miR-581对结直肠癌细胞增殖与侵袭的影响及机制

ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞增殖与侵袭的影响及机制

张红ꎬ冯继红ꎬ丁婷婷ꎬ泮红飞ꎬ罗军敏(遵义医学院附属医院ꎬ贵州遵义５６３００３)

　　摘要:目的　探究ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞增殖与侵袭的影响及机制ꎮ方法　取处于对数生长期的结肠癌细胞株ＳＷ６２０、ＬＯＶＯ、ＨＴ２９和正常结直肠细胞株ＦＨＣꎬ将细胞分为实验组和对照组ꎬ实验组加入ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓꎬ对照组加入ｖｅｃｔｏｒꎻ采用ｑＲＴ￣ＰＣＲ法检测不同结直肠癌细胞株ＳＷ６２０、ＬＯＶＯ、ＨＴ２９和正常结直肠细胞株ＦＨＣ中ｍｉＲ￣５８１的表达ꎻＣＣＫ￣８、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验分别检测ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ组和对照组结直肠癌细胞ＳＷ６２０增殖和侵袭能力法检测ｍｉＲ￣５８１对ＳＷ６２０细胞中ＰＲＤＸ１表达的影响ꎮ将ＳＷ６２０细胞分为两组ꎬｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ组转染ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓꎬｍｉＲ￣５８１＋ＰＲＤＸ组将ＰＲＤＸ１质粒与ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ共转染ꎬＣＣＫ￣８、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测ＰＲＤＸ１干预后ｍｉＲ￣５８１对ＳＷ６２０增殖和侵袭能力的影响ꎮ结果　

与结直肠癌细胞株ＬＯＶＯ、ＨＴ２９相比ꎬｍｉＲ￣５８１在高侵袭性

细胞株ＳＷ６２０中表达最低ꎻＳＷ６２０细胞转染ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ后ꎬ实验组细胞增殖能力和侵袭能力低于对照组(Ｐ均能力低于ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ组(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论　向ＰＲＤＸ１有关ꎮ

　　关键词:结直肠癌ꎻ微小ＲＮＡ￣５８１ꎻ过氧化物氧化还原酶蛋白１ꎻ细胞增殖ꎻ细胞侵袭　　ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０１８.２５.０１０

　　中图分类号:Ｒ７３５.３５　　文献标志码:Ａ　　文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０１８)２５￣００３５￣０４

<０.０５)ꎮｍｉＲ￣５８１能与ＰＲＤＸ１３′ＵＴＲ特异性结合ꎬ抑制ＰＲＤＸ１蛋白表达ꎻｍｉＲ￣５８１＋ＰＲＤＸ１组细胞的增殖和侵袭

ｍｉＲ￣５８１可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭ꎬ其机制可能与靶

的变化ꎻ荧光素酶报告基因验证ｍｉＲ￣５８１与过氧化物氧化还原酶蛋白１(ＰＲＤＸ１)的相互作用关系ꎻＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲ￣５８１ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＨｏｎｇꎬＦＥＮＧＪｉｈｏｎｇꎬＤＩＮＧＴｉｎｇｔｉｎｇꎬＰＡＮＨｏｎｇｆｅｉꎬＬＵＯＪｕｎｍｉｎ(ＴｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＺｕｎｙｉ５６３００３ꎬＣｈｉｎａ)

ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ　

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｉＲ￣５８１ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ

ｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｎｗｅｄｉｖｉｄｅｄｔｈｅｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.ＷｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ￣５８１ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓＳＷ６２０ꎬＬＯＶＯꎬＨＴ２９ａｎｄｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃｅｌｌｌｉｎｅＦＨＣ.ＣＣＫ￣８ａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃ￣

ＴｈｅｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓＳＷ６２０ꎬＬＯＶＯꎬＨＴ２９ꎬａｎｄｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃｅｌｌｌｉｎｅＦＨＣｉｎ

ａｄｄｅｄｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄａｄｄｅｄｖｅｃｔｏｒｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.ｑＲＴ￣ＰＣＲ

ｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＳＷ６２０ｉｎｔｈｅｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲ￣５８１ａｎｄｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ１(ＰＲＤＸ１).ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ￣５８１ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＲＤＸ１ｉｎＳＷ６２０ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ.ＳＷ６２０ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ:ｔｈｅｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ

