马铃薯致病疫霉生理小种鉴别寄主的组培条件优化及部分生理小种的鉴定

小种的鉴定

田荟遥;蒋继志;侯宁;王兴哲;李成斌;申芬

【摘 要】为使含有R1～R11单基因抗性的一整套马铃薯组培苗鉴别寄主能整齐一致的生长,及时准确地用于致病疫霉生理小种的鉴定,本试验通过改变培养基部分成分的含量及选择不同转接时期对组培苗的培养条件进行初步优化.结果发现,当MS培养基中琼脂的量从7 g/L增至10 g/L时,可显著促进组培苗扎根及生长,同时降低了杂菌对11个鉴别寄主组培苗的污染,染菌率由30.56％下降至13.％;将培养基中蔗糖的量从30g/L降为26 g/L时适宜其中7个寄主组培苗的生长,而生长较慢的R1和R11最适的蔗糖含量分别为28 g/L和27 g/L时,生长较快的R3和R5最适的蔗糖含量分别为24 g/L和23 g/L;当从母株上剪取的组培苗每个茎段包含4片叶时,适合多数鉴别寄主的生长,而生长较快的R3和R5的茎段上最适叶片数为2片,生长较慢的R1和R11最适的叶片数为6片.另外,茎段长为3 cm、培养时间为40 d时,组培苗转接后恢复生长的能力较强.利用优化组培条件后获得的组培苗对2016年采自东北三省的70株致病疫霉进行生理小种鉴定,结果表明优势小种为超级小种(含有11个毒性基因的晚疫病菌),出现频率为27.13％,在东北三省中均有分布.优化后11个鉴别寄主的长势、叶片数量和大小均比较整齐一致,能及时用于致病疫霉生理小种的鉴定.%To make the 11 potato differential hosts grow as the same speed for identifying the P.infestans physiological races timely and exactly,the culture conditions of the host tissue culture seedlings were optimized by changing the content of some components in MS medium and selecting different transferring time in this experiment.The results showed that when the amount of agar in MS medium increased from 7 g/L

to 10 g/L,promoted markedly rooting and growing of the plantlets,at the same time,the contamination of 11 differential hosts could be significantly reduced,the pollution rate dropped from 30.56％ to 13.％;that of sucrose decreased from 30 g/L to 26 g/L were appropriate for growth of 7 differential hosts,while the optimal sucrose contents for R1 and R11 hosts which grow slowly were 28 g/L and 27 g/L,respectively,and that for R3 and R5 hosts which grow quickly was 24 g/L and 23 g/ L,respectively.It was found that the each stem with four leaves from the parent plants were suitable for transferring and restoring growth of most differential hosts,but that with two leaves for R3 and R5 hosts,and that with six leaves for R1 and R11 hosts were suitable,respectively.In addition,the ability of restoring growth of a stem with 3 cm in length and culturing 40 d was the strongest after transferring them onto new MS media.The physiological races of 70 P.infestans strains from north east China in 2016 were identified with the above acquired 11 differential hosts plantlets,the dominant race was the super race (1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11),its incidence frequency was

27.13％,distributed in all 3 provinces.The growth vigour,size and amount of leaves of 11 hosts were relatively neat and consistent after optimizing tissue culture conditions,and could be used in identification of P.infestans physiological races timely. 【期刊名称】《河北农业大学学报》 【年(卷),期】2017(040)005 【总页数】7页(P78-83,)

【关键词】马铃薯鉴别寄主;致病疫霉;生理小种;组培;优化 【作 者】田荟遥;蒋继志;侯宁;王兴哲;李成斌;申芬

【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北医科大学第二医院,河北石家庄0050000;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002 【正文语种】中 文 【中图分类】S435.32

