动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化
一、超氧化物歧化酶的提取 [原理]
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤： （1）原材料的预处理； （2）粗酶液的制备； （3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为： 第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白； 第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀； 第三步，离子交换柱层析精制。 [试剂和器材] 1、试剂
3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠 ；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮 ；pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液 ；DEAE-Sephadex A-50 2、器材
猪血；恒温水浴 ；离心机 ；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋 [方法和步骤]
1、从猪血中提取SOD （1）分离血球
取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。 （2）除血红蛋白
红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
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（3）热变性
上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （4）沉淀
清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 二、离子交换层析纯化超氧化物歧化酶 [原理]
本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。实验中选用DE-32离子交换纤维素。
相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。 [试剂和器材] 1、试剂
DE-32 ；缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） ；缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 2、器材
层析柱(2.5cm × 25cm)；部分收集器 ；梯度洗脱仪；紫外分光光度计；试管、透析袋 [方法和步骤]
1、DEAE-纤维素的预处理：
（1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。
（2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。
（3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。
（4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。
（5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。用0.5mol/L
盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。
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（6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。 2、装柱
（1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。
（2）将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液（约有1倍体积的缓冲液I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高10cm以上的柱床体积。 3、平衡
当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡8h以上或过夜。） 4、层析
用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液Ⅰ恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤2～3次，然后装入缓冲液Ⅰ，使液面高出创面2～3 cm左右。 5、洗脱
（1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。
（2）在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混合器）内各装入100mL缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。 （3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。
（4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在1.5mL／min。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。
（5）收集合并具有SOD活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）。
三、超氧化物歧化酶的活性测定
SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O2 -)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用
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前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 [原理]
SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到。亚盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色（昆类物质），几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。 [试剂和器材] 1、试剂
（1）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl ；称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶
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解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/L HCl
（3）50 mmol/L邻苯三酚：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液 2、器材
恒温水浴槽；紫外分光光度计；试管、刻度吸管、微量注射器 [方法和步骤]
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活
（1）邻苯三酚自氧化速率测定
按表1自氧管加样。取4.5mL 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2mL蒸馏水和1mL，10mmol/L 的EDTA溶液，混匀后在25℃水浴保温20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚溶液0.3mL，迅速摇匀，倒入光径为1cm的比色杯内，用10mmol/L HCl 作空白，325nm波长下每隔30秒钟测光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325nm的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。
表1 邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活试剂用量表 试剂
pH8.3，50mmol/L的PBS 蒸馏水
10mmol/L EDTA溶液 SOD酶液
3mmol/L邻苯三酚溶液
总量
(2) 酶活力测定
按表1酶活管加样，操作与上面基本相同，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
(3)酶活性单位的计算
根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：
A0AM100A0样液稀释倍数酶活（U/mL）反应液总体积
50%样液体积自氧化管(mL) 4.5 4.2 1.0 —— 0.3 10.0
酶活管(mL) 4.5 4.0 1.0 0.2 0.3 10.0
终浓度（mmol/L）
22.5 —— 1.0 0.09 ——
式中：A0为邻苯三酚自氧化率；
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AM为加酶后邻苯三酚自氧化率；
总酶活力（U）=单位酶活×酶原液总体积。
四、实验报告要求
实验目的、原理、方法、数据记录及数据处理、实验分析等几项外，实验报告字数需达2000字以上。
分析项目：测定粗酶液、每级纯化酶液的蛋白质含量及酶活；鉴定柱层析后酶液的纯度；以低分子量Marker蛋白作对照，测定SOD的分子量。计算各级回收率及纯化倍数。
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