５８１ｍｉｍｉｃｓａｎｄＰＲＤＸ１ｐｌａｓｍｉｄ.ＣＣＫ￣８ａｎｄＴｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲ￣５８１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＳＷ６２０ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒＰＲＤＸ１ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ.Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＳＷ６２０ｃｅｌｌｓꎬｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ＋ＰＲＤＸ１ｇｒｏｕｐｈａｄｌｏｗｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<ｌｉｎｅｓＬＯＶＯａｎｄＨＴ２９ꎬｍｉＲ￣５８１ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎｔｈｅｈｉｇｈｌｙｉｎｖａｓｉｖｅｃｅｌｌｌｉｎｅＳＷ６２０.ＡｆｔｅｒｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓｗａｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.ｍｉＲ￣５８１ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｏｕｎｄｔｏＰＲＤＸ１３'ＵＴＲａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄＰＲＤＸ１ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.Ｔｈｅ０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｍｉＲ￣５８１ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓꎬａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙ

基金项目:国家自然科学基金资助项目(８１５６１００５５８)ꎮ通信作者:冯继红(Ｅ￣ｍａｉｌ:２８５８５８１３６＠ｑｑ.ｃｏｍ)

ｇｒｏｕｐｗｈｉｃｈｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓꎬａｎｄｔｈｅｍｉＲ￣５８１＋ＰＲＤＸ１ｇｒｏｕｐｗｈｉｃｈｗａｓｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ￣

３５

山东医药２０１８年第５８卷第２５期

ｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＲＤＸ１.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａꎻｍｉｃｒｏＲＮＡ￣５８１ꎻｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ１ꎻｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎻｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ

　　结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一ꎬ发病率和病死率较高[１]ꎮ超过三分之一的结直肠癌患者最终会发展成远处转移[２]ꎮｍｉＲＮＡ是一类小的非编码ＵＴＲ的特定靶ｍＲＮＡꎬ导致ｍＲＮＡ降解或抑制翻译[４]ꎮｍｉＲＮＡ在细胞增殖、发育和分化等生物学进ＲＮＡꎬ含有约２２个核苷酸[３]ꎮｍｉＲＮＡ能部分结合３′程中起重要作用[５]ꎬ且多种类型的ｍｉＲＮＡ可能参与胞分为实验组(加入ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ)和对照组(加入ｖｅｃｔｏｒ)ꎻ无血清培养基将Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００按３分别将ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ和ｐｃＤＮＡ３.１￣ＰＲＤＸ１按５０μＬ/Ｌ进行稀释ꎬ３７℃孵育２０ｍｉｎꎬ用无血清培养基μｍｏｌ/Ｌ稀释ꎬ常温下孵育５ｍｉｎꎬ最后与Ｌｉｐｏ￣ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００等体积分别混匀ꎬ分别加入两组细胞中ꎬ３７℃孵箱继续培养ꎻ１２ｈ后ꎬ观察转染细胞状调节肿瘤细胞行为[６]ｍｉＲＮＡ的表达低于癌旁组织分子ꎬ最近研究显示ꎮｍｉＲ￣５８１是一类新近发现的[７]究目前鲜见报道ꎮ我们在前期基础实验中发现ꎬ但对于其在其他组织中的研ꎬｍｉＲ￣５８１在肝癌组织中５８１ꎬｍｉＲ￣

发生转移的结直肠癌组织在发生转移的结直肠癌组织中表达明显低于未ꎮ２０１３年６月~２０１７年６月ꎬ我们探究ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞生物学的影响ꎬ并初步探讨其作用机制ꎮ１　１.ＶＯ１　材料与方法

和人正常结直肠细胞材料　人结直肠癌细胞株ＦＨＣꎬ购于上海中科院ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＬＯ￣１５培养基、ＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ、ＲＰＭＩ１６４０培养基和ꎬＬ￣

