一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110791552 A(43)申请公布日 2020.02.14

(21)申请号 201911167386.4(22)申请日 2019.11.25

(71)申请人 基恩生物科技（大连）有限公司

地址 116000 辽宁省大连市高新技术产业

园区七贤岭火炬路43号1楼3号(72)发明人 丁岩　

(74)专利代理机构 大连至诚专利代理事务所

(特殊普通合伙) 21242

代理人 杨威　涂文诗(51)Int.Cl.

C12Q 1/6827(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页

序列表14页

(54)发明名称

一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒(57)摘要

本发明公开了一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒。所述探针池选自核酸序列如SEQ ID NO 1～74所示的探针中的至少一种，其试剂盒适用于FFPE、新鲜组织的，基于NGS方法针对NTRK-1-2-3融合基因变异的检测。其根据NTRK-1-2-3融合基因变异高度相关的区域设计捕获探针，覆盖率高而均一，提高了融合检测的特异性。其文库转化率高，RNA使用量低，测序成本低。本发明覆盖热点靶向突变基因，探针捕获特异性高，此外一个产品解决多种泛癌种NTRK-1-2-3融合基因检测的需求，以及临床上样本凑样问题，减少实验工作人员重复工作的复杂问题。

CN 110791552 ACN 110791552 A

权　利　要　求　书

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1.一种检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池，其特征在于：选自核酸序列如SEQ ID NO.1～74所示的探针中的至少一种。

2.权利要求1所述的探针池，其特征在于：所述NTRK-1-2-3融合基因选自LMNA-NTRK1、TFG-NTRK1、TP53-NTRK1、TPM3-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、AFAP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、BEND5-NTRK2、CPEB1-NTRK3、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。

3.一种用于检测NTRK-1-2-3融合基因变异的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的探针组合物。

4.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒适用于FFPE或新鲜组织的分子检测。

5.权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒基于NGS方法针对泛癌NTRK-1-2-3融合基因进行检测。

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一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及

试剂盒

技术领域

[0001]本发明涉及一种检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池技术领域，特别涉及一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒，以弥补国内市场NTRK融合基因检测的空白。

背景技术

[0002]高通量测序技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短为标志。Illumina测序平台是现在主流的二代测序平台，可以同时检测到常见、罕见突变、基因融合、基因扩增等基因不同突变，指导靶向用药、揭示耐药机制。[0003]NTRK-1-2-3基因融合属于染色体改变，其结果会产生构象激活的异常TRK融合蛋白，其作用为肿瘤驱动因子，在肿瘤细胞系中可促进肿瘤细胞的增殖和存活。FDA已批准TRK抑制剂Larotrectinib(商品名为Vitrakvi)，用于治疗无已知耐药突变的，广泛转移或局部手术治疗效果不好的，现有治疗方案进展或无可替代治疗方案的，NTRK基因融合的成人和儿童实体瘤患者，并且疗效显著。Larotrectinib在多种独特的肿瘤类型中显示了较为明显的临床获益，包括肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、结肠癌、软组织肉瘤、涎腺肿瘤和婴儿纤维肉瘤等。

[0004]但是，目前国内市面上还未有NTRK-1-2-3融合基因检测试剂盒，因此急需研发出NTRK-1-2-3检测试剂盒，以弥补NTRK-1-2-3融合基因检测空白的现象。发明内容

[0005]本发明的一个目的在于提供一种探针池，基于二代测序技术，通过杂交捕获靶向富集的工作流程，用于泛癌种患者NTRK-1-2-3融合基因的精准分子诊断技术。[0006]本发明主要基于二代测序方法，针对泛癌NTRK-1-2-3融合基因设计探针池，通过靶向捕获测序的方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异。本发明所述的探针池，其选自核苷酸序列如SEQ ID NO.1～74所示的探针中的至少一种，进一步，优选自核酸序列如SEQ ID NO.1～74所示的探针中的n种，其中n为2、3、4、5……～74的整数。本发明所述的全部74个探针，其所针对的癌基因，覆盖了包括16个NTRK融合高度相关的基因，LMNA-NTRK1、TFG-NTRK1、TP53-NTRK1、TPM3-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、AFAP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、BEND5-NTRK2、CPEB1-NTRK3、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。优化的探针池，其包括融合基因序列为SEQ ID NO 1～74组成的全部探针，可以用于泛癌患者的精准治疗，同时适用于FFPE组织，新鲜组织的基因变异检测。

[0007]本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒，包括上述的探针序列为SEQ ID NO 1～74所示的探针组合物中的至少一种，该试剂盒基于NGS方法探针池检测NTRK-1-2-3融合基因泛癌种，且同时适用于FFPE、新鲜组织的变异检测。

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利用上述探针组合物或上述的试剂盒，可用于基于高通量测序方法的NTRK-1-2-3

融合基因检测，其检测过程包括：样本采集，样本RNA提取，RNA逆转录合成cDNA，末端修复加A，连接，标签PCR扩增，杂交、捕获富集等，并进行NGS上机测序，针对测序后的数据进行分析，判断样本变异类型。[0009]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0010]1)针对每个融合变异位点设计探针，覆盖度高而均一，且捕获探针长度为120nt，保证探针的高特异性。同时检测16个NTRK-1-2-3融合基因变异，覆盖热点靶向突变基因，且降低检测成本。