马铃薯由于其淀粉含量丰富、较大米和小麦含有更多的蛋白质和人类所必需的氨基酸等，在世界各国广泛种植［1］。2015年我国提出马铃薯主粮化战略，至2020年将50%以上的马铃薯作为主食来利用［2］。然而，由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害，每年造成的损失全球达到60亿美元，中国达到10亿美元，且危害性与防治难度逐年加大［3］。当前生产中除了利用有限的抗病品种外，主要利用农药防治该病。然而，致病疫霉生理分化和变异迅速，不断出现新的毒力更强的生理小种，且生理小种的类型已由单一型向复合型转变，部分地区已出现能克服现有11个单一抗晚疫病基因（R1～R11）的广谱生理小种或超级生理小种，且出现频率逐年上升，加之A2交配型、自育型菌株以及卵孢子的大范围及频繁出现，病菌的抗药性也日益增加。施用农药在引起环境污染和破坏生态平衡的同时［4－5］，又加剧了生理小种的变异［6］。这对生产中有效防治马铃薯晚疫病带来了极大的挑战。因此，快速有效地明确生理小种类型，对于生产中合理布局马铃薯不同抗性的品种、科学选用适宜的化学农药有重要的理论和实践意义。

目前，对致病疫霉生理小种的鉴定，以含有11个单一抗病基因的一套鉴别寄主组培苗为基础，或直接用这一套组培苗鉴定，或将组培苗移栽到花盆、大田种植后进行鉴定。不论哪种方式，其中将11个组培苗整齐一致的培育成壮苗是开展鉴定工作的前提。但在试验中发现，这套鉴别寄主与常规的马铃薯脱毒苗扩繁不同，首先不同鉴别寄主之间无论是在室内组织培养、温室盆栽还是田间种植，其生长速度并不完全一致，有的生长比较迅速，如R3和R5，而有的生长比较缓慢，如R1和R11；其次如果按照常规的操作方法提高琼脂的含量，鉴别寄主组培苗在培养基中不易扎根，也易染菌；另外，扩繁组培苗时幼苗的生长状态例如株高、叶片数、叶片大小等均导致转接后的幼苗恢复生长的速率参差不齐，常常在等待生长速度比较缓慢的寄主的过程中，生长速率较快的寄主已老化或易被杂菌污染。因此，为了能最大幅度地促使11个鉴别寄主同步生长，实现在最短的时间内同时用11个鉴别寄主来鉴定生理小种的目的，本试验对这套鉴别寄主的部分组培条件进行了初步优化，并利用优化组培条件后获得的一套鉴别寄主对2016年采自辽宁（新民县，昌图县）、吉林（梨树县，敦化县）和黑龙江（双城区和青冈县）的70株致病疫霉进行了鉴定。 1．1 供试菌株

2016年采集分离纯化自辽宁（新民县，昌图县）、吉林（梨树县，敦化县）、黑龙江（双城区，青冈县）等东北三省不同市（县）的70株致病疫霉。 1．2 鉴别寄主

供试一套鉴别寄主由云南师范大学李灿辉教授惠赠，其含有主效抗性基因R1～R11和已知无R基因的感病材料（r）的鉴别寄主，全部为无菌组培组培苗。 1．3 琼脂含量对鉴别寄主组培组培苗根系发育及幼苗生长的影响

在培育马铃薯鉴别寄主组培组培苗中普遍采用 Murashige ＆Skoog medium所建立的全量培养基（MS），其中琼脂的量为7g／L［7］。试验中以7g／L为对

照，逐步增加琼脂的含量，分别为8，9，10，11，12和13g／L。取配制好的上述 MS培养基50mL（pH 5．8）装入250mL培养瓶内，用封口膜封口后常规灭菌。每处理3瓶组培苗，每瓶4株鉴别寄主组培苗，试验重复3次，观察统计无菌苗的根系发育、幼苗生长以及染菌情况，明确添加不同的琼脂量对于所有11个鉴别寄主的扎根和生长以及生长过程中的染菌情况是否有不同的影响，计算染菌率。 染菌率＝鉴别寄主组培组培苗染菌棵数／总鉴别寄主组培苗棵数×100% 1．4 蔗糖含量对鉴别寄主组培苗生长的影响

在前文已优化琼脂含量的基础上，将蔗糖的量分别减少至28，26，24，22和20g／L，以30g／L蔗糖量为对照。由于鉴别寄主R1和R11生长较慢且更易染菌，蔗糖的添加量分别为28，27，26，25和24 g／L，生长较快的R3和R5，蔗糖的添加量分别为25，24，23，22和21g／L，每处理3瓶，每瓶4株，重复3次，观察统计无菌苗的扎根、生长以及被杂菌污染情况，计算染菌率。 1．5 叶片数对马铃薯鉴别寄主组培苗生长的影响