２５％０.双抗购于美国海克隆公司胰酶购于美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)和ＢＯＳＴＥＲꎮꎻＰＢＳ磷酸盐缓冲液购于氧化还原酶蛋白ｍｉＲ￣５８１１(ｍｉｍｉｃｓＰＲＤＸ１)和购于上海吉玛有限公ｐｃＤＮＡ３.１￣过氧化物ＴＲＩｚｏｌ司ꎮ氯仿裂解、乙醇液、、Ｐｒｅｍｉｘ异丙醇购ＥｘＴａｑ于重Ｖｅｒｓｉｏｎ２.庆川东０化和工公ＳＹＢＲ司ꎮＰｒｅｍｉｘ上海ＳａｎｇｏｎＥｘＴａｑＢｉｏｔｅｃｈ购于日本公司合成Ｔａｋａｒａꎮ公司ＣＣＫ￣８ꎮＰＣＲ试剂盒购于引物由日本ＤＯＪＩＮＤＯ公司ꎮＭａｔｒｉｇｅｌ基质胶购于美国ＢＤ公司ꎻＴｒａｎｓｗｅｌｌ小室购于美国康宁公司ꎮＧＡＰＤＨ小鼠抗人一抗、β￣ａｃｔｉｎ小鼠抗人一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司ꎻＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ凝胶试剂盒和全蛋白提取试剂盒购于碧云天公司ꎻＥＣＬ发光液购于索莱宝生物科技有限公司ꎮＳＷ６２０、ＬＯＶＯ、ＦＨＣ细胞均培养于含１０％胎牛血清和１％双抗的Ｌ￣１５培养基中ꎬＨＴ２９细胞培养于含１０％胎牛血清和１％双抗的ＭｃＣｏｙ′ｓ５Ａ培养基中ꎬ均于５％ＣＯ下培养ꎬ每隔３ｄ换液１次ꎬ待细胞铺满培养瓶底进２、３７℃条件１.行传代２　细胞分组及处理ꎬ以下实验均取处于对数生长期的细胞　ＰＢＳ缓冲液将细胞清洗干ꎮ

净ꎬ胰酶消化细胞２ｍｉｎꎬ转移至无菌１５ｍＬ离心管ꎬ

离心并计数细胞ꎬ以每孔４×１０５个细胞接种于６孔板中ꎬ待细胞融合率达７０％左右时进行转染ꎮ将细３６

态ꎬ并将无血清培养基更换为完全培养基ꎬ继续培１.养ꎬ４８ｈ后ꎬ提取细胞ＲＮＡꎬ验证转染效率ꎮ

用实时荧光定量３　不同结直肠细胞株中ＰＣＲ法ꎮ按照说明书提取人正常ｍｉＲ￣５８１表达检测　采结直ＨＴ２９、ＬＯＶＯ肠细胞以中的总ＦＨＣ和ｍｉｃｒｏＲＮＡ人结直肠并逆转录为癌细胞株ＳＷ６２０、ｃＤＮＡꎬｍｉＲ￣５８１Ｕ６为内参ꎬ利用荧光ＰＣＲ仪检测相应ｃＤＮＡ中ｍｉｎꎬ９５号温度为℃的相对表达量６０１５℃ｓꎬ６０ꎮ采用℃１５ꎬ反应条件２－ｓꎬ４５ΔΔＣｔ方法计算个循环:９５ꎬ℃ꎬ获取荧光信预变性１０重复３次ꎮ

２普通ｃＤＮＡｑＲＴ￣ＰＣＲ检测以ＧＡＰＤＨ为内参ꎬ采用－△△Ｃｔ℃方法进行统计ꎬ反应条件为９５℃１０ｍｉｎꎻ９５表达最低的细胞进行后续实验１５ｓꎬ６０℃１ｍｉｎꎬ共４０个循环１.４　结直肠癌细胞ＳＷ６２０增殖能力检测ꎮ

ꎮ选择ｍｉＲ￣５８１ＣＣＫ￣８　采用胞增殖能力实验分别检测５０００个/孔细胞数接种于ꎮ消化并计数结直肠癌ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ９６孔板中ＳＷ６２０组和对照组细ꎬ每组细胞３个复