[0011]2)采用自主建库技术，文库转化率高，降低了RNA使用量的要求(低至50ng)，同时可以有效利用测序数据，降低测序成本。

[0012]3)对于一个第三方检验实验室或者企业来讲，可一个产品解决所有泛癌种NTRK-1-2-3融合基因检测的需求，解决探针合成成本问题，以及临床上样本凑样问题，减少实验工作人员重复工作的复杂问题。

[0013]4)本发明提供的试剂盒设计时加入了临床实验期的药物靶点。有助于实现产品从实验室向工业应用的转化，具有良好的应用前景。具体实施方式

[0014]下面结合本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的。[0015]本试剂盒名称为：NuoCancerTMNTRK Gene For Tissue(NTRK融合基因检测试剂盒，基恩生物科技(大连)有限公司；可以通过商业途径购买获得)，以下实验均按照该试剂盒说明书进行操作。

[0016]本申请下述实施例中，试剂盒的设计选择了16个NTRK融合高度相关的基因，LMNA-NTRK1、TFG-NTRK1、TP53-NTRK1、TPM3-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、AFAP1-NTRK2、PAN3-NTRK2、NACC2-NTRK2、QKI-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、BEND5-NTRK2、CPEB1-NTRK3、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3。[0017]实施例1

[0018]本发明建库杂交捕获流程采用的验证方法如下：[0019]一、从医院收集的FFPE或者新鲜组织中提取RNA。

[0020]1.以下操作需要在不含RNase和DNase的环境下进行。[0021]2.定量，RNA的最佳范围是40ng-500ng之间(总量)。[0022]3.Agilent Technologies 4200Bioanalyzer质检RNA片段完整，主峰在200bp-6000bp之间，且18s，28s均可质检出片段。[0023]二、RNA逆转录合成cDNA。[0024]1.RNA片段化[0025](1)取5μL RNA样本，以及5μL FBS1混合均匀，瞬时离心。[0026](2)设置以下程序在PCR仪上进行反应，热盖温度均设置为94℃。

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[0027]

[0028][0029][0030]

2.合成第一链cDNA(1)取出片段化试剂，按照下表要求加入以下试剂，混匀。

组分体积上一步片段化反应液10μLSEM1(一链合成酶)1.5μLNuclease-free Water(无核酸酶水)8.5μL总体积20μL

[0031](2)设置PCR仪程序，25℃，10min；42℃，15min；70℃，15min；4℃，∞上进行反应，热盖温度均设置为105℃，运行。[0032]3.合成第二链cDNA[0033](1)取出第一链合成cDNA反应液，加入SB2(二链合成缓冲液)试剂8.5μL，SEM2(二链合成酶)试剂3.5μL，Nuclease-free Water试剂48μL，混匀，瞬时离心，16℃，60min，程序结束后立即进行下一步反应。[0034]4.磁珠纯化：[0035](1)磁珠提前20min平衡至室温。[0036](2)将二链合成后的反应液转移到1.5mL管中，加入144μL磁珠，混匀，室温孵育5min。[0037](3)将离心管放磁力架上，待管内溶液澄清，约2min，弃上清。[0038](4)离心管放磁力架上，加200μL 80％乙醇，静置30sec，弃上清。[0039](5)重复用80％乙醇清洗一遍，弃上清，并室温开盖晾干磁珠。[0040](6)加入37.5Elution Buffer液体重悬磁珠，室温孵育5min。[0041](7)置磁力架上，2min，将36.5μL Elution Buffer至新的PCR管中。[0042]5.cDNA合成后质控[0043]定量，使用生物分析仪生物分析仪进行条带分析。cDNA浓度大于1ng/uL，主峰在100bp-400bp，则合格，可进入下一步反应。[0044]三、cDNA末端修复、加A[0045]1.取出cDNA纯化后溶液，加入5μL ERB(末端修复尾端加A缓冲液)，10μL ERA(末端修复尾端加A酶混合液)，混匀，离心。置于PCR仪中，“4℃，1min；20℃，30min；65℃，30min；4℃，∞”，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步。[0046]四、接头连接

[0047]1.取出加A后的反应液，加入10μL LIG(DNA连接酶)，20μL LIB(DNA连接缓冲液)，15μL Nuclease-Free Water，以及5μL SUA(illumina测序平台通用短接头)，混匀，瞬时离

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心。

2.置于PCR仪中，“20℃，15min；4℃，∞”，运行，达到4℃时，进行下一步。

[0049]五、连接后纯化

[0050]1.取80uL磁珠加入连接后溶液中，混匀，室温孵育5min。[0051]2.置于磁力架上，2min，直至溶液完全澄清，弃上清。[0052]3.保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复80％乙醇清洗一次，完全弃上清。[0053]4.室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。[0054]5.加入26.5μL Elution Buffer，充分涡旋重悬磁珠，室温孵育5min。[0055]6.置于磁力架上，2min，待上清澄清后取25μL上清至新的PCR管中。[0056]六、加标签，文库扩增[0057]1.取出纯化后溶液，加入25μL HPM(增强型PCR混合液)，5μL CPM((唯一标签引物混合液))混匀，瞬离。[0058]注：不同子文库CPM编号不同。

[0059]2.设置以下程序在PCR仪上进行反应，热盖温度设置为105℃，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步纯化工作。

