用于预防和逆转哺乳动物体内动脉粥样硬化的方法[发明专利]

[12]发明专利申请公开说明书

[21]申请号99814639.0

[51]Int.CI7

A61K 35/14

[43]公开日2002年1月9日[22]申请日99.11.15

[21]申请号99814639.0

[11]公开号CN 1330549A

[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标

事务所

代理人周中琦

[30]优先权

[32]1998.11.13 [33]US [31]09/190,236[32]1999.05.06 [33]US [31]09/304,262[86]国际申请PCT/CA99/01092 1999.11.15[87]国际公布WO00/29003 EN 2000.05.25[85]进入国家阶段日期

2001.06.18

[71]申请人瓦索根爱尔兰有限公司

地址爱尔兰克莱尔[72]发明人D·J·斯图尔德

权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 4 页

[54]发明名称

用于预防和逆转哺乳动物体内动脉粥样硬化的方法[57]摘要

本发明涉及一种预防哺乳动物动脉粥样硬化发展并使其消退的方法,该方法包括下列步骤:(a)用至少一种选自体温以上或体温以下的温度、电磁放射和氧化环境组成的组的应激子处理哺乳动物离体的血液的等份部分;和(b)对所述哺乳动物给予步骤(a)中经处理的血液的等份部分,其中所述的等份部分具有足以使哺乳动物体内存在的动脉粥样硬化损害消退的体积。

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权 利 要 求 书

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1.一种使哺乳动物体内的动脉粥样硬化消退的方法，该方法包括下列步骤：

(a)用至少一种选自体温以上或体温以下的温度、电磁放射和氧化环境组成的组的应激子离体处理哺乳动物的血液的等份部分；和 (b)对该哺乳动物给予步骤(a)中处理的血液的等份部分，其中所述的等份部分具有足以使哺乳动物体内存在的动脉粥样硬化损害消退的体积。

2.权利要求1的方法，其中所述的氧化环境包括对所述的等份部分施用氧化剂。

3.权利要求2的方法，其中所述的氧化剂含有臭氧气体并将该臭氧气体以不产生过量程度的诱变性的量导入血液的等份部分。 4.权利要求2的方法，其中所述的氧化剂包括臭氧气体和医药用级氧气的混合物，所述的臭氧气体在该混合物中所含的浓度高达约300μg/ml。

5.权利要求4的方法，其中所述混合物中含有的臭氧气体浓度高达约30μg/ml。

6.权利要求1的方法，其中以高达约0.33升/分钟的流速将所述混合物施用于所述等份部分。

7.权利要求1的方法，其中所述的电磁放射包括具有一种或多种UV-C带波长的紫外光。

8.权利要求1的方法，其中将所述等份部分冷却或加热至的温度是不会导致等份部分中的血液明显溶血的温度。

9.权利要求1的方法，其中使用所述的温度应激子以使至少部分等份部分的温度在约-5℃-约55℃的范围。

10.权利要求1的方法，其中所述的等份部分中血液的平均温度在约37℃-约44℃的范围。

11.权利要求1的方法，其中所述的等份部分中血液的平均温度在

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约0℃-约36.5℃的范围。

12.权利要求1的方法，其中所述的等份部分中血液的平均温度在约10℃-约30℃的范围。

13.权利要求1的方法，其中所述的温度在约37℃-约55℃的范围。 14.权利要求13的方法，其中所述的温度为42.5±1℃。 15.权利要求1的方法，其中所述的等份部分的体积高达约400ml。 16.权利要求15的方法，其中所述的等份部分的体积约为10ml。 17.权利要求1的方法，其中使所述的等份部分经受应激子高达约60分钟的期限。

18.权利要求17的方法，其中使所述的等份部分经受应激子约3分钟的期限。

19.权利要求1的方法，其中通过适合于接种的方法对哺乳动物给予血液，所述的方法选自动脉内注射、肌内注射、静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射和口腔、鼻部或直肠给药。

