中国卫生检验杂志２０１５年６月第２５卷第１２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂ Ｔｅｃ，Ｊｕｎ．２０１５，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．１２ ．１９３５． ・微生物检测方法・ １种沙门菌位相变异实验的方法学研究 侯水平，伍业健，张欣强，胡玉山，吴新伟 广州市疾病预防控制中心，广东广州５１０４４０ 摘要：目的用一种新的位相变异（诱导）实验方法对沙门菌进行血清型鉴定。方法取１滴（约５０ ）诱导血清到直 径６ ｃｍ的平板中，再加入约５ ｍｌ的软琼脂，待凝固后将沙门菌点种到平板。３７℃培养２４ ｈ后，取菌落边缘部分对 Ｈ因子鉴定。同时，按照ＧＢ４７８９．４—＿２Ｏ１０《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的简易平板法、倒 管法和玻管法进行位相变异实验对Ｈ因子进行鉴定。结果 １８４株沙门茵中有１７６株按照本方法确定了血清型，有 １５６株经诱导后得到了另一相Ｈ因子；而用平板法、倒管法和玻管法分别有７７株、１２０株、１１２株确定了血清型。本方法 的诱导成功率远高于国家标准推荐的平板法、倒管法和小玻管法。结论该方法是一种可靠的沙门菌位相变异实验的 方法，可以在日常工作中广泛使用。 关键词：沙门茵；位相变异实验：血清学 中图分类号：Ｒ３７８．２ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—８６８５（２０１５）１２—１９３５—０３ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆ０ｒ ａ Ｓａｌｍｏｎｌｌａ ＨＯＵ Ｓｈｕｉ—ｐｉｎｇ，ＷＵ Ｙｅ—ｊｉａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ—ｑｉａｎｇ，ＨＵ Ｙｕ—ｓｈａｎ，ＷＵ Ｘｉｎ—ｗｅｉ Ｇｎａｎｇｚｈｏｕ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｇｎａｎｇｚｈｏｕ，Ｇ ｎ础ｎｇ ５１０４４０，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎｅｗｐｈａｓｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ．Ｍｅｌｈｏｄｓ Ｔｏ ａｄｄ ｏｎｅ ｄｍｐ（ａｂｏｕｔ ５０ ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）ｏｆ ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｓｉｍｐｌｅ ｐｌａｔｅ ｔｈ ６ ｅｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｐｏｕｒ ５ ｍｌ ｏｆ ｍｅｌｔｅｄ ｓｗａｒｍ ａｇａｒ．Ｓｐｏｔ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆｔｈｅ ｓｉｍｐｌｅ ｐｌａｔｅ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｅｔｔｉｎｇ．Ａｆｔｅｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｔ ３７℃ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ． ｔｏ ｓａｍｐｌｅ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｗａｌ３ｔｎ ｚｏｎｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｈ ｐｈａｓｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，Ｈ ｐｈａｓｅ Ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ， ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｎｉ—ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｂｙ ＧＢ ４７８９．４－－２０１２“Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｖ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｆｏｏｄ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ”．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｏｕｔ ｏｆ １８４ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｔｒａｉｎｓ，１７６ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｆｏｒ ｓｅｒｏ－ ｔｙｐｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｅｄ，１５６ ｏｆ ｔｈｅｍ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｏｔｈｅｒ Ｈ ｐｈａｓｅ．Ａｎｄ ７７，１２０，１ １２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｅａｒｌｙ ｓｅｒｏｔｙｐｅｄ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｎｉ—ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ，ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｅ ｐｌａｔｅ ｍｅｔ｝ｌｏｄ，ｉｎ— ｖｅｒｔｅｄ—ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｉｃｒｏ—ｔｕｂｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｉｎ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｗｏｒｋ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｏｍｎｅｌｌａ；Ｐｈａｓｅ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｓｔ；Ｓｅｒｏｌｏｇｙ 沙门菌的血清学鉴定在肠杆菌科中比较复杂，因 其血清型由０抗原、Ｈ Ｉ相因子和ＨⅡ相因子共同决 １材料与方法 定（有些仅有一相Ｈ因子），目前大约有２ ５００多种血 １．