ꎬ以孔ꎬ３７℃孵箱培养ꎻ待细胞贴壁ꎬ观察细胞状态ꎬ吸出培养基ꎬ避光条件下ꎬ将ＣＣＫ￣８试剂和完全培养基按１∶１０比例混匀ꎬ分别加入每孔细胞中ꎬ３７℃孵育１ｈꎻ将ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ和ｍｉｍｉｃｓｖｅｃｔｏｒ分别转染入ｎｍＳＷ６２０波长处每孔细胞的吸光度值细胞ꎬ４８ｈ后收集细胞ꎬ并统计分析ꎬ酶标仪检测ꎮ４９０１.Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ５　结直肠癌细胞ＳＷ６２０侵袭能力检测上室ꎬ并侵袭试验加入Ｍａｔｒｉｇｅｌꎮ将５基×１０４个ＳＷ６２０细胞置于　采用ＷｏｂｕｒｎꎬＭＡꎬ质胶(ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅꎬｎｇ/ｍＬ)的培养基置于下室中ＵＳＡ)ꎮ将具有１０％ꎮ３７ＦＢＳ℃孵育和ＨＧＦ２４ｈꎬ(２０心去除上膜表面上的细胞ꎮ用９５％乙醇固定２０小洗干净ｍｉｎ后ꎬꎬ用于倒置显微镜下计数０.５％结晶紫溶液染色ꎮ

１０ｍｉｎꎬ自来水冲１.因野生型６　荧光素酶报告基因测定３′ＵＴＲ(含ｍｉＲ￣５８１　识别位点构建含/ＰＲＤＸ１ｗｔ)、突变基型３′ＵＴＲ(ｍｉＲ￣５８１识别位点点突变/ｍｕｔ)片段ꎬ两山东医药２０１８年第５８卷第２５期

端均设计ＸｂａⅠ酶切位点ꎬ插入荧光素酶报告基因质粒(ｐＧＬ３￣ｐｒｏｍｏｔｅｒꎬＰｒｏｍｅｇａ)构建ｐＧＬ３￣３′ＵＴＲｗｔ、ｐＧＬ３￣３′ＵＴＲｍｕｔꎮ取生长状态良好的ＨＥＫ２９３细胞ꎬ将ＰＲＤＸ１与ｍｉＲ￣５８１共转染到ＨＥＫ２９３细胞中ꎬ质粒转染后４８ｈ据Ｐｒｏｍｅｇａ公司操作说明ꎬ裂解细胞ꎬ加入荧光素酶底物ꎬ检测荧光素酶活性ꎬ验证ｍｉＲ￣５８１能否与ＰＲＤＸ１３′ＵＴＲ结合ꎬ证明ｍｉＲ￣５８１是否能直接ＰＲＤＸ１ꎮ

２.２　ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞ＳＷ６２０增殖能力的影响　

ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ组、对照组中ｍｉＲ￣５８１相对表达５８１ｍｉｍｉｃｓ组细胞增殖能力弱于对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ量分别为８.８１±０.４２、１.２５±０.３７ꎬＰ<０.０５ꎮｍｉＲ￣

１.７　ＳＷ６２０细胞中ＰＲＤＸ１蛋白表达检测　采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法ꎮ根据ＰＲＤＸ１蛋白相对分子质量大小ꎬ配制凝胶ꎬ根据所测蛋白浓度适量加入蛋白样品及每孔５μＬ的蛋白Ｍａｒｋｅｒꎻ跑胶ꎬ首先加压８０Ｖꎬ保证所１２０有样品在同一水平线ꎬ待样品至分离胶处ꎬ将电压加至

切胶Ｖꎻ(按序排好浸泡甲醇ꎬ并准备与所切胶条相同大小滤纸切胶ꎬ根据所需条带大小ꎬ对照蛋白Ｍａｒｋｅｒ进行１５ｓ)ꎻ２片和ＰＶＤＦ膜ｋＤꎬ并赶出气泡按照滤纸ꎬ压紧、胶ꎬ在、ＰＶＤＦ２５０ｍＡ膜、恒流下滤纸的顺序ꎬ并放入脱脂奶粉中封闭蛋白１ｍｉｎ进行转膜１ꎻ转膜结束后按１ｈꎻ一抗ꎬＰＢＳＴꎬＰＢＳＴ洗膜洗膜１次ꎬ１将膜次ꎬ浸入稀释好的一抗中ꎬ４℃过夜ꎻ二抗ꎬＰＢＳＴ洗膜３次ꎬ将膜浸入稀释好的二抗中ꎬ常温下孵育１ｈꎻ显影ꎬＰＢＳＴ１.洗膜８　３ＳＷ６２０次后ꎬ在暗室中曝光细胞共转染ｍｉＲ￣５８１ꎬ并分析ꎮ

