91李 燕１
（１．集美大学生物工程学院王锡昌２
２．上海水产大学食品学院
本文研究了白鲢鱼肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ， ＭＢＳＰ）的作用
６０
肌动蛋白和原肌球蛋白的分解
提示该酶为需金属离子激活的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶
肌原纤维
分解
免疫印迹
长时间加热也导致
丝氨酸蛋白酶抑制剂
（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ和利马豆胰蛋白酶抑制剂）及金属蛋白酶抑制剂ＥＤＴＡ有效抑制了肌球蛋白重链的分解
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎ Ｓｉｌｖｅｒ Ｃａｒｐ
ＣＡＯ Ｍｉｎ－ｊｉｅ１
ＷＥＮＧ Ｌｉｎｇ１
２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ６０
－ａｃｔｉｎｉｎ， ａｃｔｉｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ｔｏ
ｓｏｍｅ ｄｅｇｒｅｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ． Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ ａｎｄ Ｌｉｍａ ｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ａｎｄ ＥＤＴＡ ｇｒｅａｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ， ｗｈｉｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ， ａｎｄ ａｓｐａｒａｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗ ａｎｙ ｅｆｆｅｃｔ． Ｔｈｅｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗａｓ ａ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ （ＭＢＳＰ） ｔｈａｔ ｎｅｅｄｅｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ（ｓ） ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｑ９３９．９１ 文献标识码
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１００２－６６３０（２００５）０１－００９１－０４
６０
此种现象也被
称之为凝胶劣化
更影响其商品价值
鱼糜制
ＭＨＣ）分解
迄今为止
国内外从生物化学角度对鱼类ＭＢＳＰ的研
究进行得很少１．该类酶与
６］
品凝胶形成能下降主要是组织蛋白酶作用所造成的［１，２］
组织蛋白酶类（如Ｂ， Ｈ， Ｌ等）皆来自溶酶体
由于鱼糜制品制作工艺中需经多次
漂洗最后产品中水溶性蛋白酶的残留量应相当少此类酶在中性或弱碱性条件下的活性已受到极大抑制
由于组织蛋白酶的
作用而引起鱼糜制品凝胶劣化的解释在理论上难于说明鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ， ＭＢＳＰ）的作用可能是造成肌原纤维蛋白质
收稿日期
曹敏杰（１９６４－）
教授
肌原纤维蛋白牢固结合而很难解离
我国是淡水鱼养殖大国２００１年我国鲢鱼的产量已达到４９０万吨制作鱼糜制品是淡水鱼加工利用的一个必然方向
因此
那么就有可能找到有效抑制ＭＢＳＰ活
性的食品添加剂从而提高淡水鱼糜制品的弹性
为我国淡水鱼加工利用带来一定的理论指导
主要从事生物化学及分子生物学研究
2005, Vol. 26, No. 1食品科学基
－辅肌动蛋白我们对肌原纤维在５５鲢鱼肌原纤维在５５
４ｈ
泳后
抗原抗体反应后分析蛋白质的降解情况
去皮
冰箱待用
仍然有
Ｅ－
对肌原纤维蛋白
表明鲢鱼肌原纤维中存在一种结合型的蛋
白酶（图１））和较高温度（７０此分解现象较不明显６０
１电经
本性质及其对肌原纤维蛋白质的分解作用
６４和ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ来自上海生工
大鼠抗鲤鱼肌动蛋白
－辅肌动蛋白及
教授提供抗鲤鱼原肌球蛋白抗体由日本长崎大学水产学部原研治
其他的试剂均为分析纯或化学纯
Ｂｅｃｋｍａｎ组织捣碎机（ＰＴ２１００
凝胶成像仪（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ恒温水浴（Ｍｅｍｍｅｒｔ垂直电泳槽及电转移装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，美国）等
条件下进行
捣碎后的溶液在８０００
弃除上清液组织捣碎机捣碎
再重复以上清洗过程３次
ｇ离心１０ｍｉｎ
Ｍ６０
１
６， ７０
２， ４０
３， ５０
４， ５５
５，．
四种主要肌原纤维蛋白的位置以箭头标示
； ３， ５０； ５， ６０
Ａｒｒｏｗｈｅａｄｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍａｊｏｒ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
图１ 鲢鱼肌原纤维蛋白在不同温度下的自我分解（２ｈ）Fig.1 Degradation of silver carp myofibrillar proteins at
different temperatures for 2h
制备的肌原纤维蛋白
或立即用于实验或存放于－７０１．４
白鲢肌原纤维在不同温度下的自我分解作用取肌原纤维１００分别在４０５５７０样品经ＳＤＳ化后上样于１２％浓度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ［９］１．５
各种蛋白酶抑制剂对结合型蛋白酶的作用取肌原纤维１００
室温反应３０ｍｉｎ后转入样品经ＳＤＳ化后上样于
为了进一步查明引起肌球蛋白重链分解的酶属何种性质的蛋白酶
如图２所示
ＬＢＴＩ和金属蛋白酶抑制剂
ＥＤＴＡ有效地抑制了ＭＨＣ的分解
由此得知引起鲢鱼肌原纤维蛋白分解
的蛋白酶极可能与来自鲤鱼［７］及狗母鱼［８］的ＭＢＳＰ一样
又由于该酶活性受ＥＤＴＡ的抑
制推测金属离子对该酶的活性有相当重要的作用
５５
此结果也表明鲢鱼ＭＢＳＰ在５５
５５
１２％ 浓度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
从而了解结合型蛋白酶的性质
万方数据93如图４所示
动蛋白的显著分解
作用有较强的抵抗性［１］弱
－辅肌
肌动蛋白对蛋白酶的
尽管肌动蛋白的蛋白带随加热时间的延长而逐渐减
－辅肌动蛋白和原肌球蛋白相比
免疫印迹的结果也显示
ＭＢＳＰ对原肌球蛋白的分解作用原肌球蛋白几乎被完全分解
标准分子量对照 （０ｈ）５， Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ７， 对照（５５
３， ＬＢＴＩ
Ｍ， ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １， ｃｏｎｔｒｏｌ （１ｈ）； ２， Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ； ３， ＬＢＴＩ； ４， Ｅ－６４； ５，Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ； ６， ＥＤＴＡ； ７， ｃｏｎｔｒｏｌ （５５
标准分子量对照 （０ｈ）３， ２ｈ
Ｍ， ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １， ｃｏｎｔｒｏｌ （０ｈ）； ２， １ｈ； ３， ２ｈ； ４， ４ｈ．
图４
免疫印迹法检测
球蛋白的分解（５５
肌动蛋白和原肌
-
actinin, actin and tropomyosin at 55
标准分子量对照 （０ｈ）３， ２ｈＭ， ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ； １， ｃｏｎｔｒｏｌ （０ｈ）； ２， １ｈ； ３， ２ｈ； ４， ４ｈ．
对于鱼类的ＭＢＳＰ的研究早在三十多年前由日本研究者开展， 但由于ＭＢＳＰ与肌原纤维蛋白强烈结合和含量低等原因
因此，分离纯化ＭＢＳＰ并研究其性质的工作很少有人进行
用Ｂｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ作底物得狗母鱼和鲤鱼ＭＢＳＰ的最适温度均为５５最适ｐＨ值为８．０
ＭＢＳＰ明显地受到丝氨酸蛋白酶抑制
剂（Ｐｅｆａｂｌｏｃ．ＳＣａｐｒｏｔｉｎｉｎ
同性质的酶最近在仓鼠［１１］中也被
发现３
结 论
不同加热时间下的分解
Fig.3 Time-course degradation of silver carp myofibril-lar proteins at 55
肌球蛋白重链（ＭＨＣ）是分子量为２０万的大分子蛋白质而对于分子量相对较小的其它结构蛋白如
肌动蛋白（分子量４．３万）和原肌球蛋白（分子
量３．４万）的分解则由于ＭＨＣ等大分子分解产物的影响难
在本研究中我们利于通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ作判断
用了针对此三种蛋白的抗体来检测它们由内源性蛋白酶ＭＢＳＰ引起的分解
－辅肌动蛋白在肌原纤维中所占的比例很少
迄今为止鲜有报道
由以上研究得知鲢鱼肌肉中存在肌原纤维结合型蛋白酶６０该酶的活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂及ＥＤＴＡ的抑制
2005, Vol. 26, No. 1食品科学泰山赤灵芝液体培养条件优化及多糖含量测定
姚良同
李 娟
赵 倩
山东 泰安 ２７１０１８）
氮源
其配方组成（质量分数ｐＨ５．０
结ＫＨ２ＰＯ４分别是子
摘 要果表明氮源
７Ｈ２Ｏ ０．０５０．１
实体和孢子粉的２．５和２．２倍
泰山赤灵芝
蛋白胨
蛋白胨０．３液体培养
Ａｓｓａｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｏ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ＹＡＯ Ｌｉａｎｇ－ｔｏｎｇ
ＬＩ Ｊｕａｎ
ＺＨＡＯ Ｑｉａｎ
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｐＨ ｔｏ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ
ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｐＨ ｗｅｒｅ ｓｕｃｒｏｓｅ， ｐｅｐｔｏｎｅ ａｎｄ ｐＨ５．０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ： ＫＨ２ＰＯ４ ０．１， ＭｇＳＯ４
ｂｒｅａｍ ｇｅｌ［Ｊ］． Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９８８， ５２： ２２５－２２７．主要从事食药用真菌多糖研究
［６］Ｃａｏ Ｍ Ｊ， Ｈａｒａ Ｋ， Ｏｓａｔｏｍｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅＭＢＳＰ对ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ （ＭＢＰ） ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ， １９９９， ６４： ６４４－６４７．肌原纤维蛋白， ｐＨ８．０条件
［７］Ｏｓａｔｏｍｉ Ｋ， Ｓａｓａｉ Ｈ， Ｃａｏ Ｍ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃ－下产生显著的分解作用
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｃａｒｐｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｍｕｓｃｌｅ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９７， １１６Ｂ： １８３－１９０．参考文献
［８］Ｃａｏ ＭＪ， Ｏｓａｔｏｍｉ Ｋ， Ｈａｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ－
ｂｏｕｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｒｉｎａｓ（ＭＢＳＰ）ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｌｉｚａｒｄｆｉｓｈ Ｓａｕｒｉｄａ ｗａｎｉｅｓｏ ｗｈｉｃｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖｅｓ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅｓｉｔｅ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０００， １２５Ｂ： ２５５－２６４．
［９］Ｌａｅｍｍｌｉ． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， １９７０， ２２７： ６８０－６８５．［１０］Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ， Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ Ｔ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，
）ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｃｒｏａｋｅｒ ｍｙｏｓｉｎ１９７９， ７６： ４３５０－４３５４．
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｕｌｌ Ｊｐｎ Ｓｏｃ Ｓｃｉ Ｆｉｓｈ， １９８６， ５２： ２０２７－２０３２．［１１］Ｈｏｌｔ Ｊ Ｃ， Ｈａｔｃｈｅｒ Ｖ Ｂ， Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ Ｊ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ［４］［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ， １９９０， ５２： ３６４－３６８．ｏｖａｌ－ｆｉｌｅｆｉｓｈ ｍｅａｔ ｇｅｌ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｙｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ｓ）Ｔｏｙｏｈａｒａ Ｈ， Ｓａｋａｔａ Ｔ， Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆｃＤＮＡ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ［５］Ｔｏｙｏｈａｒａ Ｈ， Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ． Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｏｄｏｒｉ ｐｈｅ－ｆｒｏｍ ｍｙｏｐａｔｈｉｃ ｈａｍｓｔｅｒｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９８， １８１：
ｎｏｍｅｎｏｎ ａｎｄ ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎ ｔｈｒｅａｄｆｉｎ－１２５－１３５．
２００３－１２－２３ ＊通讯作者作者简介男