20.权利要求1的方法，其中将所有应激子同时施用于所述等份部分。

21.权利要求1的方法，其中将所述应激子中的任意两种同时施用于所述等份部分。

22.权利要求1的方法，其中通过从与步骤(b)中给予经处理的血液的同一哺乳动物体内取出血液而提供步骤(a)中处理的血液。 23.一种增加哺乳动物体内存在的动脉粥样硬化损害的斑块稳定性的方法，该方法包括下列步骤：

(a)用至少一种选自体温以上或体温以下的温度、电磁放射和氧化环境组成的组的应激子离体处理哺乳动物血液的等份部分；和 (b)对所述哺乳动物给予步骤(a)中经处理的血液的等份部分，其中所述的等份部分具有足以使血管内存在的单核细胞/巨噬细胞的数量明显减少的体积。

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说 明 书

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用于预防和逆转哺乳动物体内动脉粥样硬化的方法

发明领域

本发明涉及血液的处理方法并涉及与某些哺乳动物异常生理状态和疾病情况相关的经处理、改进的血液的用途。更具体地说，本发明涉及改进的哺乳动物血液及其在治疗与之相关的或由它导致的动脉粥样硬化和心血管疾病中的用途。 发明背景

在血管壁上形成脂肪斑块沉积的动脉粥样硬化是大多数类型心血管疾病的原因。导致动脉粥样硬化发病率和死亡率的主要机理是产生可使血管明显阻塞的动脉粥样硬化斑块而更重要的是在该部位形成可导致心脏病发作和大多数中风的血栓。

动脉粥样硬化的发病机理是复杂的且与许多包括血脂过多、高血压、肥胖症、吸烟、糖尿病和紧张在内的危害因素有关。诸如血胆固醇过多和血清甘油三酯水平升高这样的血脂过多是最有可能导致动脉粥样硬化的危害因素。例如，认为与低密度脂蛋白(LDL)、中密度脂蛋白(IDL)或极低密度脂蛋白(VLDL)结合的血清胆固醇水平升高与人体内的动脉粥样硬化的发生率极为相关。同样，低浓度的高密度脂蛋白(HDL)是公知的动脉粥样硬化危害因素。特别地，认为LDL、IDL和VLDL胆固醇形式的胆固醇循环水平越高和诸如甘油三酯类这样的其它脂类的循环水平越高，则胆固醇和脂类更可能沉积在血管壁上并导致或产生动脉粥样硬化。然而，重要的是应注意50％以下的心脏病发作患者具有血脂浓度升高，从中可以推断包括血管内皮功能障碍在内的其它因素在动脉粥样硬化的发病机理中是重要的。

认为与这些危害因素接触可以导致排列在血管壁上的内皮细胞发生局部损害。内皮细胞接触损伤通过上调粘附分子变成粘性的，这导

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致白细胞发生粘附并通过内皮迁移至组织，这一过程伴随有释放炎症细胞因子和其它炎症介体，它们导致内皮功能进一步发生障碍，从而使内皮更易透过脂类颗粒。认为该过程可逐步在血管壁内形成斑块沉积，从而导致血管腔狭窄、血流异常和血栓形成。

目前动脉粥样硬化的疗法主要由包括改善危害因素在内的生活类型的改变、饮食(低脂肪)和降脂药组成，已经证实在脂类含量过高和正常患者中它们均可明显降低心血管和脑血管疾病的发生率。同样，已经证实这些疗法会延缓动脉粥样硬化发展并使斑块消退至一定程度。然而，显然需要直接以改善内皮功能和/或抑制导致同样或更可能发生疾病的炎症过程为目标的进一步确定的疗法。

另外重要的是应注意以斑块的结构和脂类含量以及内皮细胞功能质量为基础的斑块的稳定性是决定通常依次导致组织梗死的血栓形成倾向的关键因素。因此，除降脂药外，改善内皮细胞功能的疗法不仅抑制动脉粥样硬化的发展并使其消退，而且还可降低心血管疾病的比例。