[0048]

[0060]

七、加标签，文库扩增

[0062]1.取50μL磁珠加入上述反应后的PCR管中，混匀，离心，室温孵育5min。[0063]2.将PCR管放置在磁力架上，静置2min，待溶液澄清，弃上清。[00]3.保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复80％乙醇清洗一次，完全弃上清。[0065]4.室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。[0066]5.加入27μL Elution Buffer，充分涡旋重悬磁珠，室温下孵育5min。[0067]6.置于磁力架上，2min，待上清澄清后取26μL至新离心管中。[0068]八、子文库质控[0069]定量，Agilent 4200生物分析仪进行条带分析。子文库浓度大于20ng/uL，主峰在150bp-500bp，则合格，可进入下一步杂交反应。[0070]九、子文库样本pooling混合、浓缩和杂交[0071]1.子文库样本pooling混合[0072](1)将不同CPM编号的RNA文库分别取500ng，加到1.5ml低吸附离心管中，同时加入

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7.5μLHCD(人cot脱氧核糖核酸片段)，记录混合文库总体积，加入2倍体积的磁珠进行浓缩。(注：不同Index编号的RNA子文库可pooling在一起，最多12个子文库pooling在一起；同一编号的Index子文库需分开杂交)[0073]2.混合文库浓缩[0074](1)移液器上下吸打混匀。瞬时离心，室温孵育10min。[0075](2)将离心管放置在磁力架上，待溶液完全澄清，约2min，弃上清。[0076](3)保持离心管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清，重复该步骤一次，且完全去除残留酒精。[0077](4)室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。[0078]3.杂交[0079](1)提前配置下表杂交混合液。

[0080]

组分体积

HYB(杂交缓冲液)9.5μLHYE(杂交增强缓冲液)3μLHUB(杂交阻断剂)2μLCPR-NTRK(NTRK探针)4.5μL总体积19μL

[0081]注：NTRK探针即为本发明所述的SEQ ID NO.1～74所示探针混合物。[0082](2)加入19μL配好的杂交混合液，重悬磁珠，磁力架静置2min。[0083](3)将17μL上清转移至新的PCR管中，置于PCR仪上，95℃运行30sec，65℃杂交过夜(16h～20h)，热盖温度设为100℃。[0084]十、捕获、洗脱[0085]1.试剂准备[0086](1)试剂准备：按照下表(1个样品)将试剂稀释到1x工作液，可于室温放置最多放置4周。[0087](注：将分装好的1xWB1和1x SWB提前30min放置于65℃下温育)

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2.磁珠准备：

[0090](1)提前取出链霉亲和素磁珠，涡旋混合均匀，室温平衡30min。[0091](2)取50μL链霉亲和素磁珠至低吸附离心管中，加入100μL1x清洗液1，置于磁力架上，直至管内溶液完全澄清，小心移除上清，重复两次，共清洗两次。[0092]3.水浴锅准备：提前将水浴锅调至65℃。[0093]4.捕获[0094](1)转移转移PCR仪上的杂交产物到上一步的磁珠中，用移液吸打10次混匀，置于PCR仪上“65℃45min”，PCR仪热盖温度设为75℃。[0095](2)每隔10min，移液器混匀。45min后，立即进行捕获后清洗步骤。[0096]5.热清洗[0097](1)加入100μL65℃预热好的1x清洗液1到上述PCR管中，用移液吸打10次混匀，放置于磁力架上，静置1min，小心移除上清。[0098](2)加入150μL65℃预热好的1x增强型清洗液，重悬磁珠，用移液混匀。瞬时离心，65℃水浴锅中孵育5min。置于磁力架上2min，弃上清。[0099](3)重复上一步，即加入150μL65℃预热好的1x增强型清洗液，重悬磁珠，用移液吸打10次混匀，尽量避免产生气泡。瞬时离心，65℃水浴锅中孵育5min。置于磁力架上直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。[0100]6.室温清洗[0101](1)加入150μL室温放置的1x清洗液1，移液吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。[0102](2)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清。[0103](3)加入150μL室温放置的1x清洗液2，移液吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。[0104](4)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋震荡30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁

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力架上1min，弃上清。[0105](5)加入150μL室温放置的1x清洗液3，移液吸打10次充分混匀，直至磁珠完全重悬。[0106](6)涡旋震荡30s，静置30s，涡旋震荡30s，静置30s，共2min，确保充分混匀，置于磁力架上1min，弃上清。[0107](7)瞬时离心，彻底清除残留液体，避免吸到磁珠。[0108](8)离心管置于磁力架上，室温开盖，干燥磁珠，勿太干。[0109](9)加入20μL无核酸酶水，吸打混匀。[0110]十一、富集

[0111]1.配置以下反应体系，吸打混匀，保证磁珠均匀分散在溶液中：

[0112]

[0113]

2.设置以下程序在PCR仪上进行反应(单个子文库杂交)，PCR仪热盖温度设置为105℃，当PCR仪达到4℃时，立即进行下一步纯化工作。

[0114]

[0115]

3.富集后纯化[0117](1)磁珠提前20min平衡至室温，取80μL磁珠加入上述反应后的PCR管中，充分涡旋混匀，瞬时离心，室温孵育5min。[0118](2)将PCR管放置在磁力架上，等待2min直到管内溶液完全澄清，小心移除上清。[0119](3)保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，弃上清。重复该步骤一次，完全去除残留乙醇。