在进行马铃薯鉴别寄主转接组培苗的过程中，接种的外植体采用带一个叶片的单节茎段，生长端向上插在MS培养基上［8］。本试验中将多数鉴别寄主的茎剪成不同长度的小段，使每段所包含的叶片数分别为2片、3片、4片、5片、6片、7片和8片，并设置只含一片叶的茎段作为对照。插入新鲜的改良MS培养基中，生长端向上，25℃、18h／6h（光／暗）的周期培养。生长较慢的鉴别寄主R1和R11的幼苗，每段茎携带叶片数分别为5片、6片、7片、8片、9片和10片，生长较快的鉴别寄主R3和R5的每段茎携带叶片数分别为2片、3片、4片、5片和6片。定期对组培苗的株高、叶片数、可用节数、节间长和生根数进行观察。每处理3瓶组培苗，每瓶4株，试验重复3次。 1．6 转接时间对鉴别寄主组培苗生长的影响

通过上述琼脂含量、蔗糖含量及幼茎叶片数的初步优化，11个鉴别寄主的生长速

率已基本趋于一致，所以不同鉴别寄主的转接时间统一设置为30，35，40，45和50d。每处理3瓶组培苗，每瓶4株，重复3次。观察统计组培苗在新的培养基中的绝对生长速率。绝对生长速率为单位天数内植株的绝对生长高度（mm／d）。

1．7 幼苗茎长对鉴别寄主组培苗生长的影响

鉴别寄主转接到新鲜MS培养基后需要5～7d的缓苗时长随后才开始生长。因此，幼苗茎长对缓苗过程的长短也有重要影响。将幼茎分别切成2，2．5，3 ，3．5和4cm等不同长度小段，扦插至新鲜MS培养基中，观察不同茎长对鉴别寄主恢复生长的影响。每处理3瓶组培苗，每瓶4株，重复3次。 1．8 致病疫霉生理小种的鉴定

依据本研究室桂春爽所述方法制备致病疫霉孢子囊悬浮液，其浓度为50～100个孢子囊／5μL［9］，参考杨丽娜等离体叶片接种法进行致病疫霉生理小种的鉴定并做改进［10］。选择长度1．5cm左右的鉴别寄主无菌苗叶片，插入至含有2%水琼脂的大培养皿中，取孢子囊悬浮液5μL接种在叶片背面的二级叶脉间，用封口膜封口，18～20℃下黑暗培养24 h，次日将叶片翻转，封口膜封口后，置入光照培养室或人工气候培养箱（16h光照，8h黑暗）18～20℃下培养4～7d，观察叶片的发病情况。每个菌株接种一种鉴别寄主3片叶，试验重复2次。依照Black等［11］提出的致病疫霉生理小种统一国际命名系统确定生理小种的类型。 2．1 不同琼脂含量对鉴别寄主组培苗根系发生率和生长的影响

在培养基中加入不同量的琼脂对马铃薯鉴别寄主组培苗的根系发育如根的数量、长度、根的生长速率等均有影响。由于琼脂的固定作用使组培苗易于固定，因此提高了生根数和根长（见表1）。当琼脂的含量为10g／L时生根数最多且根长最长；同时发现增加琼脂量的培养基与对照相比，在增加琼脂量8～12g／L范围内，组培苗染菌株数均明显减少，且不同处理间均有显著性差异（P＜0．05），也均与

