第３４卷第２期 ２０１７年４月 皮 革 与 化 工 ＬＥＡＴＨＥＲ ＡＮＤ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ Ｖｏ１．３４ ＮＯ．２ Ａｐｒ．２０１７ 蛋白水解物水解度测定方法的研究 罗艳华 ，王全杰１ ，陈沛海２，高翔３， （１．陕西科技大学，陕西西安７１００２１； ２．烟台大学，山东烟台２６４００５；３．江南大学，江苏无锡２１４１２２） 摘要：本文通过ＴＮＢＳ法、ＯＰＡ法、茚三酮比色法三种方法对革屑水解物、乳清蛋白水解物和毛发水解物的水解 度进行了测定。结果表明：三种方法在测量革屑水解物和乳清蛋白水解物的水解度时结果比较接近，茚三酮法 和ＯＰＡ法略低；但在测量毛发水解物时ＯＰＡ法的测量结果明显小于ＴＮＢＳ法和茚三酮法；同时茚三酮法吸光 度波动较大，不稳定；ＯＰＡ法和ＴＮＢＳ法的测定结果更能接近实际的游离氨基浓度，从而水解度的计算更准确， 而且ＯＰＡ法操作更简便，反应时间更短。 关键词：蛋白质；水解度；游离氨基；ＯＰＡ法；ＴＮＢＳ法；茚三酮法 中图分类号：ＴＱ９３６．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—０９３９（２０１７）０２—００２６—０６ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ Ｄｅ ｇｒｅｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＬＵ０ Ｙａｎ－ｈｕａ ，ＷＡＮＧ Ｑｕａｎ－ｊｉｅ ， ，ＣＨＥＮ Ｐｅｉ－ｈａｉ ，ＧＡＯ Ｘｉａｎｇ （ ．Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ＂ａｎ ７１００２１．Ｃｈｉｎａ； ２．Ｙａｎｔａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ ２６４００５，Ｃｈｉｎａ，＂３．Ｊｉｎｇｎａａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｔｈｅｒ ｓｃｒａｐｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ａｎｄ ｈａｉｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＴＮＢＳ，ＯＰＡ，ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｅｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｃｌｏｓｅ ｉｎ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｔｈｅｒ ｓｃｒａｐｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，Ｉｎｄｅｎｅ ｔｈｒｅｅ ｋｅｔｏｎｅ ａｎｄ ＯＰＡ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｌｏｗｅｒ；ｂｕｔ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＯＰＡ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈａｉｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈｅ ＴＮＢＳ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｉｎｄｅｎｅ ｋ＇ｅｔｏｎｅ ｍｅｔｈｏｄ；ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，Ｙｉｎ ｔｈｒｅｅ ｋｅｔｏｎｅ ａｂｓｏｒｂａｎｅｅ ｆｌｕｃｔｕａｔｅｄ ｗｉｄｅｌｙ，ｕｎｓｔａｂｌｅ；ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＯＰＡ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＴＮＢＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｕａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ＳＯ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｍｏｒｅ ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ＯＰＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｓｈｏ￣ｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ；ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ；ＯＰＡ；ＴＮＢＳ；ｎｌｎｈｙｄｎ—ｎ 我国是制革大国、食品大国，伴随着我国经济高 速发展，我国的这些工业发展越来越迅速。同时，制 革和食品工艺中需要将蛋白质水解以便于更好地利 用，因此蛋白质水解度测定方法的研究至关重要。 蛋白质的水解度是在蛋白质被催化水解时所裂 解的肽键数目的基础上来表示蛋白质的水解情况， 它的定义为：蛋白质分子水解断裂的肽键占蛋白质 分子中总肽键的比例。目前测定水解度的方法有许 收稿日期：２０１７—０２一ｌ７ 基金项目：烟台市重点研发计划，新型高效泡沫混凝土发泡剂的研发及产业化（２０１５ＳＦ０５２） 作者简介：罗艳华（１９９３一），女，陕西科技大学硕士研究生，１４３０７８６４５７＠ｑｑ．ｃｏｎ 通讯联系人：王全杰（１９５０一），男，烟台大学教授，主要研究废革屑的资源化利用，ｗａｎｇｑｕａｎｊｉｅ＠１２６．ｃｏｉｎ 第２期 罗艳华，等：蛋白水解物水解度测定方法的研究 １．１．２主要仪器 －２７・ 多，常用方法有：ＯＰＡ法、ＴＮＢＳ法、ＴＣＡ法、ｐＨ—Ｓｔａｔ、 甲醛固定法、茚三酮比色法等㈦，但鲜有关于以上各 种测试方法的准确性以及适用范围的相关研究报 主要实验仪器如表２所示。 表２实验仪器设备 Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ 道。本实验选择ＯＰＡ法、ＴＮＢＳ法、茚三酮法和 ｐＨ—Ｓｔａｔ法进行比较，目的在于寻找各种方法的适用 条件以及优缺点。本文先分别采用上述四种方法测 仪器名称 型号 生产ｒ蒙 增力电动搅拌器 电热恒温水浴锅 ＪＪ一１ ＨＨ龙１：７市先进仪器有限公司 河南郑州南北仪器设备有限 定其游离氨基浓度和吸光度的关系，绘制标准曲线， 最后求出革屑水解物、毛发水解物、乳清蛋白水解物 的水解度，并且进行纵向比较，分析四种方法之间的 异同、准确性、优缺点以及适用范围，从而可以为其 他需要用到蛋白质水解度测定方法的研究人员提供 一定的参考。 １ 实验部分 １．１ 主要实验试剂与仪器 １．１．１主要试剂与材料 主要实验试剂如表１所示。 表１实验试剂表 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅａｇｅｎ￣ 药品名称 型号 生产ｒ莽 氧化钙 分析纯 天津市登科化学试剂有限公司 铬革屑 工业品 河北辛集制革厂 Ｌ一亮氨酸 生物试剂 上海源叶生物科技有限公司 甘氨酸 生物试剂 上海蓝季生物科技有限公司 邻苯二甲醛 分析纯 上海源叶生物科技有限公司 （ＯＰＡ） 无水乙醇 分析纯 天津市巴斯夫化工有限公司 十二烷基硫酸钠 分析纯 天津市光复精细化工研究所 二硫代苏糖醇 生物试剂 上海源叶生物科技有限公司 三硝基苯磺酸 分析纯 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限 （ＴＮＢＳ） 公司 磷酸二氢钠 分析纯 天津市登科化学试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 西陇化工股份有限公司 盐酸 分析纯 烟台三和化学试剂有限公司 碘酸钾 分析纯 天津市巴斯夫化工有限公司 乙酸钠 分析纯 烟台三和化学试剂有限公司 冰乙酸 分析纯 天津市富字精细化工有限公司 茚三酮 分析纯 上海山浦化工有限公司 四硼酸钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 乳清蛋白 生物试剂 上海源叶生物科技有限公司 Ａ１ｃａｌａｓｅ碱性 生物试剂 丹麦ＤＥＦＥ公司 蛋白酶 —Ｓ 公司 循环水多用真空 泵 ＳＨＺ－Ｄ（３） 巩义市予华仪器有限公司 电子天平 ＪＪ２２４ＢＣ 常熟市双杰测试仪器厂 燥箱 电热恒温鼓风干 ＤＨＧ－９０７３ 上海山连仪器厂 ｐＨ计 ｐＨＳ一３Ｅ 公司 上海仪电科学仪器股份有限 消解仪 ｒＹＰＥ ＳＰＴ１２ 北京三品科创仪器有限公司 凯氏定氮仪 ＳＰＤ－５０ 北京三品科创仪器有限公司 紫外分光光度计 ＪＨ一７５２ 上海菁华科技仪器有限公司 １．