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(4)室温下开盖将磁珠晾干，勿过干。

[0121](5)加入22Elution Buffer到离心管中，重悬磁珠，室温下孵育5min。[0122](6)置于磁力架上，2min，待上清澄清后取21μL至新的PCR管中。[0123]十二、文库质控[0124]定量，Agilent 4200生物分析仪进行条带分析。混合文库浓度大于3ng/μL，主峰在200bp-500bp，则合格，可进入测序环节。[0125]实施例2阳性标准品检测：

[0126]1.从SeraCare公司购买国际通用标准品(SeraCare：FFPE NTRK Fusion RNA Reference Material)。[0127]2.Qubit定量，NTRK-1-2-3阳性标准品采用50ng逆转录。[0128]3.采用核苷酸序列如SEQ ID NO 1～74所示的探针池，按照实施例1所述方法进行建库，测序，使用Illumina平台测序。

[0129]4.NTRK-1-2-3阳性标准品检测数据，如下表1：[0130]表1.NTRK-1-2-3阳性标准品检测数据

[0131]

Fusion RNALMNA-NTRK1IRF2BP2-NTRK1SQSTM1-NTRK1TFG-NTRK1AFAP1-NTRK2NACC2-NTRK2PAN3-NTRK2ETV6-NTRK3BTBD1-NTRK3

断点1

chr1:156108398chr1:234744192chr5:179252226chr3:100451516chr4:7780488chr9:1305044chr13:28713224chr12:120097chr15:83710479

断点2

chr1:156844697chr1:156844362chr1:156844362chr1:156844362chr9:87356806chr9:87359887chr9:87549076chr15:88576274chr15:88576276

断点1深度1061457263513482534795735657327

断点2深度674472430580432440200665752485248

频率48％49％29％12％72％57％52％24％83％

测试总结：NTRK-1-2-3融合panel共设计16个融合基因位点，其中阳性标准品中涵

盖本发明panel中的9个融合基因，分别为LMNA-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、TFF-NTRK1，AFAP1-NTRK2、NACC2-NTRK2、PAN3-NTRK2、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3融合基因的突变，均检测出，剩余7个融合位点因为标准品局限性未涵盖，因此无法提供测试结果，但是由此可以证明本试剂盒实验方法和探针捕获的技术可行性。同时由此证明本发明所述方法可以一次同时检测16个NTRK-1-2-3融合基因变异的技术可行性，覆盖热点靶向突变基因，检测成本低，便于产业化应用。[0133]以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

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序列表<110> 基恩生物科技（大连）有限公司<120> 一种基于NGS方法检测NTRK-1-2-3融合基因变异的探针池及试剂盒<130> 2019<160> 120<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 1TGACAGAGCA TGACTCTGTC TCGAACAACA AACAAACAAC CACAACAAAA CACTAATGGT 60TTTATTATCT AATTAAAGAC TGAATACAAG ATCCTCTCGA TTTCTGTTAT CTTTGTAACT 120<210> 2<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 2AGCTGAAAAA TGACTCTATC TGACAGTAAA AGGGACCTAG TCAGGGCAGT CTTCATCTGA 60GCAGGTAATT GTAGTTTCTT TTGCAACATA TTAATAAGAG AAGTATTATT TTAACACACT 120<210> 3<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 3CCACAACTCA TTGTATAAGG CCAACATCAT CTTGATACCA AATCCTCACA GAGGCACAAC 60AACAAAAAGA ACTTTAGGCC AATATCCTTG ATGAACATTG ATGCAAATAT CCTCAACAAA 120<210> 4<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 4CAATAAATTA AAACAGGATG TTATCGTCTA TCTTAATCAG GACTTGGAAA AAATATGGCC 60TCATAACCAG TACCTTTGTA AGACATGATT ATGAAGCCAA TATACTAAAG TATTAAAATC 120<210> 5<211> 120<212> DNA<213> 人工序列

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序　列　表

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<400> 5GGCTGAGGCA CAAGAATTGC TTGAACCTGG GAGGCAGAGG TTGCAGTGAG CCAAGTCTGC 60GCCACTGCAC TCCAGCCTGG GTGACAGAGT CAGACTCTGT CTCTAAAAAA AAAAAAAAAT 120<210> 6<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 6TCTGTCCATA TGCTCTTCGT AAGAGACACA CCTAAAACCA GGGAAATAAT AATCAAAATG 60AACTGGTATG AAAATATTAG TATCAGACAA ATTAGTCTTT AAGTCATATG CAATTTAGGG 120<210> 7<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 7TCTCATGATA AAACTTGAGC AGATGAGGAG TTAATTCTTA TGGATGAGCA AAGAACGTGG 60TTTCTTTAGA TGATGGAATC TACTGTTAGT GAAGAGGCTA TGAACATTGT TGAAATGACA 120<210> 8<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 8AGAGAATTCT CTGTAACTGA AATTAGTGAA ATAATTTTAT TTCTCACTAT ATTTAGCAAG 60TCGTATGCTT CAGGCAGACC TCAAATACTG CCACATTGTT AAACTAATCC AAACTACAGT 120<210> 9<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 9GTTTTCCTCT GGAAAAAAAA ATATTTATAT ATATACCTGG GAATTTGAGA AAGGATTAGA 60CAGTCACTAA CCACACATGT CCTGGTTACT CTCGTCACCT CTTACCTTCC GTTTTCTTAT 120<210> 10<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 10ATATATACCT GGGAATTTGA GAAAGGATTA GACAGTCACT AACCACACAT GTCCTGGTTA 60CTCTCGTCAC CTCTTACCTT CCGTTTTCTT ATAATAGAAT GTCTGGTTCC TACAATTTAA 120<210> 11