对照有显著性差异，其中琼脂量为10g／L时染菌率最低（13．%）。但当琼脂量继续增加至13g时染菌率明显上升，且该状态的培养基过于坚硬，不利于组培苗根系的发育。

2．2 不同蔗糖含量对鉴别寄主组培苗生长的影响

当MS培养基中加入的蔗糖含量不同时，马铃薯组培苗的生长情况也有所差异。对于生长较快的R3和R5寄主来说，当蔗糖含量降低后，其生长速度有所下降。而原来生长较慢R1与R11寄主在增加了蔗糖含量后其生长速度有所加快，促使R1、R3、R5、R11与大部分寄主的生长速度较为接近。此外，加入30g／L蔗糖的对照的染菌率为25%，而在加入28～22g／L蔗糖的范围内，随着蔗糖量的减少染菌率明显下降，染菌率均低于21%，组培苗也普遍生长得较好。其中除加入量为28g／L的处理与对照无显著性差异（P＜0．05）外，其余几种处理均与对照达到显著性差异（P＞0．05）；对于生长较为缓慢的R1与R11寄主来说，蔗糖加入量为28g／L时R1的染菌率最低，加入量为27g／L时R11的染菌率最低。而生长快速的R3和R5染菌率最低时蔗糖的添加量分别为24g／L和23g／L（图2）。

2．3 叶片数对组培苗生长的影响

在组培苗转接移栽过程中，从母株上剪取的幼苗茎段上所携带叶片的多少，对转接移栽后组培苗的成活及迅速恢复生长有重要的影响。试验结果显示，当幼苗茎段上所携带的叶片数由1片增加至4片时，可显著提高大多数寄主转接后幼苗的株高、叶片数、可用节数、节间长和生根数（图3）；但当叶片数继续增加到7片时则不利于鉴别寄主生长，且此时幼苗由于植株较高会由于重力作用向一侧倾斜，不利于其向上生长。而对于鉴别寄主R1与R11来说，由于其生长速度较慢，每一茎段的叶片数增加到4片叶时，其生长速度仍然要比其它寄主缓慢得多，当继续增加R1和R11的叶片数到6片时，其生长状况与其他鉴别寄主相比，株高、叶片数、

可用节数、节间长和生根数等状况才较为一致；相似情况是对于生长速度较快的鉴别寄主R3和R5来说，每段茎上的叶片数为2片时，与其他鉴别寄主的生长状况也较为一致。

2．4 转接时期对组培苗生长的影响

将组培苗母株培养30～50d等不同时间后进行转接，结果显示培养40d的幼苗转接后恢复生长的能力最强，恢复生长后的状态也最佳，与培养30d的对照相比，生长速率最高，达到了23．25%，且两者之间达到了显著性差异（P＜0．05）。在此阶段，11个鉴别寄主恢复生长的能力和生长速率已基本趋于一致，彼此间无显著性差异，能及时用于后续致病疫霉生理小种的鉴定（图4）。 2．5 转接时茎段长度对组培苗生长的影响

转接时剪取的茎段长度对转接后组培苗恢复生长也有明显不同的影响（图5），当茎段长度平均为2cm时，恢复生长所需时间最长（7．5d），长度为3 cm时恢复生长所需时间最短（4．5d），当继续增加茎段长度后，恢复生长所需时间则又有所增加，约5．3d。茎段长度为3cm的处理与茎段长度为2cm的处理之间有显著性差异，但与其它处理间无显著性差异（P＜0．05）。 2．6 东北地区部分致病疫霉菌株生理小种的鉴定

对2016年采自东北三省的70株致病疫霉进行了鉴定，结果如表2所示，共鉴定出23种类型的生理小种，其中出现频率最高（27．13%）的生理小种为全谱型生理小种1．2．3．4．5．6．7．8．9．10．11，在黑龙江、吉林和辽宁三省中均有出现，分布范围较广；其次是小种1．2．3．4．5．8．9．10．11和小种1．5．7．10．11，出现频率分别为11．41%和8．54%，这2个类型的小种在东北三省也均有分布。可以看出，2016年所采集的菌株中，并未监测到只能克服单一抗性基因的致病疫霉菌株，除小种1．9只能克服R1和R9两个单一抗病基因外，所有菌株均可以克服多个抗性基因。