２蛋白水解液的制备 １．２．１革屑水解液的制备 现如今，对于铬革屑的处理主要是通过水解来 提取里面丰富的胶原蛋白。碱水解法具有脱铬效率 高、应用价值大、工业化大生产难度低的特点，是研 究最早的一种铬革屑处理方法，故而本实验采用 ＣａＯ作为水解试剂，其具有价格低廉、原料易得等优 点。 具体实验工艺如下：按照革屑和水固液比１：１０ 的比例取样，氧化钙用量选择为革屑质量的８％，水 解时间定位８ ｈ，水解在８Ｏ℃下进行。 １．２．２毛发水解液的制备 参考含铬革屑的水解工艺，用ＣａＯ来水解毛发 废弃物，由于毛发内部含有双硫键，对碱水解的稳定 性较好，故采用Ｎａ２Ｓ、Ｎａ２ＳＯ 来打开毛发的双硫键， 与ＣａＯ共同作用水解毛发角蛋白。 具体实验工艺如下：分别量取１５ ｇ毛发于三口 烧瓶中，ＣａＯ用量３０％，固液比１：１７，水解温度为 ８０％，水解时间２２ ｈ，Ｎａ２Ｓ和Ｎａ２ＳＯ 分别为１０％。 １．２．３乳清蛋白水解液的制备 称取１ ｇ乳清蛋白加入１００ ｍＬ ｐＨ值为９．０的 ＮａＯＨ溶液震荡搅拌溶解，加人Ａｌｃａｌａｓｅ碱性蛋白酶 ０．２５ ｍＬ，在５０￣Ｃ恒温水浴箱中水解１个小时，保持 水解过程中溶液ｐＨ值始终为９．０。水解结束后调节 ｐＨ值为４．５，加热使酶失去活性，高速离心后收集上 清液即可ｌ ３］。 ・２８・ 皮革与化工ＬＥＡＴＨＥＲ ＡＮＤ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ 第３４卷 １．３ ＯＰＡ法标准曲线的绘制 １．４．３缓冲液的配制 参考林虬Ｉ４ ｌ等人ＯＰＡ法测棉籽蛋白水解物水解 度的方法，其配制的ＯＰＡ溶液中所加入的十二烷基 硫酸钠过多，在温度较低的环境里往往测量吸光度 还未结束，ＯＰＡ溶液在比色皿中就已经结晶析出， 导致吸光度不能继续测量。本实验采用的ＯＰＡ法在 准确称取３．３１５２ ｇ磷酸二氢钠，加入１００ ｍＬ去 离子水，搅拌使其充分溶解。用氢氧化钠粉状微调 ｐＨ至８．２。 １．４．４终止液的配制 本实验终止液选择为０．１ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液。 林虬等人的基础上加以改进，使其测量更方便、精 确。 １．４．５标准溶液吸光度的测定 将紫外可见分光光度计波长调至３４０ ｎｍ，取０、 １．３．１标准溶液的配制 １、２、３、４、５号待测溶液各１ ｍＬ于６支比色管中，分 用电子天平准确称取０．３２７９５ ｇ Ｌ一亮氨酸于 １０００ ｍＬ容量瓶中定容，再分别取０、０．２、０．４、０．６、 Ｏ．８、１．０ ｍＬ该溶液至６支２５ ｍＬ比色管中定容至 ２５ ｍＬ，并按浓度高低分别编号０、１、２、３、４、５号。 １．３．２ ＯＰＡ溶液的配置 取８０ ｍｇ ＯＰＡ用２ ｍＬ无水乙醇于黑暗处避光 溶解，再取１．９０６８ ｇ四硼酸钠、０．１ ｇ ＳＤＳ（十二烷基 硫酸钠）、８８ ｍｇ ＤＴＩ＂（二硫代苏糖醇）加水溶解。然 后全部转移至１００ ｍＬ棕色容量瓶中加水定容。 １．３．３标准溶液吸光度的测定 ＯＰＡ法测吸光度的具体方法如下：先将紫外可 见分光光度计波长调至３４０ ｎｍ，移取０．４ ｍＬ待测 液、３ ｍＬ ＯＰＡ溶液至比色皿中，同时用秒表开始计 时。若为空白对照组，当秒表计时至２ ｍｉｎ时，调吸 光度为０；然后按此法依次测其余５组溶液２ ｍｉｎ时 的吸光度，并绘制标准曲线。 １．４ ＴＮＢＳ法标准曲线的绘制 参考周慧江等人以及Ａｄｌｅｒ—Ｎｉｓｓｅｎ等人ＴＮＢＳ 法测吸光度的方法并加以改进［５１：由于磷酸二氢钠和 磷酸氢二钠配成的ｐＨ＝８．２的缓冲溶液配制过程过 于麻烦，本实验改为磷酸二氢钠和氢氧化钠制成的 ｐＨ＝８．２的缓冲液。