质粒后的增殖能力检测５８１　

将ＳＷ６２０ｍｉｍｉｃｓ细胞分为和ＰＲＤＸ１ｍｉＲ￣

５８１ｍｉｍｉｃｓ组、ｍｉＲ￣５８１＋ＰＲＤＸ１组ＰＲＤＸ１ｍｉｍｉｃｓꎬ后ꎬ消化细胞共转染后者将ꎬ同方法ꎬ转染方法同方法ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓꎬ前者转染１.４通过ＣＣＫ￣８１.２ꎬ与ｍｉＲ￣待转染ｐｃＤＮＡ３.检测细胞增４８１￣ｈ殖能力１.粒后的侵袭能力检测９　ＳＷ６２０ꎮ

细胞共转染ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓｍｉｍｉｃｓꎬ组转染ꎬ转染方法同方法后者、ｍｉＲ￣５８１ｍｉＲ￣５８１＋　ｍｉｍｉｃｓＰＲＯＸ１将ＳＷ６２０ｍｉｍｉｃｓ１.２ꎬ待转染与组ｐｃＤＮＡ３.ꎬ前细胞分为和ＰＲＤＸ１者转ｍｉＲ￣５８１质４８ｈ后１￣染ꎬ消化细胞ＰＲＤＸ１ｍｉＲ￣５８１共ꎬ

１.同方法１.５通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测细胞侵袭能力ꎮ

量数据以１０　统计学方法􀭰ｘ±ｓ表示　ꎬ两组间比较用采用ＳＰＳＳ２２.ｔ０检验统计软件ꎬ多组间比ꎮ计

较用方差分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２　２.较１　结果

　ｍｉＲ￣５８１ｍｉＲ￣５８１在人正常结直肠细胞在不同结直肠癌细胞株中的表达比ＦＨＣ和人结直肠癌细胞株ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＬＯＶＯ的相对表达量分０.别为１.０２±０.１３、０.５０±０.１２、０.４７±０.２１、０.６５±

直肠癌细胞株０９ꎬｍｉＲ￣５８１(在ＰＳＷ６２０均<０.０５)ꎮ

细胞中的表达低于其他结图１　ｍｉＲ￣５８１对ＳＷ６２０细胞增殖能力的影响

２.响３　±１２.　对照组通过ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质胶的细胞数量为ＳＷ６２０侵袭能力的影±１１.(１７４.４)个５ＨＰꎬ两组比较８)个/ＨＰꎬｍｉＲ￣５８１ꎬＰ<０.０５ꎮ

ｍｉｍｉｃｓ组为(８７.１/

２.５８１４　双荧光素酶报告基因结果素酶活性ｍｉｍｉｃｓ(１.共转染０４±０.ＨＥＫ２９３１２ｖｓ１.细胞后　５３±０.ꎬ野生型质粒与０３ꎬ显著降低相对荧光ｍｉＲ￣

Ｐ<０.０５)ꎬ而突变型质粒与ｍｉＲ￣５８１ｍｉｍｉｃｓ共转染ＨＥＫ２９３细胞后ꎬ荧光素酶活性无明显改变>０.０５)ꎮｍｉＲ￣５８１能与(１.ＰＲＤＸ１６４±３′ＵＴＲ０.０４ｖｓ特异性结合１.５９±０.０６ꎬꎮ

Ｐ２.白表达的影响５　ｍｉＲ￣５８１　对结直肠癌细胞对照组、ＰＲＤＸ１ＳＷ６２０组、ｍｉＲ￣５８１中ＰＲＤＸ１ｍｉｍｉｃｓ

蛋组、ｍｉＲ￣５８１＋ＰＲＤＸ１组ＰＲＤＸ１蛋白相对表达量分０.别为３７ꎬ１.四组间两两比较１５±０.３４、２.８７ꎬＰ±０.均２８、０.<０.０５ꎮ

４０±０.０９、１.９５±２.ＳＷ６２０６　ＰＲＤＸ１逆转ｍｉＲ￣５８１　对结直肠组细胞增殖能力较增殖能力的影响ｍｉＲ￣５８１　第癌细胞ｍｉｍｉｃｓ５天ꎬｍｉＲ￣５８１组强ꎬ见图＋ＰＲＤＸ１２ꎮ