12

CN 110791552 A

序　列　表

3/14页

<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 11GCTCGAACTG GGTGGAGCCC ACCACAGCTC ACGGAGGCTT GCCTGCCTCT GTAGGCTCCA 60CCTCTGGGGG CAGGGCACAG ACAACAAAAA GACAACAGTA ACTTCTGCAG ACTTAAATGT 120<210> 12<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 12CCAAAAGTAG ATAAAACCAC AAAGATGGGG AAAAAACAGA ACAGAAAAAC TGGAAACTCT 60AAAACGCAGA GCGCCTCTCC TCCTCCAAAG GAACGCAGTT CCTCACCAGC AACGGAACAA 120<210> 13<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 13CCACAAAGAT ACTCCTCGAG AAGAGCAACT CCAAGACACA TAATTGTCAG ATTCACCAAA 60GTTGAAATGA AGGAAAAAAT GTTAAGGGCA GCCAGAGAGA AAGGTCGGGT TACCCACAAA 120<210> 14<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 14AGACATCTAC AGAACTCTCC ACCCCAAATC AACAGAATAT ACATTTTTTT CAGCACCACA 60CCACACCTAT TCCAAAATTG ACCACATACT GGGAAGTAAA GCTCTCCTCA GCAAATGTAA 120<210> 15<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 15ACTATTCCAA TCAATAGAAA AAGAGGGAAT CCTCCCTAAC TCATTTTATG AGGCCAGCAT 60CATTCTGATT CCAAAGCCTG CCAGAGACAC AACAAAAAAA GAGAATTTTA GACCAATATC 120<210> 16<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 16

13

CN 110791552 A

序　列　表

4/14页

CAAAAAACCA AACACCGCAT ATTCTCACTC ATAGGTGGGA ATTGAACAAT GAGATCACAT 60GGACACAGGA AGAGGAATAT CACACTCTGG GGACTGTTGT GGGGTGGGGT GAGGGGGGAG 120<210> 17<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 17GGGAGATATA CCTAATGCTA GATGACGAGT TAGTGGGTGC AGCGCACCAG CATGGCACAT 60GTATACATAT GTAACTAACC TGCACAATGT GCACATGTAC CCTAAAACTT AAAGTATAAT 120<210> 18<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 18AAATCTGGAG AACTTACACT GTCCTATTTC AAGAATTACA ACAAAGCTAC AGTAATCAAG 60ACATTGTGAT ACTGACAAAG AATAGACATT CAAATCAACG GAATGGAAAT AATTCAGAAA 120<210> 19<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 19CTGTTTTGGT TACTGTAACC TTGTGACATA GTTTGAAGTC CAGTAGTGTA TGCCTCTGGC 60TTTGTTTTTT CTGCTTAGGA ATACTTTGAC TATTCAGGCT CTTTTTTTGG TTCTGTATAA 120<210> 20<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 20CAATGGCAAT GCTTCCAGTT TTTCCCCATT CAGTATGATG TTGGTTGTGG GAGTTTGTCA 60TAGATGACTC TTGTTATTTT GAGGTATATT CTTTTGATAC TTAGTTTGTC AAGGGCTTTT 120<210> 21<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 21CCGTTTTTAA CATGAAGGGG TGTTTGAATT TTATCAGATA TTTTTCTGCA TCTATAGAGA 60TGATCATGTG GTTTATGTTT TTAGCTTTAT ATGTTTAATC ACATTTATTG ATTTGTTTAT 120<210> 22<211> 120

14

CN 110791552 A

序　列　表

5/14页

<212> DNA<213> 人工序列<400> 22CTGAAATCTT TCTAACTTCT TAAGGTTTAG TGCTGTAAAC TTTCCTTAGA AGACTGCTTT 60AGCTGTATCC CAGAGATTCT GGCACATTGA GTCTTTGTTT TCATTAGCTA CAAACAAAAA 120<210> 23<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 23CTACCTGTCT GACAGGATCA ATCATACCTC AAACTTCAGC ATCACACAAT ATACCCACAT 60GACAAATGTG CACTTGTATA CCCCCATGAA TCTAAAATAA AAGTTGAAAT TTTTAAAAAC 120<210> 24<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 24TCAAACTATT TGATTTAATC ACACTTGCAA GTTTCCTTTT ACATATGTAC CACAGTCACA 60TGTTCTGGGG TTTAAGATGT GGGTACTTTT GGGGCATCAT TCTGCCTACC ATAAGGTGAT 120<210> 25<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 25ATAAGGTGAT ACAACCAGAA CCGGCTTTTT AATTTGCAGA GTCCAGTGTA AAATGAAATG 60CAGGACTCCA TATTAAACAA TTGTTAAGAA TCTCAAGATA GCCACAGCAG AGCATAAAAC 120<210> 26<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 26CATTATATTT CTTGTGATTT ATTTAATAAT TATATTAATA CCTGAATTAA ATACAAGGGC 60CTAATATGCG ATTCTTTTAT ATCTTGCCTT GATCTTAGTA ACTAGGTTTA TTTTTACTTT 120<210> 27<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 27GTAATAGTTA AATAATTTTT TAATAAAATA AAATAAATGC ACAACAAGAG GAATGATTAA 60

