌COL3A1高表达的样本如图3D所示，结肠癌基质COL3A1低表达如图-3E所示，结肠癌基质COL3A1高性表达如图-3F所示，图3-G是图3-D中的肿瘤组织，在ImageScope软件注释并用positive pixel count algorithm(v9.1)工具分析后生成的颜色标记图，红色表示强阳性表达，橙色表示阳性表达，黄色表示弱阳性表达，蓝色表示阴性表达，绿色虚线框住的区域，是分析上皮细胞表达时剔除的基质区域；

[0130]使用HCol-Ade180Sur-04组织芯片，在上皮区域表达分析中，有效的癌旁点是82例，有效的癌点是84例，经T检验，显示COL3A1蛋白在结肠癌样本中的表达显著高于癌旁正常组织(p＝3.4E-33，不配对t检验；p＝4.6E-22，配对t检验，n＝76)(如图-3H所示)；在基质

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区域分析中，有效的癌旁点是83例，有效的癌点是85例，经T检验，显示COL3A1蛋白在结肠癌样本中的表达显著高于癌旁正常组织(p＝0.3161，不配对t检验；p＝0.3353，配对t检验，n＝79)(如图-3I所示)；[0131]结果表明，COL3A1蛋白在结肠癌和癌旁中，在上皮细胞中的表达是显著差异表达，但在癌和癌旁的基质部分，COL3A1蛋白表达无差异，说明COL3A1蛋白是癌上皮细胞特异的分子标志物。

[0132]实施例4 COL3A1表达与结肠癌病人临床参数的关系[0133]第一，COL3A1基因表达与结肠癌病人临床参数显著相关：[0134]用Oncomine基因表达数据库分析(获取数据方法同前)，结肠癌样本按照COL3A1基因的表达的中位数分为2组，一组为大于中位数的高表达组，一组为小于中位数的低表达组，用K平方法分析COL3A1基因的高、低表达与临床参数的关系。所用软件为PASW Statistics18；

[0135]结果显示：COL3A1基因的表达与分期(Smith Colorectal,χ2＝10.468,p＝0.015)、T分期(Bittner Colon,χ2＝10.073,p＝0.018)、Dukes分期(Bittner Colon,χ2＝7.607,p＝0.022；Jorissen Colorectal 3,χ2＝22.850,p＝0.000)、吸烟(Bittner Colon,χ2＝4.523,p＝0.033)、性别(Vilar Colorectal 2,χ2＝10.650,p＝0.014；Jorissen Colorectal 3,χ2＝9.491,p＝0.050)、复发(Smith Colorectal,χ2＝7.502,p＝0.006；Jorissen Colorectal 3,χ2＝6.1,p＝0.008)和生存(Smith Colorectal,χ2＝12.78,p＝0.000)有显著关系(如表3所示)，总体上，COL3A1基因表达上调与肿瘤进展呈正相关，男性病人COL3A1基因上调更明显；

[0136]表3.利用Oncomine数据库中的数据集分析COL3A1基因表达与结肠癌病人临床病理参数的关系。

[0137]

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[0139]

第二，COL3A1蛋白表达也与结肠癌病人临床参数显著相关：

[0140]根据组织芯片的免疫组化分析结果，我们发现COL3A1蛋白的表达与分级(χ2＝

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6.731,p＝0.02)、T分期(χ＝6.923,p＝0.01)和分期(χ＝8.438,p＝0.000)有显著关系(如表4所示)；

[0141]表4 COL3A1蛋白表达与结肠癌病人临床病理参数的关系(组织芯片的免疫组化分析)

[0142]

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结果表明，COL3A1的基因高表达和蛋白高表达都与结肠癌的临床参数相关，

COL3A1具有结肠癌的分子标志物的潜在作用。

[0145]实施例5 Kaplan-Meier方法分析COL3A1基因和蛋白的表达与结肠癌病人预后的关系

[0146]第一，COL3A1基因高表达与结肠癌病人手术后预后不良显著相关：

[0147]利用Oncomine数据库的基因表达数据集Smith Colorectal分析COL3A1基因表达高低与手术后结肠癌病人的生存时间的关系，COL3A1基因的表达分为大于中位数(88例)和小于中位数(例)两组，用Kaplan-Meier曲线分析方法做图，两组数据显著性用Log-rank检验方法来检验，结果证明COL3A1基因表达高的一组病人，其整体生存期(Overall survival)显著缩短(Log-rank检验，p＝0.0029)(图-4A)，低表达时的平均生存时间为103.805个月(预测值，标准误6.544，置信区间90.978-116.632)，而高表达时的平均生存时间为71.019个月(预测值，标准误6.140，置信区间58.985-83.053)；[0148]如果考虑复发的因素，统计无病生存率(Disease free survival)，则同样COL3A1基因表达高的一组病人，其无病生存期也显著缩短(Log-rank检验，p＝0.0252)(图-4B)，低