图２　ＰＲＤＸ１干预后ｍｉＲ￣５８１对结直肠癌细胞

２.ＳＷ６２０增殖能力的影响

侵袭７　ｍｉｍｉｃｓ能ＰＲＤＸ１力的影逆转响ｍｉＲ￣５８１　ＳＷ６２０对结直肠癌细胞细胞共转ＳＷ６２０ｍｉＲ￣５８１和的ＳＷ６２０ｍｉｍｉｃｓＰＲＤＸ１细胞ꎬ更强质粒后的侵袭能力细胞穿膜数分别为ꎬ但弱于单独转染ꎬ较单独转染染ｍｉＲ￣５８１２５９.ＰＲＤＸ１２±２３.质粒

３、

３７

山东医药２０１８年第５８卷第２５期

９４.２±１７.１、２０２.１±２７.５ꎬＰ<０.０５ꎮ

　　多种在肿瘤中异常表达的ｍｉＲＮＡｓ分子ꎬ在肿瘤进展过程中起关键的调节作用[８]ꎬｍｉＲＮＡｓ可靶向多种基因参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程ꎬ与各种临床肿瘤的发生发展密切相关

[９]

殖和侵袭ꎬ其机制可能与靶向ＰＲＤＸ１有关ꎮ参考文献:

[１]ＳｉｅｇｅｌＲＬꎬＭｉｌｌｅｒＫＤꎬＦｅｄｅｗａＳＡꎬｅｔａｌ.Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓ￣[２]ＣａｏＨꎬＸｕＥꎬＬｉｕＨꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ￣ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎ

Ｐｒａｃｔꎬ２０１５ꎬ２１１(８):５５７￣５６９.

ｔｉｃｓꎬ２０１７[Ｊ].ＣＡＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎꎬ２０１７ꎬ６７(３):１７７￣１９３.

３　讨论

ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ:Ａｓｙｓｔｅｍｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＰａｔｈｏｌＲｅｓ

及实时荧光定量检查结果ꎬ发现ｍｉＲ￣５８１在结直肠癌组织中的表达低于癌旁组织ꎬ且在转移性癌组织中表达明显降低ꎬ因此ꎬ我们推测ｍｉＲ￣５８１在结直肠ꎮ本研究结合前期试验基础微阵列实验

[３]ＨａｎｓｅｎＴＢꎬＪｅｎｓｅｎＴＩꎬＣｌａｕｓｅｎＢＨꎬｅｔａｌ.ＮａｔｕｒａｌＲＮＡｃｉｒｃｌｅｓ

ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｒｏＲＮＡｓｐｏｎｇｅｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２０１３ꎬ４９５(７４４１):３８４￣３８８.

[４]ＨａＭꎬＫｉｍＶＮ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖ癌的发生发展中起到一定作用ꎮ

为进一步验证ｍｉＲ￣５８１是否在结直肠癌的增殖ｍｉＲ￣５８１、侵袭和转移中发挥重要作用ｍｉｍｉｃｓ上调ＳＷ６２０细胞中ꎬ我们首先通过转染达ꎬＣＣＫ￣８实验证实细胞增殖能力减弱ｍｉＲ￣５８１ꎬ同时ꎬＴｒａｎ￣的表说明ｓｗｅｌｌｍｉＲ￣５８１侵袭实验显示可能是潜在的抑癌基因ｍｉＲ￣５８１能降低其侵袭能力ꎬ但ｍｉＲ￣５８１ꎮ

在结直肠癌中的作用机制尚需进一步深入研究ꎮ

氧化应激在多种癌症的发病机制中起重要作用ＤＮＡꎮ主要排[１０]的结构损伤是由于活ꎮ另外ꎬＲＯＳꎬ如插入性氧(、ＲＯＳ)缺失、的碱基对突变或重过度产生导致关的细胞质信号可直接激活细胞核与恶性转化相(ＰＲＤＸ)是具有复杂寡聚体的蛋白质家族结构的一转导通路

[１１]

ꎮ过氧化物毒素

类巯基过氧化物酶ꎬ哺乳动物有六种不同的ＰＲＤＸꎬ各种类型的ＰＲＤＸ具有多种甚至相反的功能[１２]已证明ＰＲＤＸ１在乳腺癌[１３]ꎮ

癌

[１５]