15

CN 110791552 A

序　列　表

6/14页

GTATAATTTG ATTCAATCCA ATAACATAGA ATACCATACA ACCATTAGCT GTGATCATAG 120<210> 28<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 28AGCACCAAAG GAATTTTGTA GTTGTTTGGT TGGTTGGTTT TACTTTGTTT TAACATGAAT 60GCCCAAGCTC CATCCAAGGG ATCTACTTAA TCAGAATCTC CAGAGTTTAG ACAAGATAAA 120<210> 29<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 29AATGGCTGAG TGGATAATGG CAGGAGACAT CTTTAGCTAC CATGAAAAGT ATTAAGCCAA 60TGTGTTTGTT GAATTCATTT TGCTGGTGGT CACTTTGTGT TCATTCTGAA CATCCAGCAG 120<210> 30<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 30AGGAGAAGCT ACAGAGCATT TGGAGAAGAG CTTGTAAAGA CAGAAGGAGT CCCAGTTGCA 60GGGATCCCAT ATGTTAAGTC ACATGGGTGG ACATTATGAG GAGGCATGAT GAGGAGTCAA 120<210> 31<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 31ATCCTAGCAC TTTGGGAGGC AGAGGTGACT GAATTACTTG AGCTCAGGAG TTCAAGACCA 60GCCTGGGCAG CATGGCAAAA CCCCATCTCT ACAAAAAATA CAAAAATTAG CCTGGCATGG 120<210> 32<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 32GGCTCACTGG CAAAATGACT TTAAAAGCAA AGGCTGTGGA GCCAACTTTT CTGGTTCAAA 60TCCAAGCTCT CTATATGCCA GCACAGGATC TTGAGCACAT TATTATTCCT CCTGGAGCTC 120<210> 33<211> 120<212> DNA

16

CN 110791552 A

序　列　表

7/14页

<213> 人工序列<400> 33TATCTATCTT ATATGTATTA TCCTCTATAT AATTTTCTAA TTATCGTAGT TATCTTTATT 60AGGTCAAATT TATTAATAAT CGGTTTGGAT TTTATTAACA GAACACTTTC TCTTATGGGA 120<210> 34<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 34TTAAAATCAT ATGAGGGTTA TAAAAGTTTA CACTTTTTCT TTTTGGGACT TTTCTTATAC 60ACAATATTTT CATATCGGAC TATTCTTATA TATATAATGT TTCGTATTTT TCACGTTTAA 120AATACGCTTA TTACGTCGAT TATAAATTTG TCTAGTTAAT CACGTTCTTT TTTATTATCG 120<210> 35<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 35CATAGTTAGT TGACAGTATC TTTAATCTTC AGATCTATAT TTTTCTTTCC AGGATTTATA 60TATTTTCATT CGGTTATAAT TTTATTAACA TAAAATTCTA TTTTCGTGAA TGAGTTTCAA 120<210> 36<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 36AAATTATTGA CGTGTGTCTG ATTATTAGTA ATTCTATTGA ATTGCTGTTA TATTCTCATA 60CTAGTATTTC TTTTATAAGT AACCATTTTG AATTTTTTAC ACTTCCTTAT GAACAATTTA 120<210> 37<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 37ATATTATCTG TCTGATTATT GTAAATTCCG CGCATTATTG TTATGTTACC GCATTTATTT 60CGCTTTATAA GATTTATTAA ACTGTAATAG ACTAATTTTA CATTATTTAT GTCTTTAATA 120<210> 38<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 38TGTTGTGTTT TGTTTTTATT TTGACTTCAA TTTTTAATTA TTTTATGCAA ATATCAACTA 60

17

CN 110791552 A

序　列　表

8/14页

CTATGTACTT GCATTATGTG AATAACTTTA AAGTTACAAC TAATGCATTT AATTTCGCCA 120<210> 39<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 39ATAATTCCTA TGCTTTTCCT TATCATCACA CTTATATATA TGTAATCAAT GAGTCTTTTG 60ATTATGTAAG TACACTTGTT GTCTTAGTAA TTATTATTCT AATAAATTTG TAGTTGTTTA 120<210> 40<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 40GTTTTCTATT TTTATACTAC GAATTATCAA GAGCTTTTTA TGATTTAAGA CCACATAAGT 60CTTTTTTAGT CTTTTTGTTC ACTGGATCTA TTGATAATTA TATTTACTTA TTGACATAAA 120<210> 41<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 41TTGTTCTATT AACTTCTAGA TTGTTAAATC ACTTTGTTCT TATTAATTTA GTTACATTCT 60TATGTTTAGT TTTGTCTAAA ATATAAAAAT ATCTTATTAA TGTTGCGGTA TCCCAGCAAT 120<210> 42<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 42ATTGTTGACT GTCATTTATT TTTTATGCTC TGGACTTCAC TTTACATTTA TTAGTATCTA 60AATCATATGT GTAAATTTAA ATATTTATTT ATCTATTCAG ATAGCCATAG ATTTTAATCG 120<210> 43<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 43CTTAATATCC AGCCAGACGG AAATGAGACC TTACTTTATA ATTTTTAGAT TCTAATGTGT 60TTTATAATTT TCGATATTGG TTTTATTCTA CATATATTTC TATTAACTAT ATTATGTTTT 120<210> 44<211> 120<212> DNA