马铃薯致病疫霉生理小种鉴别寄主是及时鉴定、明确生理小种类型、分布以及时空变化规律的唯一依据，因此鉴别寄主组培苗生长得快慢、长势与染菌情况直接关系到后续的鉴别工作。目前用于培养马铃薯鉴别寄主组培苗的培养基为MS培养基，但本实验室在多年从事致病疫霉生理小种鉴定的工作中，发现在培养R1至R11这一套鉴别寄主过程中，仍有许多需要解决的实际问题，例如培养基凝固状态、转接时组培苗的状态等，都会影响转接后组培苗的恢复生长，加之R1至R11这11个鉴别寄主本身就存在许多差异，最明显的就是在MS培养基上的生长速度常常参差不齐，直接导致其不能在同一个时间同时使用11个鉴别寄主来鉴定致病疫霉生理小种。因此本试验对上述问题进行了初步探讨，发现将常规MS培养基中琼脂的量由7g／L增加至10g／L时，培养基凝固效果最好，组培苗也易直立生长，易分化生根，根的数量最多且长度最长，而且不影响组培苗的扦插，染菌率也最低；如果继续增加琼脂的量，培养基变为固体培养基，组培苗扦插较为困难，染菌率也增加。本试验同样发现，将培养基中蔗糖的量由30g／L减少至26g／L时，大多数组培苗的生长较好，而生长较慢的R1和R11最适的蔗糖含量分别为28g／L和27g／L，生长较快的R3和R5最适的蔗糖含量分别为24g／L和23g／L，同时在上述条件下，组培苗的染菌率也最低（13．50%）。有文献报道在马铃薯脱毒培养中，主要关注的是组培苗组织培养室和接种室的清洁、外植体自身带菌和组织培养过程中各环节操作不适宜或不严格等造成的污染［12］。

本试验在此基础上进行培养基的优化使11个马铃薯鉴别寄主能整齐一致的生长，在同一个时间段达到相同数量和大小的叶片。此外，培养马铃薯鉴别寄主时，母株上每茎段包含一张叶片转接后恢复生长的效果比较好，但在前期的多次试验中发现，携带一张叶片的茎段实际上恢复生长的能力非常弱，适当增加茎段上的叶片数，有利于转接后的恢复生长，当叶片数增加到4时，效果最为明显，组培苗的成活率以及生长状况要比每段茎只包含一个叶片的无菌苗显著增强；同时，为了使11个

鉴别寄主能以相对一致的速度生长，对于生长比较缓慢的R1和R11每个茎段需要5～6片叶，而生长较快的R3和R5每个茎段需要2片叶。这与杨小丽对马铃薯脱毒苗扩繁的研究结果一致，茎节越多存活率越高、生长越快［13］。此外，还发现转接时组培苗茎段长度为3cm、母株培养时间为40d时，转接后组培苗恢复生长的能力较强。

本试验利用经过优化培养条件后的含有11个主效基因的一套鉴别寄主组培苗对2016年采自东北三省马铃薯产区的70株致病疫霉菌株进行了生理小种鉴定。结果显示，优势小种为全谱型生理小种 1．2．3．4．5．6．7．8．9．10．11， 所 占 比 例 为27．13%，并未监测到只能克服单一抗性基因的致病疫霉菌株，这与王腾［14］报道的近几年来在中国各个地区马铃薯致病疫霉复合小种和超级小种的比例显著提高、以及原霁虹［15］报道的马铃薯致病疫霉生理小种呈现出复杂化的趋势、且不同年份不同地方小种出现的类型也不一样的情况相类似，而这可能正是造成部分地区晚疫病越来越严重的根本原因。本实验室连续几年的田间调查表明，在2013—2015年内蒙古海拉尔和牙克石、黑龙江的克山与讷河发病严重的田间，病株率可达100%，减产可达50%以上，病害的发生与危害有逐年加重之趋势。但该病害的发生在年度间的差异较大，主要是因为其与气候条件的关系十分密切，当该地区条件适宜，尤其降雨多、湿度大时病害发生严重。以上情况说明，致病疫霉菌株的生理分化变异十分迅速且极其复杂，在今后相当长的一段时间内，更需要及时、迅速准确地监测致病疫霉生理小种的动态变化规律和发展趋势，同时合理布局对马铃薯晚疫病有不同抗性的马铃薯品种，加强预测预报以及观察和监测田间病害动态，以便最大限度地控制马铃薯晚疫病的发生与危害。

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