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表达时的平均无病生存时间为91.411个月(预测值，标准误7.286，置信区间77.131-105.692)，而高表达时的平均无病生存时间为66.951个月(预测值，标准误6.031，置信区间55.131-78.770)；[0149]第二，COL3A1蛋白的高表达也与结肠癌病人的预后不良显著相关：[0150]利用组织芯片进行免疫组化分析，研究COL3A1蛋白与结肠癌病人预后生存的关系；COL3A1蛋白在肿瘤上皮细胞表达高的病人，其生存期比COL3A1蛋白在肿瘤上皮细胞表达低的病人显著缩短(Log-rank检验，p＝0.0298)(图-4C)；。COL3A1蛋白在肿瘤上皮细胞表达低的病人整体生存平均生存时间为72.129个月(预测值，标准误6.081，置信区间60.210-84.048)，而COL3A1蛋白在肿瘤上皮细胞表达高的病人的平均整体生存时间为52.565个月(预测值，标准误5.203，置信区间42.368-62.763)；作为对比，肿瘤和正常组织的基质中的COL3A1蛋白表达高低，与结肠癌病人的预后无显著相关性(Log-rank检验，p＝0.6693)(图-4D)；实验结果证明，COL3A1基因和蛋白(上皮细胞)的高表达缩短了结肠癌病人手术后的生存时间，COL3A1基因和蛋白(上皮细胞)的表达可以作为结肠癌预后生存时间的判断指标。[0151]实施例6 单变量和多变量Cox回归分析分析COL3A1基因和蛋白与预后风险的关系[0152]第一、COL3A1基因与预后风险有关，但不是的风险因素，

[0153]利用Oncomine数据库的基因表达数据集Smith Colorectal分析COL3A1基因与结肠癌病人预后风险的关系，单变量Cox回归分析结果发现与整体生存和无疾病生存的预后风险显著相关的因素包括COL3A1基因的高表达、高分级、有复发、高分期，多变量Cox回归分析发现有复发、高分期是结肠癌病人预后的风险因素(如表5所示)；

[0154]表5.COL3A1基因表达及其他临床参数影响结肠癌病人整体生存及无疾病生存时间的单变量和多变量分析

[0155]

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第一、COL3A1在上皮细胞中的表达与预后风险有关，但不是的风险因素，

[0158]本发明使用单变量和多变量Cox回归方法，进一步分析COL3A1蛋白(上皮细胞)表达及其他临床参数与结肠癌病人生存风险的关系，单变量Cox回归分析结果表明，结肠癌病人的T分期(p＝0.018,风险比1.8,95％置信区间1.259-2.834)、N分期(p＝0.000,风险比＝1.534,95％置信区间＝1.266-1.859)、M分期(p＝0.000,风险比＝10.484,95％置信区间＝3.075-35.747)、分期(p<0.001,风险比＝1.311,95％置信区间＝1.147-1.499)、转移(p＝0.002,风险比＝10.123,95％置信区间＝2.294-44.6)和COL3A1蛋白(上皮细胞)表达(p＝0.030,风险比＝2.053,95％置信区间＝1.071-3.935)与结肠癌预后风险显著相关(表6)；作为比较的是，基质表达的COL3A1与预后风险无显著相关；[0159]多变量回归分析表明，高的T、N、M分期显著影响结肠癌病人的预后，增加预后风险，是的风险因素；

[0160]表6.COL3A1蛋白表达及其他临床参数影响结肠癌病人生存时间的单变量和多变量分析(组织芯片及免疫组化分析)。

[0161]

[0157]

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结果表明，COL3A1蛋白(上皮细胞)表达是影响结肠癌病人生存的潜在风险因素，