发明概括

本发明通过提供一种用于预防动脉粥样硬化并使其消退的方法而克服了目前公知用于治疗心血管疾病、特别是动脉粥样硬化的疗法中的至少某些上述和其它缺陷，在所述的方法中，将哺乳动物血液的等份部分进行离体处理且随后导入哺乳动物受试者的体内。 通过经受一种或多种已经发现可改善血液的应激子来处理血液的等份部分。根据本发明，通过使血液或经分离的血液的细胞或非细胞级分，或经分离的血液的细胞和/或非细胞级分的混合物同时或依次经受选自温度应激子、电磁放射和氧化环境或这类应激子的任意组合的应激子可以改进血液的等份部分。

当将本发明的改进血液或血液成分导入哺乳动物受试者体内时，所观察到的它们的作用有几种。首先，与未经治疗的受试者相比，按照本发明治疗的哺乳动物受试者显著表现出由血管壁内脂类沉积减少

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所反映的斑块的生成减少。除阻止斑块的沉积发展外，已经证实本发明的疗法还可使现存的斑块消退。特别地，已经在用本发明方法治疗的受试者体内观察到斑快沉积的减少高达75％。

第二方面，在某些实验中已经观察到了主要因LDL和VLDL胆固醇水平的下降所导致的总血清胆固醇水平的降低。有益的HDL胆固醇水平没有降低。与接受未经处理的血液作为安慰剂的受试者相比，观察到胆固醇水平的降低约高达40％。第三方面，还观察到了血清甘油三酯类水平的下降。期望这类血清胆固醇和甘油三酯类的下降会延缓因血脂过多所导致的动脉粥样硬化的发作并阻止其发展。

相信本发明治疗方法的有益作用涉及对内皮的一种或多种直接作用，从而使其对脂类沉积产生更高的抗性或减少对氧化脂类的炎症反映。当按照本发明治疗受试者时，并不总是观察到的脂类水平下降仍然在缓解动脉粥样硬化中起作用。

申请人相信按照本发明方法改进的血液或血液成分在导入受试者体内时具有下调涉及动脉粥样硬化的炎症免疫反应的作用。特别地，中请人相信按照本发明改进的血液下调造成分泌诸如IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ和IFN-α这样的炎症细胞因子的存在于血液中的T细胞的TH1成分的活性，和/或上调造成分泌例如IL-10和IL-4这样的抗炎细胞因子的T细胞的TH-2成分。另外认为本发明的治疗方法可以使循环白细胞的激活状态受到抑制、内皮粘性降低或两者兼而有之，由此减少内皮损伤。此外，认为本发明的方法通过下调炎症免疫反应而具有使动脉粥样硬化斑块稳定的作用，预计这样会减少血栓形成的发生率。

尽管上述机理可以解释本发明的治疗方法如何影响动脉粥样硬化，但是它并不能完全解释本发明治疗方法使存在的沉积斑块块明显消退的观察结果。

因此，在一个方面中，本发明提供了一种预防哺乳动物体内动脉粥样硬化发展并使其消退的方法，该方法包括下列步骤：(a)用至少一种选自体温以上或体温以下的温度、电磁放射和氧化环境组成的组

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的应激子离体处理哺乳动物的血液的等份部分；和(b)对所述哺乳动物给予步骤(a)中处理的血液的等份部分，其中所述的等份部分具有足以使哺乳动物体内存在的动脉粥样硬化损害消退的体积。 在另一个方面中，本发明提供了一种增加哺乳动物体内存在的动脉粥样硬化损害中斑块的稳定性的方法，该方法包括下列步骤：(a)用至少一种选自体温以上或体温以下的温度、电磁放射和氧化环境组成的组的应激子离体处理哺乳动物血液的等份部分；和(b)对所述哺乳动物给予步骤(a)中处理的血液的等份部分，其中所述的等份部分具有足以使血管内存在的单核细胞/巨噬细胞的数量明显减少的体积。

附图简述

现在仅通过举例并参照附图来更完整地描述本发明，其中： 附图1包括获自经受实施例1中所述研究的LDL受体缺乏小鼠的两条全长主动脉的照片，标记为1的主动脉获自接受高胆固醇饮食和假拟疗法的动物，而标记为2的主动脉获自接受高胆固醇饮食并按照本发明的优选方法治疗的动物，通过用油红O将主动脉染色可以观察到主动脉脂类的沉积情况；且

