人自噬基因hATG12转染对酿酒酵母自噬过程的作用
[ 08-10-22 11:26:00 ] 作者：何才姑 编辑：studa20
【摘要】 目的 探讨人自噬基因ATG12(hATG12)在酵母自噬过程中的作用。方法转化重组质粒pESCURAEGFPhATG12(实验组)或pESCURAEGFP(对照组)的酵母用不同方法诱导自噬后,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)和含hAtg12的融合蛋白(EGFPhATG12)在酵母中的表达与定位;以透射电镜观察前自噬体结构、自噬体和自噬小体的分布及结构特点。结果2组酵母细胞质内均见荧光,液泡内未见荧光,实验组荧光呈小点状分布;电镜下见自噬体由双层膜囊结构延伸而来,该双层膜囊结构靠近细胞膜。液泡内自噬小体由单层膜包裹。结论hATG12参与酵母自噬体最初的形成过程,定位于自噬体外膜上,在自噬体形成后脱离自噬体。自噬体膜最初可能来源于细胞膜。 【关键词】 hATG12 蛋白质类 酵母菌 酿酒 基因 转染 吞噬作用
1962年,Ashford和Porter报道在电子显微镜下发现肝细胞自噬现象。近年来由于发现与自噬相关的基因,以及自噬在生物体生理和病理等方面的作用,自噬受到高度关注。自噬基因首先在酵母中发现,随后在小鼠等哺乳动物中发现其同源基因,说明自噬的分子机制从酵母到高等真核生物高度保守。笔者采用报告基因技术,观察hATG12在酵母自噬过程中的表达及定位,采用透射电镜观察自噬体的结构及其形成过程,进而研究hATG12在酵母自噬过程中的作用。 1材料与方法 1.1材料
1.1.1试剂苯甲基磺酰氟、雷帕霉素(美国Sigma公司)。
1.1.2质粒和菌株大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体pESCURA,营养缺陷型酿酒酵母YPH500(美国Invitrogen公司)。含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的载体pESCURAEGFP和pESCURAEGFPhATG12(由本实验室构建)。hATG12为本实验室从正常人外周血单个核细胞中获得的自噬相关基因。转化质粒pESCURAEGFPhATG12的营养缺陷型酿酒酵母YPH500和转化质粒pESCURAEGFP营养缺陷型酿酒酵母YPH500也由本实验室转化获得。实验分组:转化重组质粒pESCURAEGFPhATG12的酵母为实验组,转化重组质粒pESCURAEGFP的酵母为对照组。 1.2 方法
1.2.1荧光显微镜标本制备与观察(1)实验组和对照组在SD(0.67％酵母氮碱,2％葡萄糖,0.13％缺尿嘧啶的氨基酸省却混合物)培养液中培养到对数早期。(2)4 000 r/min离心5 min。用SG(0.67％酵母氮碱,2％半乳糖,0.13％缺
尿嘧啶的氨基酸省却混合物)洗2次。在SG中培养24 h。(3)加雷帕霉素(终浓度0.5 μg/mL),继续培养5 h。(4)取菌液10 μL,滴在载玻片上,盖上盖玻片。研究显微镜(BX51,日本Olympuse公司)蓝色滤片观察,数码相机(DP70,日本Nikon公司)照相。
1.2.2透射电镜观察(1)、(2)同1.2.1,(3)在SG中培养24 h后,4 000 r/min离心5 min。用SD(N)(0.17％酵母氮碱,2％半乳糖)洗2次。加SD(N)培养,加苯甲基磺酰氟(终浓度1 mmol/L,以防止自噬小体降解),培养1 h和3 h取样。(4)透射电镜观察:取菌液1 mL离心收集细胞。2.5%戊二醛固定,4 ℃过夜。PBS漂洗,30 min×4。锇酸后固定1.5 h。PBS漂洗,30 min×4。常规丙酮脱水。渗透:纯丙酮Spurr’s树脂=1∶1,2 h;纯丙酮Spurr’s树脂=1∶2,4 h;Spurr’s树脂过夜包埋。超薄切片。醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色。透射电镜(JEM1200EX,日本电子光学公司)观察。 2结果 2.1EGFP及EGFP
hATG12在酵母发生自噬时的表达与定位
2.1.1荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞质内均观察到荧光。对照组荧光较均匀分布于细胞质中,而实验组除此之外,细胞质中自噬体呈小点状分布,液泡中未见荧光。相差显微镜下观察到自噬体结构,自噬体较多,其中一些能和荧光显微镜图像中自噬体对应起来,这部分自噬体是由转染的hATG12参与形成的,另一部分未显示荧光的自噬体由酵母内源性ATG12参与形成(图1)。 2.1.2透射电镜观察当细胞从营养丰富的培养液转移到营养缺乏的培养液培养后,观察到细胞质内前自噬体结构(preautophagosome
structure,PAS)、自噬体和液泡内自噬小体。PAS为游离的双层膜囊,靠近细胞膜,自噬体位于PAS的内侧,由双层膜包裹,液泡内自噬小体由单层膜包裹(图2)。
2.2自噬体膜的来源在细胞周边靠近细胞膜观察到许多双层膜囊结构、自噬体和小液泡,这些双层膜囊结构与细胞膜相连,可见液泡膜也与细胞膜相连(图3)。 3讨论
3.1hATG12在酵母自噬过程中的作用本研究在前期工作中从正常人外周血单个核细胞中克隆了hATG12,而后把hATG12与报告基因——EGFP基因相连,并转化到酵母;荧光显微镜证实EGFP和融合蛋白在酵母中稳定表达[1];经进一步研究表明,hATG12并不影响酵母的增殖,但能显著提高酵母自噬活性(待发表)。