单不是风险因素。通过检测结肠癌病人癌组织中的COL3A1蛋白的表达，结合其他临床指标，就可以预测结肠癌病人的预后生存风险情况。

[01]实施例7检测结肠癌病人血液中的COL3A1蛋白的表达水平及其区分结肠癌病人与正常人的能力，

[0165]COL3A1蛋白酶联免疫试剂盒试剂盒(Cloud-Clone Corp公司产品)购自上海武昊公司。

[0166]1、结肠癌病人68例，和正常人的血浆86例，其中结肠癌病人经过手术确诊；[0167]2、主要溶液配制：

[0168]1)标准品(冻干品)稀释：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温放置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10,000pg/mL(贮液)，然后再将其进行梯度稀释，依次稀释成5,000pg/mL，2,500pg/mL,1,250pg/mL,625pg/mL,312pg/mL,156pg/mL,78pg/mL，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔；[0169]2)血清样本稀释：稀释10倍，取20μL血清或血浆加入180μL PBS；[0170]3)检测溶液A及检测溶液B配制：Detection A及Detection B使用前甩动使管壁或瓶盖的液体沉积到管底，用前分别用去离子水以1:100稀释(如：10μL检测溶液A/990μL去离子水)，充分混匀，稀释前根据计算好的每次实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL；[0171]4)洗涤液：用580mL去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释；[0172]3、操作步骤：[0173]1)加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时；

[0174]2)弃去液体，甩干；

[0175]3)每孔加检测溶液A工作液100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；[0176]4)弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液

[0163]

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体，在实验台铺垫吸水纸，酶标板朝下拍，重复洗板3次，洗涤后，甩干孔内洗涤液；[0177]5)每孔加检测溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟；[0178]6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4；[0179]7)每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色20分钟；[0180]8)每孔加终止溶液50μL，终止反应；

[0181]9)确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)；

[0182]以标准品的浓度为纵坐标，O.D.值为横坐标，绘制标准曲线；根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数(20倍)，即为样品的实际浓度(ng/mL)；[0183]结果显示：

[0184]1)结肠癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表达水平

[0185]酶联免疫吸附检测法测定了结肠癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表达水平，证明COL3A1蛋白在结肠癌病人(86例)血浆中的水平显著高于正常人(68例)(p＝1.3E-10)(如图-5A所示)，结肠癌病人血浆中COL3A1蛋白的平均浓度为159.2ng/mL，而正常人则为45.34ng/mL，病人远高于正常人；

[0186]2)血浆中COL3A1蛋白的表达水平区分结肠癌病人与正常人的能力[0187]根据酶联免疫吸附实验的结果，利用受试者操作特征曲线分析，COL3A1蛋白的线下曲线面积(AUC)值为0.92(如图-5B，表7所示)，说明COL3A1蛋白作为血浆标志物可以很好地将结肠癌病人与正常健康人区分开来，COL3A1蛋白可以作为结肠癌诊断的血浆指标；[0188]3)血浆COL3A1蛋白检测结肠癌的灵敏度和特异性：根据酶联免疫吸附实验的结果，可以获知血浆COL3A1蛋白检测结肠癌的灵敏度和特异性，当血浆COL3A1蛋白浓度为54.23ng/mL时，结肠癌检测的灵敏度是98.8％，而特异性是69.1％(如表8所示)。[01]表7.受试者特性曲线分析的曲线下的面积(AUC)。

[0190]

[0191]

a.在非参数假设下，b.零假设：实面积＝0.5。

[0192]表8显示接受者操作特征曲线分析结肠癌病人及正常人血浆中COL3A1的表达检测结肠癌的灵敏度和特异性，

[0193]a最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1。所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值。[0194]表8

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[0199]

实施例8 结肠癌病人癌组织中的COL3A1蛋白的表达水平及其区分结肠癌病人与

正常人的能力

[0200]利用组织芯片-免疫组化的结果，分析COL3A1在上皮细胞及基质细胞中的表达在区分结肠癌病人与正常人的使用中的能力，方法：接受者操作特征曲线分析；结果显示：利用受试者操作特征曲线分析，COL3A1蛋白(上皮表达)的线下曲线面积(AUC)值为0.976(如图-5C，表9所示)，说明COL3A1蛋白(上皮表达)作为标志物可以很好地将结肠癌病人与正常健康人区分开来，COL3A1蛋白(上皮表达)可以作为结肠癌诊断的分子标志物。