附图2-4包括获自经受实施例1中所述研究的LDL受体缺乏小鼠的主动脉横截面的照片；附图2中所示的主动脉获自接受正常饮食的动物，附图3的主动脉获自接受高胆固醇饮食和假拟疗法的动物，而附图4的主动脉获自接受高胆固醇饮食并按照本发明的优选方法治疗的动物，通过对所述主动脉进行免疫染色可以观察到主动脉斑块沉积物中存在巨噬细胞。

优选实施方案的详细描述

按照本发明的优选方法，从哺乳动物受试者、优选人体内提取血液的等份部分并将血液的等份部分用一定的应激子按照下面具体的描述进行离体处理。本文所用的术语等份部分”、“液的等份部分”

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或类似术语包括全血、包括血小板在内的分离的血细胞级分、包括血浆在内的分离的非血细胞级分及其混合物。所述应激子的作用在于改进包含在等份部分中的血液和/或其细胞或非细胞级分。然后通过适合于疫苗接种的任意方法将改进的血样重新导入受试者体内，所述方法优选自动脉内注射、肌内注射、静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射和口腔、鼻部或直肠给药。

按照本发明方法与血液的等份部分离体经受的应激子选自温度应激(体温以上或体温以下的血液温度)、氧化环境和电磁放射，可以以单独形式或任意组合形式、可同时接触或依次经受它们。在人体受试者中，合适的等份部分具有足够的体积，该体积可在重新导入受试者体内时在受试者体内实现血清脂类水平降低、延缓动脉粥样硬化斑块形成的发展或使其消退和/或增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。优选等份部分的体积达约400ml、优选约0.1-约100ml、更优选约5-约15ml、甚至更优选约8-约12ml且最优选约10ml。

根据本发明，优选在处理过程中对血样同时施用上述所有三种应激子以便确保血液受到合适的改进。另外，在本发明的某些实施方案中，优选施用上述应激子中的任意两种，例如施用温度应激子和氧化应激子、温度应激子和电磁放射应激子或电磁放射应激子和氧化应激子。必须谨慎使用适当程度的应激子以便由此有效改进血液而使受试者体内的动脉粥样硬化斑块明显减少或使受试者体内的动脉粥样硬化斑块稳定。

温度应激子使得经处理的等份部分温至正常体温以上或使等份部分冷却至正常体温以下。将该温度进行选择以使温度应激子不会使等份部分中包含的血液过量溶血且在将经处理的血样注入受试者体内时实现脂类减少和/或延缓动脉粥样硬化斑块形成的发展或使其消退。优选施用温度应激子以使全部或部分等份部分的温度高达到约55℃、且更优选约-5℃-约55℃的范围。

在本发明的某些优选的实施方案中，将等份部分的温度升高至正常体温以上，使得等份部分的平均温度不超过约55℃、更优选约40

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℃-约50℃、甚至更优选约40℃-约44℃且最优选约42.5±1℃。 在其它优选的实施方案中，将等份部分冷却至正常体温以下，使得等份部分的平均温度在约-5℃-约36.5℃、甚至更优选约10℃-约30℃且甚至更优选约15℃-约25℃的范围。

可以对等份部分施用固体、液体或气体氧化剂这样的氧化环境应激子。优选地，该过程包括最优选通过使等份部分鼓泡而使等份部分与医药用级氧和臭氧气体的混合物在上述温度范围内接触的步骤，在药用级氧气的气流中含有臭氧作为次要成分。优选将气流中臭氧含量和气流的流速进行选择以使导入血液等份部分的臭氧量不会因其自身或与其它应激子联用产生对细胞的过度损害而使所提供的疗法无效。合适的气流臭氧含量高达约300μg/ml、优选约达100μg/ml、更优选约为30μg/ml、甚至更优选约达20μg/ml、特别优选约10μg/ml-约20μg/ml且最优选约为14.5±1.0μg/ml。以约2.0升/分钟、优选约达0.5升/分钟、更优选约达0.4升/分钟、甚至更优选约达0.33升/分钟且最优选约0.24±0.024升/分钟的速率为等份部分适当提供气流。气流流速的下限值优选不低于0.01升/分钟、更优选不低于0.1升/分钟且甚至更优选不低于0.2升/分钟。