组织中过度表达ꎮ此外、ꎬＰＲＤＸ１恶性间皮瘤[１４]和肺与致癌基因

的产物ｃ￣Ａｂｌ和ｃ￣Ｍｙｃ相互作用ꎬ从而抑制ｃ￣Ａｂｌ激酶活性[１６]和ｃ￣Ｍｙｃ介导的转化作用[１７]而我们前期的研究发现ꎬＰＲＤＸ１可促进人结肠

ꎮ

癌ＳＷ４８０ＳＷ４８０细胞的侵袭细胞ＥＭＴ、转移能力的发生ꎬ从而增强结肠癌[１８]ｇｅｔｓｃａｎ合位点ꎬ网站发现两者可能有内在关联ＰＲＤＸ１与ｍｉＲ￣５８１ꎮ我们通过Ｔａｒ￣ꎮ具有相似的结故我们选择双荧光素酶实验验证ｍｉＲ￣５８１和ＰＲＤＸ１的相关作用５８１关系ꎮ结果与我们的猜测一致ꎬ野生型质粒与ｍｉＲ￣

显著降低ｍｉｍｉｃｓＨＥＫ２９３细胞后ꎬ而突变型质粒与共转染ＨＥＫ２９３细胞后ꎬ荧光素酶活性无明显改变ｍｉＲ￣５８１ꎬ荧光素酶活性ｍｉｍｉｃｓꎮ共转染我们还发现ＰＲＤＸ１的过表达显著逆转了ｍｉＲ￣５８１此外ꎬＰＲＤＸ１对ＳＷ６２０是细胞中增殖和侵袭的抑制作用ｍｉＲ￣５８１的直接靶标ꎬꎮ因此ꎬ

对结直肠癌细胞的影响ꎮ并且参与ｍｉＲ￣５８１综上所述ꎬｍｉＲ￣５８１可抑制结直肠癌细胞的增

３８

[５]ＬｉｎＭｏｌＳꎬＣｅｌｌＧｒｅｇｏｒｙＢｉｏｌꎬ２０１４ꎬ１５(８):５０９￣５２４.

ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒꎬＲＩ.２０１５ꎬ１５(６):３２１￣３３３.ＭｉｃｒｏＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｓｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].[６]Ｋａｔａｙａｍａｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ｒｅｌａｔｅｄＹꎬＭａｅｄａＭꎬＭｉｙａｇｕｃｈｉＫꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ[７]ｓｉｏｎＩｏｒｉｏｐｒｏｆｉｌｉｎｇ[Ｊ].ｍｉｃｒｏＲＮＡｓＯｎｃｏｌＬｅｔｔꎬｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ２０１２ꎬ４(４):８１７￣８２３.ｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙｅｘｐｒｅｓ￣ｐａｔｈ￣

ｔｉｃｓꎬＭＶꎬＣｒｏｃｅＣＭ.ＭｉｃｒｏＲＮＡｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒ:ｄｉａｇｎｏｓ￣

[８]ＥＭＢＯｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇＡｃｕｎｚｏＭｏｌａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ.Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ａｂｒｉｅｆｏｖｅｒｖｉｅｗ[Ｊ].ＭꎬＭｅｄꎬＲｏｍａｎｏ２０１７ꎬ９(６):８５２.

ＧꎬＡｄｖＷｅｒｎｉｃｋｅＢｉｏｌＲｅｇｕｌꎬＤꎬｅｔ２０１５ꎬ５７:１￣９.

ａｌ.ＭｉｃｒｏＲＮＡａｎｄｃａｎｃｅｒ￣[９]ｃａｎｃｅｒＣｈｅｎｇＣＪꎬＢａｈａｌＲꎬＢａｂａｒＩＡꎬｅｔ[１０]ｔｕｒｅꎬＨｅｃｈｔ２０１５ꎬ５１８(７５３７):１０７￣１１０.