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表9.COL3A1蛋白(上皮表达)受试者特性曲线分析的曲线下的面积(AUC)。

[0203]

a.在非参数假设下，b.零假设：实面积＝0.5，

[0204]COL3A1蛋白(上皮表达)检测结肠癌的灵敏度和特异性：[0205]根据ROC分析的结果，可以获知COL3A1蛋白(上皮表达)检测结肠癌的灵敏度和特异性，当COL3A1蛋白(上皮表达)的阳性率为82.09％时，结肠癌检测的灵敏度是95.2％，而特异性是91.5％(表8)；

[0206]表10显示了接受者操作特征曲线分析结肠癌病人及正常人肿瘤中COL3A1(上皮表达)的表达检测结肠癌的灵敏度和特异性；[0207]a最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1。所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值。[0208]表10

[0209]

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[0212]

与上皮表达相比，基质表达的COL3A1诊断结肠癌效果较差，其AUC值为0.573(如图

5-D所示)，无诊断价值；[0213]结果表明：肿瘤上皮细胞表达的COL3A1蛋白具有诊断价值，AUC为0.976，比血浆中的COL3A1蛋白的AUC值高，并且灵敏度达95.2％(与血浆COL3A1相当)，而特异性为91.5％

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(比血浆COL3A1明显好)。

[0214]实施例9 结肠癌病人癌组织中的COL3A1基因的表达水平及其区分结肠癌病人与正常人的能力

[0215]利用Oncomine数据库的基因表达数据集，分析COL3A1基因表达在区分结肠癌病人与正常人的使用中的能力，方法按接受者操作特征曲线分析。[0216]结果显示：[0217]第一、利用Gaedcke Colorectal数据集，结肠癌65例，正常组织65例，受试者操作特征曲线分析，COL3A1基因的线下曲线面积(AUC)值为0.829(如图-5E，表11所示)，说明COL3A1基因表达作为标志物可以很好地将结肠癌病人与正常健康人区分开来，COL3A1基因可以作为结肠癌诊断的分子标志物；

[0218]表11.COL3A1蛋白(上皮表达)受试者特性曲线分析的曲线下的面积(AUC)。

[0219]

[0220]

实面积＝0.5；a.在非参数假设下，b.零假设：

[0221]COL3A1基因(Gaedcke Colorectal数据集)检测结肠癌的灵敏度和特异性：[0222]根据ROC分析的结果，获知COL3A1基因检测结肠癌的灵敏度和特异性，当COL3A1基因的芯片检测表达值为5.8时，结肠癌检测的灵敏度是76.9％，而特异性是92.3％(如表12所示)。

[0223]表12是接受者操作特征曲线分析结肠癌病人及正常人肿瘤中COL3A1基因表达检测结肠癌的灵敏度和特异性；

[0224]a最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1。所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值。[0225]表12

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[0229]

第二、利用TCGA Colorectal数据集，结肠癌215例，正常组织22例，受试者操作特

征曲线分析，COL3A1基因的线下曲线面积(AUC)值为0.863(如图-5F，表13所示)，说明COL3A1基因表达作为标志物可以很好地将结肠癌病人与正常健康人区分开来，COL3A1基因可以作为结肠癌诊断的分子标志物。

[0230]表13.COL3A1蛋白(上皮表达)受试者特性曲线分析的曲线下的面积(AUC)

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a.在非参数假设下，b.零假设：实面积＝0.5，

[0233]COL3A1基因(TCGA Colorectal数据集)检测结肠癌的灵敏度和特异性：[0234]根据ROC分析的结果，获知COL3A1基因检测结肠癌的灵敏度和特异性，当COL3A1基因的芯片检测表达值为6.0时，结肠癌检测的灵敏度是82.8％，而特异性是81.8％(如表14所示)；

[0235]表14显示接受者操作特征曲线分析结肠癌病人及正常人肿瘤中COL3A1基因表达检测结肠癌的灵敏度和特异性，

[0236]a最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1，所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值；[0237]表14

[0238]

[0232]

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[0241]

结果说明，COL3A1基因表达可以作为结肠癌诊断的分子标志物，结肠癌检测的灵

敏度是76.9％-82.8％，而特异性是81.8％-92.3％。

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图1

图2

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图3

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图4

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图5

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