通过在来自电磁放射源的处理条件下照射等份部分来适当提供电磁放射应激子，同时将等份部分维持在上述温度下且同时使氧/臭氧气体混合物鼓泡经过等份部分。优选的电磁放射选自光子照射、更优选UV、可见光和红外光且甚至更优选UV光。最优选的UV源是主要发射UV-C带波长、即比约280nm短的波长的UV灯。这类灯可以发射一定量的可见光和红外光。还可以使用相当于标准UV-A(来自约315-约400nm的波长)和UV-B(来自约280-约315nm的波长)源的紫外光。例如，有利的是可以使用与上述温度和氧化环境应激子一起施用的合适剂量的这类UV光，它可以获自围绕装有等份部分的样品容器周围排列的八盏灯，以一定的强度使其向血液表面上输送约0.025-约10焦耳/cm、优选约0.1-约3.0焦耳/cm的总UV光能。优选使用4盏这类灯。

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使等份部分经受应激子的时间通常在约高达60分钟的时间范围。该时间在一定程度上取决于选择的电磁放射强度、温度、氧化剂浓度和给等份部分提供的速率。一旦设定了其它应激子的程度，那么确定最佳次数的某些实验对部分操作者来说是必不可少的。在大部分应激子条件下，优选的时间范围约为2-约5分钟、更优选约为3分钟。起始的血液温度和可以温至或冷却至预定温度的速率倾向于随受试者的不同而改变。这类处理方法提供了易于注入受试者体内的改进的血液等份部分。

在实施本发明优选方法的过程中，可以应用Mueller的美国专利号4,968,483中所述类型的装置、使用所述应激子来处理血液的等份部分。将等份部分置于合适的无菌UV光传输容器内，该容器固定在所述仪器上。在使气流通过等份部分产生氧化性应激前将UV灯开启固定的期限，从而使UV灯的输出保持稳定。一般将UV灯开启，同时将等份部分的温度调节至预定值，例如42.5±1℃。然后如上所述使公知组成和受控速率的氧/臭氧气体混合物与等份部分接触预定的期限约达60分钟、优选2-5分钟且最优选约3分钟，使得等份部分同时接触所有三种应激子。在这种方式中，按照本发明适当改进血液以便获得所需的作用。

优选受试者进行取血液的等份部分、如上所述的处理和对受试者重新给予经处理的血液的治疗过程。这类治疗过程可以包括使每日治疗持续许多连续天数的过程或可以包括使每日治疗持续设定的时间期限的第一个过程、随后的间隔过程和然后的一次或多次的每日治疗过程。在一个优选的实施方案中，各治疗过程包括每日给予4-6次治疗。在另一个优选的实施方案中，优选的剂量方案包括给予2-4次经处理的血液，其中给予任意对的连续等份部分连续的天数或被1-21天的休息期限隔开，在该期限时不将等份部分给予患者，分隔一对选择的连续等份部分的休息期限约为3-15天。一种更特殊的优选的剂量方案总计三份等份部分，将第一份和第二份等份部分给予连续天数，而在第二份与第三份等份部分之间休息11天的期限。优选将连续治疗过

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程分成至少约三周的期限，在此过程中不对受试者给予经处理的血液。连续治疗过程之间的间隔应使本发明治疗方法的正面作用得到维持。类似地，治疗过程中的次数应使治疗作用得到维持并可以以所观察到的各受试者的反应为基础来决定治疗次数。

参照下列特定实施例来进一步解释和描述本发明。 实施例1-动物研究模型：

本实验的目的是测定本发明治疗方法对LDL受体(LDL-R)缺乏小鼠模型、即一种广泛使用的由靶向破坏LDL受体生成的转基因动脉粥样硬化模型的动脉粥样硬化发展的作用。这种动物模型类似于家族性血胆固醇过多，这是一种突变导致完全缺乏功能性LDL-R的遗传性疾病。在人体疾病中，纯合型个体表现出血清胆固醇明显升高而发展成严重的早熟型动脉粥样硬化，从而通常死于这种疾病的早期。在患有这种疾病的患者中，目前使用的降脂药就其降低胆固醇水平来说不具有显著作用。