ｔｈｅｒａｐｙｔａｒｇｅｔｅｄｔｏｔｈｅｔｕｍｏｕｒａｌ.ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ[ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇＪ].Ｎａ￣ｆｏｒ

ｏｎｂｒｅａｓｔＦꎬＰｅｓｓｏａｃａｎｃｅｒＣＦꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＧｅｎｔｉｌｅＬＢꎬａｎｄｅｔｔｈｅｒａｐｙａｌ.Ｔｈｅ[ｒｏｌｅＪ].ｏｆＴｕｍｏｒｏｘｉｄａｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙꎬ

ｓｔｒｅｓｓ

[１１]２０１６ꎬ３７(４):４２８１￣４２９１.

Ｆｉｌｏｍｅｎｉａｇｙ:ｔｈｅＧꎬｃｌａｓｈＤｅｂｅｔｗｅｅｎＺｉｏＤꎬＣｅｃｃｏｎｉｄａｍａｇｅａｎｄＦ.Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｔｒｅｓｓｎｅｅｄｓａｎｄ[Ｊ].ａｕｔｏｐｈ￣

ＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒꎬ２０１５ꎬ２２(３):３７７￣３８８.

Ｃｅｌｌ

[１２]ＰａｒｋｅｒꎬｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＭＨꎬＪｏＭＲꎬＫｉｍｄｉｓｅａｓｅｓＹＲꎬｅｔａｌ.ａｎｄＲｏｌｅｓｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｏｆｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎｓｄｉｓｅａｓｅｓｉｎ[ｃａｎｃ￣

Ｊ[１３]ＰｈａｒｍａｃｏｌｍｅｎｔＨａｍｐｔｏｎｉｎｔｈｅＭＢꎬＴｈｅｒꎬｉｎｉｔｉａｔｉｏｎＶｉｃｋ２０１６ꎬ１６３:１￣２３.

].ａｎｄＫＡꎬｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎＳｋｏｋｏＪꎬｅｔｏｆａｌ.Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎｉｎｖｏｌｖｅ￣

[１４]ｉｄＣｕｎｎｉｆｆＲｅｄｏｘｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].Ａｎｔｉｏｘ￣ｐｅｒｏｘｉｄｅＢꎬＳｉｇｎａｌꎬＮｅｗｉｃｋ２０１７ꎬ２８(７):５９１￣６０８.

ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍＫꎬｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｖｉａＮｅｌｓｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＫＪꎬｅｔａｌ.ａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇＤｉｓａｂｌｉｎｇｍａｌｉｇｎａｎｔｏｆｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ

ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ３[１５][Ｊ].ａｓａｎＪｉａｎｇＰＬｏＳ４ＨꎬｐｒｏｍｏｔｅｓＷｕＯｎｅꎬＬꎬ２０１５ꎬ１０(５):ｅ０１２７３１０.

ｈｕｍａｎＭｉｓｈｒａｌｕｎｇＭꎬｃａｎｃｅｒｅｔａｌ.ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ[ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪ].ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎＡｍＪＣａｎｃｅｒ

１

[１６]ＲｅｓꎬａｎｄＤｉｎｇ２０１４ꎬ４(５):４４５.

ｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＣꎬＦａｎＪＸꎬＣｅｌｌＷｕＭｏｌＧ.ＭｅｄꎬＰｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ２０１７ꎬ２１(１):１９３￣２０２.

１￣ａｎａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｉｎ[１７]ＭｕｓｏｒꎬＺＭꎬａｌｔｅｒｓｉｎｔｅｒａｃｔｓＹｉｎＸＹꎬｗｉｔｈＰｒｏｃｈｏｗｎｉｋｔｈｅＭｙｃＢｏｘＥＶ.ＩＩｄｏｍａｉｎＰａｇꎬａｏｆｐｕｔａｔｉｖｅｃ￣Ｍｙｃｔｕｍｏｒａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｓｕｐｐｒｅｓ￣

[１８]Ｃｈｅｍꎬｉｔｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＪＢｉｏｌ冯继红２０１６ꎬ２７７(４５):４３１７５￣４３１８４.

癌ＳＷ４８０ꎬ冯冬冬细胞侵袭转移ꎬ傅仲学.ＰＲＤＸ１[Ｊ].遵义医学院学报通过上皮间质转化促进结肠

ꎬ２０１５ꎬ３８(１):

６７￣７３.

(收稿日期:２０１８￣０３￣２１)