18

CN 110791552 A

序　列　表

9/14页

<213> 人工序列<400> 44AGTTTCTAAT AGATCGTGTT GGATTCATAT AATTATTAAT ATATTCAATT TTGATTTTTG 60ATTCAATATT TTATCTTAAT TGCTCCTCAG TTTGCTTTTC AACACTTTGA AAATTATGCA 120<210> 45<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 45AATCTCACTT TATTATACCT TTGGTTTCAT ATACTTACTA GATTAGTAAC TGCCAAGTAA 60AGGTTTTATA ATAAATCATT TTTGTTTTTA CTTGAAGGTT ATTTTTTTAG AACTTCTTTA 120<210> 46<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 46CGCGGCGCTG GGGGCGGAGC CGGAGAGGTG CAGGGCCCGG CAGGAGGCAC GGGGCGGGGC 60CGGAGCGCCG GGGGCGGGGC GGGAGGTGCG GCGGCCGACG ACGCTCAGGC CCGGCCCCGC 120<210> 47<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 47AATTCACTCC AAGCTTCAAA GTCACCCACC TGCTCTCCCC AGCAGCCCAA CGCCCACCCG 60TGGGGCTGGC AGTGCCATCT GGCAAGGGCC ATTTCCAGTT CCAGAGAGGG CTGGGTTGGG 120<210> 48<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 48TGCTGACCCC AGACCCTGGC GACGGATCGG AGCTCCTCGG ATTTGGAGTG GATCCTTACA 60AATCCTGCAC ACTAGACAGC AGACACAGGC CCTGCCAGAG CCAGGGACCC GAATTTTTGT 120<210> 49<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 49TTCCTCTTCC CCCGGGGGTA CTCCAGCAGG CACACAAACA CGCCCGCCAC ACTGAAGCCA 60TGTGGTTAAG GAACAGCCCA GCTCAGCCTG AGGGGCCACA GGGAACTCCC TTTACTGAAG 120

19

CN 110791552 A

序　列　表

10/14页

<210> 50<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 50CCTGCTTCCT CCTAGGAATG TGAGGTTTGT CAGGAGATGA GGGGTGGGGC CTGATGTCGT 60CTCCTCGCAG GGGACCTGAG GGACCACTCA GCCTTTCCGG GGCTACCAGG GAGGACACTG 120<210> 51<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 51CCTCAGTGTC AGGCAGCCCT GGTGTTCTGC CCGCACTTGG ATCAAGGAAG TCACCAGGAG 60ACCTGGGCTG TCCCCAGCAG AGTATACAAA GCAACTCTCA GAGGGGATCT GACTGGTGCC 120<210> 52<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 52TTAGATCATC CTTATTCATC AATCAAAGTC TAGTAATTGA GGGCCCAGTA TACTACCTTC 60CATGTGCATA GGCTTTCCCT GTTTCTAAAG AACTTTCATG CACACTGTCA TTGGCTCTT 120<210> 53<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 53GTCTGTTTCT GAGGGAGCCC AGCCTAAGAC AACCTCCAGT ACTTAGCACA GTGCCTGACA 60TATGGTATTG ACTCAGTAGA TATTTGCTGA AAGAATAAAA TACTTTGCAA ATGAAATCCT 120<210> 54<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 54AAATTACTAT AACATTCTTA GTGTTCTGTA TATGTAAAGA AGAATTGCTT GAGCATAATA 60AATTGTTCCG ATCTAGAAAA TTATAGGTTT TAGTCTCTCA TGTTTTCAAA GGGTTATTTT 120<210> 55<211> 120<212> DNA<213> 人工序列

20

CN 110791552 A

序　列　表

11/14页

<400> 55AGCCTCCCGA GTGGCTGGAA TTACAGGTGC CTGCCACCAC GCCTGGCTAA TTTTTGTATT 60TTTAGTAGAG ACGGGGTTTC ACCATGTTGG CCATGGCTGG TCTTGAACTC CTGACCTCAG 120<210> 56<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 56AACTGGGGCT AGCAGGGGTT GGAAATGACC TTGCAAGCTA AAAGAGCAAG GATTGCAGGA 60CATACAGGAG AGATGAATGA GAGGAGAGGA GTCAGAGACT TGTCAAAACT GATAAGGTTT 120<210> 57<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 57GTCATCATTT TCATCCCAAA TGTGTGACTT TTTAAAGAGC CTCTGCTTTT CTTTCTAATC 60TTGCTCAGTA GGCAGGGGCC CCTGTGAGAC AGCTGGTTGA GAATGCTTGG TATGTTTGGA 120<210> 58<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 58TCAACAGATA GGTTTGCTTA TTTTGGAGAT TATATTATAA TATAAACCAG CCAAACTGTT 60AGGGTTGGGA GCAAAACCAG GGCTAGATAC TGCGTGATGA AACCTTGCCA GTGAAATGGC 120<210> 59<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 59CCGCAGCAGG CCCCGGCCTC AGTGAGGATC ACCAAGTGCC ACCAGGCCCC CACAACCCCG 60CTCAGGAGGA GGAAGCAGGC TTCCCTGACC ATCTTTAAAG AAAAGGGGGC ACCATGATGG 120<210> 60<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 60AAAGAAAGTG AAGCTACAAC TAGGAAGGAA GAAGCCTCCC ATTGTGGCTG TTGACCTCCT 60AGAATAAAAC CATCATCATT CTGCCATTGG AATAAGTGGT GGGCAGAGGC GCCAGGCTGC 120<210> 61