LDL-R缺乏小鼠模型表现出不耐受胆固醇饲喂并发展成广泛的动脉粥样硬化改变，这种改变发展成使纤维性损害成熟而在形态上不同于以确立的人体动脉粥样硬化。除倾向于发展成动脉粥样硬化的确定遗传异常外，在饲喂胆固醇后，这种模型具有在6-8周内快速发展成广泛动脉粥样硬化的优势。方案：

LDL-R缺乏小鼠商购自Jackson Laboratories。使总计22只22周龄的小鼠参与本研究且15只小鼠完成了本研究。研究期限为8周。将小鼠维持在可自由摄食和饮水的12小时黑暗/12小时光照循环的环境中并如下饲喂特定的饮食。对照组由5只动物组成，所有接受正常饮食的动物均完成了本研究。给包括15只动物的高胆固醇组饲喂含有1.25％胆固醇、7.5％可可脂、7.5％酪蛋白和0.5％胆酸钠的饮食，其中10只动物完成了本研究。为了确保适当的摄食，以每周为基础监

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测食物消耗量和动物体重。在预实验中，证实用高胆固醇饮食饲喂8周基本上导致动脉粥样硬化发生、特别是在主动脉弓和胸廓降主动脉中。治疗方法：

随机选择10只饲喂高胆固醇的动物进行本发明优选方法的治疗过程。经治疗的动物中有6只完成了本研究。注意在本组中死亡的4只动物与本治疗方法没有如何关系，而是发生在本研究的早期，这是本研究过程中彼此寄居动物之间的嘶咬所造成的结果。其它5只使用高胆固醇饮食的动物进行假拟疗法过程且4只在本方案中存活。 本治疗方法在本研究开始后4周开始，使用高胆固醇饮食的各动物接受总计10次治疗(每天注射1次、持续5天的2个疗程；间隔2天的2个疗程、即12天内注射10次)。对经本发明方法治疗的动物给予的各次治疗由从以正常饮食饲喂的遗传适合性供体动物中取10ml血液、使收集的血液进入柠檬酸钠抗凝血药中的步骤组成。为了采集各10ml血液的等份部分，从10只动物中的每一只中提取约1ml血液。通过心脏穿刺提取血液，在取血过程中用甲苯噻嗪/使动物全麻并在取血后立即给予T-61。将血液的等份部分转入一次性低密度聚乙烯离体处理用无菌管中，且然后使用Mueller等的美国专利号4,968,483中一般描述的仪器在升温条件下同时用氧/臭氧气体混合物和紫外光对其进行处理。

气体混合物的组成是14.5±1.0μg臭氧/ml，该混合物中剩余的部分包括药用级氧气。以240±24ml/分钟的速率使该气体混合物通过血液的等份部分发泡3分钟的期限。将该等份部分的温度稳定保持在42.5±1.0℃。UV光在UV-C带内并包括253.7nm波长。

在通过本发明优选方法处理后，将30μl经处理的血液重新经肌内注入进行本发明治疗的各动物体内。

在假拟疗法中，将30μl未经处理的血液经肌内注入剩余的5只使用高胆固醇饮食的动物体内。动脉粥样硬化评价：

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在处死动物时，用甲苯噻嗪/将动物麻醉并暴露心脏。在切开腔静脉后获得血样，通过心室穿刺灌注动物，第一次灌注PBS至流出血液且然后灌注10％中性缓冲3分钟至固定主动脉。从胸腔整体中分离出胸廓主动脉并储存在4℃下的10％中。将压力固定(10％)的主动脉整体取出并打开以使纵向全长倒置。然后将主动脉内部暴露的部分固定在玻璃载玻片上并用油红O染色。接着使用计算机辅助的系统测定系统对亮红色染色部分(表示脂类沉积)进行定性并将其表示为动脉粥样硬化指数(动脉粥样硬化与正常主动脉表面积之比)。血浆脂类和脂蛋白分析：