１材料菌株：共１８４株，其中５２株分离于健康 清型…。在日常工作中，沙门菌的血清型分型在沙门 体检人群的肛拭子，３Ｏ株分离于食品污染物监测的食 菌的分型中非常重要，同时经常遇到Ｈ因子没有很好 品，１０２株分离于临床腹泻患者的粪便，并经全自动生 生长而无法分型的现象。并在国家标准ＧＢ ４７８９．４— 化鉴定系统ＶＩＴＥＫ２均鉴定为沙门菌。 ２０１０中推荐了３种位相变异试验方法来诱导另一相 １．２仪器与试剂直径６ ｃｍ的无菌塑料平皿（广东 Ｈ因子。本方法使用诱导血清抑制沙门菌某一相Ｈ 环凯生物科技公司），诱导血清（泰国Ｓ＆Ａ公司，批 因子发育，间接促进其另一相Ｈ因子的生长，从而可 号：３７５３）和鉴定血清（泰国Ｓ＆Ａ公司，批号：３５７９）， 以很好地鉴定其血清型。 ０．５％软琼脂（本中心培养基室于２０１４年５月１０日 配制，有效期３个月）。 １．３方法用接种环取１环菌株划线接种在软琼脂 基金项目：广州市医学重点学科建设项目（２０１３—２０１５—０７） 斜面上，３７℃培养２４ ｈ后，取斜面上菌苔进行血清凝 作者简介：侯水平（１９８１一），男，硕士，主管技师，主要从事病原生 集实验，得出此沙门菌的Ｏ群和某一相Ｈ因子；在无 物学方面的研究。 菌平板上滴１滴（约５０ １）已经凝集的Ｈ因子诱导 通讯作者：吴新伟，Ｅ—ｍａｉｌ：３１１４３６５＠ｑｑ．ｃｏｍ 血清，将０．５％的软琼脂完全融化后，冷至４５℃～ 中国卫生检验杂志２０１５年６月第２５卷第１２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂ Ｔｅｃ，Ｊｕｎ．２０１５，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．１２ 期细菌分离培养和鉴定的工作量，提高阳性检出率， 减少人为误差。一次性多功能采样管的应用也减少 了玻璃器皿的重复使用，减轻了清洗、灭菌等辅助环 节的工作量，降低了辅助环节污染风险与实验室环境 污染风险。在从业人员检钡４过程中，实时荧光ＰＣＲ 法的应用可以显著缩短报告出具时间。 实时荧光ＰＣＲ技术具备快速化、自动化与客观 性，是现代化检测手段的发展趋势，但其普遍应用则 存在局限，检测环境要求较高，需要配备实时荧光 ＰＣＲ仪，试剂耗材成本比传统培养法更高，尤其是本 实验所采用的十字交叉定位法，试剂成本耗费更多。 若将其作为大批量样本的筛查手段，以其检测效率 高、劳动强度小、检测结果客观准确等优势，在规模化 检测与突发公共卫生事件处理过程中值得推广应用。 参考文献 ［１］ 中华人民共和国卫生部．ＷＳ ２７１—２００７感染性腹泻诊断标准 ［ｓ］．北京：人民卫生出版社，２００７． ｆ２］ 中华人民共和国卫生部．ＷＳ ２８７－－２００８细菌性和阿米巴性痢 疾诊断标准［ｓ］．北京：人民卫生出版社，２００８． ［３］Ｌｉ Ｑ，ｔａｎｇ Ｊ，ＬｕａｎＧ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ—ｂａｓｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅ－ ＯＵ８￣ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ 『Ｊ］．Ａｎａｌ Ｓｃｉ，２０００，１６（２）：２４５—２４８． ［４］ 石晓路，扈庆华，张佳峰，等．多重实时ＰＣＲ快速同时检测沙门 菌和志贺菌［Ｊ］ 中华流行病学杂志，２００６，２７（１２）：１０５３— １０５６． ［５］ 丁水军，陈棋炯，孙永祥，等．方阵式荧光ＰＣＲ在从业人员肠道 致病菌筛查中的应用［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２０１４，２４（１１）： １５７６—１５７８． 『６］ 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．ｗｓ／Ｔ ４５４－－２０１４ 从业人员预防性健康检查沙门菌、志贺菌检验方法［ｓ］．北京： 中国标准出版社，２０１４． ［７］汪武新，韦炳扬，刘海文，等．荧光ＰＣＲ快速检测从业人员肠道 致病菌结果分析［Ｊ］．中国热带医学，２０１１，１１（８）：９７１—９７２． ［８］ 王琳，江鹏飞，李贻汉，等．荧光ＰＣＲ在基层从业人员带菌检测 中应用的可行性评价［Ｊ］．中国卫乍榆验杂志，２０１３，２３（３）： ６６４—６６６． 收稿日期：２０１４—１１—２７ （上接第１９３６页） 如果菌株量较大则非常耗时。因此，本方法更适合在 日常工作中应用。目前，对沙门菌位相变异实验的方 法研究较少，有王海燕等采用血平板一搭桥法和傅丹 青等采用５０％琼脂浓度法 ］。 在实践中还发现，热风循环式的孵箱的湿度很 低，不利于沙门菌的鞭毛在软琼脂上生长，甚至还会 造成软琼脂干裂。所以通常将试验的平皿放入一个 湿盒中（一边放人平皿，一边有少些水）或者放人纸盒 （纸盒底部铺上蘸水的纸巾），然后再放入孵箱中培 养。同时建议国标ＧＢ ４７８９．４－－２Ｏ１０附录Ｂ中扩 大沙门菌血清表的范围，并补充血清表内符号的说 指该Ｏ因子是由噬菌体溶原化产生的 ］。 参考文献 ｌ １］ Ｇｒｉｍｏｎｔ ＰＡＤ，Ｗｅｉｌｌ Ｆ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｅｒｏ． ｖａｒ８：９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎｅｄ［Ｍ］．Ｐａｒｉｓ：ＷＨＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＲｅｆ－ ｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，２００７，１ ３． ［２］ 中华人民共和国卫生部．ＧＢ ４７８９．４ ０１Ｏ 食品安全国家标 准食品微生物学检验沙门氏菌检验［ｓ］．北京：中国标准出版 社，２０１０， ［３］ 王海燕，宋曼丹，赖蔚莓，等．血平板一滤纸条搭桥法在沙门菌 血清分型中的应用［Ｊ］．华南预防医学，２０１１，３７（２）：７５—７７． ［４］傅丹青，孙永祥，丁水军．营养琼脂斜面法在沙门菌“Ｈ”抗原位 相变异中的应用［Ｊ］．预防医学论坛，２００９，１５（１２）：１２９１— １２９２． 明：｛｝符号指血清型中｛｝内的因子具有排他性，不能 与其他｛｝内的因子同时存在。［］符号表示在野生菌 株中罕见。（）指Ｏ或Ｈ因子仅有弱凝集。一下划线 ［５］朱超，许学斌．沙门菌属血清学诊断［Ｍ］．上海：同济大学出版 社，２００９：２８８—２８９． 收稿日期：２０１４—１１—２７