21

CN 110791552 A

序　列　表

12/14页

<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 61AGGGGAAAAG GGGTCACCAA ACGCTGCTCC AAGTGACTGG TGAAACCTGA AGACGTCCCT 60CAGACTCAGT CAGTGGGGTC AGTGGGGTTT CGCTGGAGGG AGACAAGTGG ATAGATTTGA 120<210> 62<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 62CACTGCACCC TCCCGCTCCT TCCTGGCACT GGGGAACGTT GGCACCCATC CAGGGGATTG 60CCTGGGTCTC CCTTCTTTAA ACCGTGGGCT CCTCTTGCTC ACCACAGAAC TCTCAGTGCC 120<210> 63<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 63CACCGCAAAA AGTGCAGGGA CAGCCCCTGA GGCTGGACCA TCTGGGCTGA ACCATTGCAA 60ACCTCGGTCC TGCAACACCA AATCCAAAGT GAGCCCAAAT CCCCAGGGGA AACTCTCGGA 120<210> <211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> CAGGCACTAT CCTAGGCATT TTGTGCACAA AAACCCTCTA CAGAGATTTT ATCCCAACCG 60TACAGATGGG AAAAATGAGC TCAGAGGGGT TAAGTGACTT GCTTAATGCC ACACAGTTAC 120<210> 65<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 65ATTTTATCCC AACCGTACAG ATGGGAAAAA TGAGCTCAGA GGGGTTAAGT GACTTGCTTA 60ATGCCACACA GTTACTAAGA GATGGTACAG GGATTCAAAG CCTGATCCGT TGGCCCCAAA 120<210> 66<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 66

22

CN 110791552 A

序　列　表

13/14页

TAAGACAATC CAATGTCAAC TCATTCACAA TCAATTAAAG AAAATAGACA AAAAACATTA 60ACAATGAGCT GTAAACCACG AAGATAAGCA CGTACTTTCA ATTAGAAAAA TGTGTTTTCA 120<210> 67<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 67CTTTTATTTC GATTTTTTGT ATTATTCCTA ATCTGCTAAA TATTTAAAAT ATTAGATTTA 60GTTGACCTTT TTCTTAGTAA GGATCTTCAA TATATTACTA TAGGACTGTT TAGTACTCAA 120<210> 68<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 68TTAATATTAT TTTACTTTTA TAGAGTATAT AGAAGTTCCT ATTTGCAGGC TTAATATTGA 60TCCATTGATA ATCTTAAATT TTGTTTCTAC CCTTACGAAT TATATAGTGT TTTCTATCTA 120<210> 69<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 69AGCAGAACAT ACTTTTTCTT TTTTAAAAGT AAGCCGGTCA GCATTTTTTT TGATATTTAT 60TTCAATTTCA ATTAAACAGT TTTTAATTGT AACTCAGTAG TATCTTATTT ATTATTCTGT 120<210> 70<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 70ATGCTAATTT ATCATTATGT ATACTAGTTG TTTATTAGTT AGAATTTATA TTAGTCTAAA 60ATTCTGTAGT TACTCTATAT TTATTCTATA GCCATGATCT CCAATTTCAT TATAGTCTGT 120<210> 71<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 71TTATGATCGG AAATTACTTT TGTGTTTAAG ATTACTTTGT AACGATTTTA TTATCGATTA 60TAACGTAATT CTATTACTTC TTTTAAACTC ATTAATATTT ATCGAAGTCC ATCTGTTATT 120<210> 72<211> 120

23

CN 110791552 A

序　列　表

14/14页

<212> DNA<213> 人工序列<400> 72ATCTTACTAT TATTAGAAGA CTCTGATACT GACGTTTCTG TATTATTATT TAATATCTTT 60AATCAGATTA ATGCTATATG TTGTTCTTCT CGTTATATCA ACTGTTTTAA AGTTATTAAT 120<210> 73<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 73TAAATAAAGT AGTAGAGACT GCCTCATTTA TAACGTCACG TACCTCTATT TATTGTTATT 60ACTATCTATT ACTTTCTTAT TGATATATAT TATTATAATA TTTTTCTTTT GATTGTGTGA 120<210> 74<211> 120<212> DNA<213> 人工序列<400> 74GTTCTTTCTG ACTCTAAAGA ATAGTTTCTT ATTTGTTATC TGAAAGACAT ACTTTGTATA 60TTTATTGTTT TAATCTCATT AAGAATATAT TTTTTGTCTA GGTTCTAAAT CCAATTTACA 120

24