通过使用Superose 6B柱进行的快速液相层析来获得脂蛋白分布。使来自各动物的不含血小板的200μl血浆等份部分上该柱并用TSE缓冲液以0.35ml/分钟的恒定速率洗脱。将来自各级分的80μl等份部分用于测定不含酯化胆固醇的总胆固醇。通过多伦多St.Michael医院脂类研究组确定的酶法来测定11只有代表性动物的血样和柱级分中的总胆固醇和甘油三酯类。统计学分析：

将连续的变量报导为平均值±SD。通过斯氏t检验来检测各组中胆固醇水平与甘油三酯水平之间的差异。使用一步ANOVA检验并结合Bonferroni校正来检测各组中动脉粥样硬化损害之间的差异。结果：

附图1解释了为检测主动脉内脂类沉积和斑块形成而用油红O染色的两条全长主动脉。接受高胆固醇饮食和假拟疗法的动物主要表现出主动脉脂类沉积(附图1中的主动脉)，其中动脉粥样硬化面积(AA)与总面积(TA)之比为0.16±0.1。比较而言，那些用本发明优选方法治疗的动物表现出主动脉脂类沉积程度深刻地下降(附图1中的主动脉2)，其中从/TA为0.04±0.02。这些比例具有显著性差异、p＜0.05。在接受正常饮食的动物中，没有观察到明显的动脉粥样硬化改变。 此外，观察到按照本发明优选方法治疗的动物比接受高胆固醇饮

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食而未经治疗的动物具有更好的正常外观、皮肤黄瘤病减少(睑、鼻和爪)、肢体肿胀降低和更好的食欲。

为了进一步解释本发明方法的作用，对获自本实施例中动物的主动脉部分进行MOMA-2免疫染色，它是一种炎症单核细胞/巨噬细胞的标记。在附图2(正常饮食)、3(HC饮食-未经治疗)和4(HC饮食-经治疗)中解释了这些结果。在附图2中没有观察到染色。在附图3和4中可以观察到染色，这表明接受高胆固醇饮食动物新生内膜中的大部分细胞是单核细胞/巨噬细胞。然而，正如将附图3和4进行比较后观察到的，已经用本发明方法治疗的动物表现出沉积斑块的数量明显减少且由此还证实了单核细胞/巨噬细胞的总数下降。这表明经治疗的斑块的炎症反应比对照组动物下降。此外，认为存在于所述斑块中的炎症细胞主要导致斑块的不稳定性，认为这是血栓形成的主要原因。预计由本发明方法产生的斑块稳定性的提高将使心血管疾病的比例相应降低。

不同组动物中胆固醇水平的测定值显示在接受正常饮食的动物中血清总胆固醇水平没有明显改变，而接受高胆固醇饮食的动物中血清总胆固醇水平明显升高。这种明显升高发生在假拟治疗组中并在接受本发明优选方法治疗的组中发生的程度较低。

在接受高胆固醇饮食的动物中经测定的甘油三酯水平也高于接受正常饮食的动物。然而，在接受高胆固醇饮食的动物中，在假拟治疗组中甘油三酯水平的升高远大于按照本发明优选方法治疗的组。 各组的经测定的胆固醇(总和HDL)和甘油三酯水平以及平均胆固醇和甘油三酯水平如下列表1中所示。

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               表1

组

动物

总胆固醇

(mM)13.013.216.214.914.3±1.54.45.25.75.1±0.727.526.623.424.625.5±1.9

HDL胆固醇(mM)0.840.810.1.100.91±0.131.021.091.441.18±0.230.870.900.781.230.95±0.20

甘油三酯类(mM)0.300.340.350.400.35±0.040.340.400.440.39±0.050.700.720.600.0.66±0.05

治疗组治疗组治疗组治疗组

1234

平均值(1-4)

对照组对照组对照组

678

平均值(6-8)

HC饮食HC饮食HC饮食HC饮食

11121314

平均值(11-14)

在表1中，“治疗”组动物接受高胆固醇饮食并按照本发明优选方法治疗，对照”组动物接受正常饮食且未经治疗，而HC饮食”动物接受高胆固醇饮食和假拟治疗。 实施例2-人体研究

在动物研究中观察到的甘油三酯水平降低与在2组人体研究中获得的结果一致，该研究结果如下所述。人体研究A

总计94位健康人体志愿者，其中57位是男性且37位是女性，在2周期限内对他们给予本发明优选方法的6次治疗过程。在疗程前和疗程后测定血清甘油三酯水平并将平均测定值列在下面的表2中。

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               表2

治疗前甘油三酯水平(mg/dl)146

治疗后甘油三酯水平(mg/dl)134

显著性(p)

0.04

人体研究B

对总计49位来自有家族史的患者给予本发明优选方法的各种治疗方案。该疗法包括给每位患者注射5-40次。在疗程前和疗程后测定各位患者的血清甘油三酯水平并将平均测定值列在下面的表3中。                    表2治疗前甘油三酯水平(mg/dl)135.4

治疗后甘油三酯水平(mg/dl)121.9

显著性(p)

＜0.05

从上述人体研究中可以推断出按照本发明优选方法治疗可以使人体受试者中的血清总甘油三酯水平明显降低。 实施例3-动物研究

在本研究中，使用下列方案将LDL-R缺乏小鼠分成组并研究：A组(对照组)-如实施例1中所述饲喂正常饮食；B1组-如实施例1中所述饲喂高胆固醇饮食8周；B2组-如实施例1中所述饲喂高胆固醇饮食12周；

C1组-如实施例1中所述饲喂高胆固醇饮食8周并如实施例1中所述通过本发明优选方法以4周的饮食干预进行治疗；和

C2组-如实施例1中所述饲喂高胆固醇饮食12周并如实施例1中所述通过本发明优选方法以8周的饮食干预进行治疗。

就各组动物而言，按照实施例1中所述的方法在“动脉粥样硬化

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评价”主题下评价8或12周时动脉粥样硬化指数。正如动脉粥样硬化面积测定值所证明的，B组动物(单独使用高胆固醇饮食)主要表现出主动脉脂类沉积，B1组动物具有的动脉粥样硬化指数在8周时为0.16±0.1，而B2组动物具有的动脉粥样硬化指数在12周饮食干预时为0.17±0.1。相反，C组动物(高胆固醇饮食并用本发明方法治疗)表现出脂类沉积明显下降，C1组动物具有的动脉粥样硬化指数在8周饮食干预时为0.04±0.02，而C2组动物具有的动脉粥样硬化指数在12周饮食干预时为0.04±0.02(p＜0.01)。

与B组动物相比，C组动物还表现出黄瘤病和肢体肿胀明显减少。 如实施例1中所述、通过快速液相层析和酶联检测试验来测定总脂蛋白分布。这种分析结果表明B组动物(单独使用高胆固醇饮食)具有的总血清胆固醇水平(CHO46.71±3.61mM)比对照组A(CHO5.1±0.7mM)明显升高。与B组动物相比，C组动物没有表现出胆固醇的明显降低(CHO44.7±2.8mM；B与C相比p＝0.27)。 正如上述实施例中所证实的，本发明的治疗方法明显抑制了人体家族性血胆固醇过多的小鼠模型中动脉粥样硬化的发展。除在早期明显减少动脉粥样硬化的生成和抑制已生成的动脉粥样硬化损伤外，证实按照本发明优选方法治疗还使存在的动脉粥样硬化损害消退。例如，这可以通过将实施例3中的B1和C2亚组动物结果进行比较而观察到，它表明：当在第8周按照本发明治疗时，8周高胆固醇饮食存在的斑块沉积减少了约75％。这些心血管健康的改善伴随有动物一般总体外观和食欲的改善。

如上所述，动脉粥样硬化中具有明显的免疫调制炎症成分。因此，认为本发明方法预防和治疗动脉粥样硬化的能力至少部分是因其抗炎作用且特别是使经治疗的受试者血液中TH2细胞增加和/或TH1细胞减少的能力所导致的。

尽管已经参照特定优选的实施方案描述了本发明，但是能够理解可以对其进行许多改变而不会脱离本发明的实质或范围。所有这类修改均包括在下列权利要求的范围内。

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说 明 书 附 图

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图1

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99814639.0说 明 书 附 图 第2/4页

图2

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图3

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99814639.0说 明 书 附 图 第4/4页

图4

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