另本实验在避光反应－－ｓｌ，时之后 直接进行吸光度的测定，中间不再冷却２０ｍｉｎ，因为 在实验过程中发现冷却２０分钟反而会使实验结果 不稳定。 １．４．１标准溶液的配制 准确称取０．３２７９５ ｇ Ｌ一亮氨酸于１０００ ｍＬ容量 瓶中加水定容，再分别取０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ 该溶液至６支２５ｍＬ比色管中定容至２５ ｍＩ ，并按浓 度高低分别编号０、１、２、３、４、５号。 １．４．２ ＴＮＢＳ溶液的配制 取１ ｍＬ ５％（ ，）ＴＮＢＳ溶液于１００ ｍＬ棕色容 量瓶中加水定容。 别加入１ ｍＬ缓冲液、１ ｍＬ ＴＮＢＳ溶液，盖好塞子于 ５０￣Ｃ水浴箱中避光反应１小时。 反应结束后，立即向六支比色管中加入２ ｍＬ终 止液，震荡混匀后再向每支比色管中加入５ ｍＬ去离 子水，继续震荡使其混合均匀。 将０号空白样的吸光度调０，然后依次测出１、 ２、３、４、５号样品的吸光度。 １．５ 茚三酮法标准曲线的绘制 参考刘慧燕 等人的茚三酮法测牛肉中游离氨 基酸的测定方法，并加以改进。原方法中使用磷酸氢 二钠和磷酸二氢钠缓冲体系，然而在实际操作中使 用此体系实验并不理想，空白样经常显色，故本实验 选择乙酸钠和乙酸缓冲体系，很好地解决了空白样 显色的问题；另由于茚三酮溶液比较灵敏，故选择用 无水乙醇代替９５％乙醇配制茚三酮及碘酸钾溶液， 用蒸馏水代替去离子水。 １．５．１标准溶液的配制 准确称取０．１ ｇ甘氨酸于１００ ｍＬ棕色容量瓶中 定容，再分别取０、１、２、３、４、５ ｍＬ该甘氨酸溶液 于６支１００ ｍＬ容量瓶中定容，并按浓度从小到大依 次编号为０、１、２、３、４、５号。 １．５．２茚三酮溶液的配制 准确称取０．５ ｇ茚三酮用无水乙醇溶解于 １００ ｍＬ棕色容量瓶中定容。 １．５．３ 缓冲液的配制 ｐＨ ６．８的乙酸钠一乙酸缓冲液的配制：０．２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸钠溶液、０．３ ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液按照８．６：１．４的比 例混合两种溶液，并用该两种溶液微调ｐＨ至６．８Ｏ。 １．５．４ 碘酸钾溶液的配制 准确称取０．１ ｇ碘酸钾加入３０ ｍＬ蒸馏水溶解， 再加入２０ ｍＬ无水乙醇并使其混合均匀。 １．５．５’标准溶液吸光度的测定 取１ ｍＬ上述６组标准溶液分别置于６支比色 第２期 罗艳华，等：蛋白水解物水解度测定方法的研究 ・２９・ 管中，再依次加入１ ｍＬ缓冲液、１ ｍＬ茚三酮溶液， 封好摇匀后放人沸水浴中加热１５ ｍｉｎ，然后取出放 到冷水中冷却１５ ｍｉｎ。 上述过程结束以后，向每支比色管中分别加入 ５ｍＬ碘酸钾溶液，并用蒸馏水定容至１０ ｍＬ。 将紫外可见分光光度计波长调至５６８ ｎｍ，将０ 号比色管中的空白样吸光度调为０，然后依次测出 其他５组样品的吸光度。 １．６ ｐＨ—ｓｔａｔ法测水解度 参考袁斌等人的简易ｐＨ—ｓｔａｔ法测水解度的方 法 ：水解开始时，调节反应体系的ｐＨ为７．０，反应 结束后测定反应体系的ｐＨ值，并用０．５ ｍｏｌ／Ｌ的氢 氧化钠将反应体系的ｐＨ调到原来的ｐＨ，记录下所 用的碱液的量。但由于本实验采用废革屑为水解原 料，体系ｐＨ为７．０时并不能进行水解，故将袁斌等 人的实验方案进行微调：水解开始时，调节体系ｐＨ 为１２，反应结束以后将体系的ｐＨ调回ｌ２，记录下 所用碱液的量。 在水解过程中发现ｐＨ—ｓｔａｒ法测水解度并不适 用此体系。分析原因：铬革屑在用碱水解时所含铬离 子会与氢氧根反应产生沉淀，导致在反应结束以后 用氢氧化钠调回原来的ｐＨ时，碱的量大大增加，最 后测得的水解度远比实际的水解度要大，此方法不 适用于含铬革屑的水解体系。 １．７ 水解液氦含量的测定 １．７．１消解 （１）取一定量样品加入消解管中，再加入５滴饱 和ＣｕＳＯ４、０．３ ｇ Ｋ２ＳＯ４及５ ｍＬ的浓Ｈ２ＳＯ４。 （２）将消解管安放在消解炉上，管口处扣上玻璃 小漏斗。 （３）打开通风厨，对消解炉进行各项设置。 （４）在【运行】主窗口下，选择曲线分段加热，加 热模式如下： ①１２０￣Ｃ温度下加热３０ ｍｉｎ ＠２５０￣ｃ温度下加热３０ ｍｉｎ ③３８０℃温度下加热３０ ｍｉｎ ④４２０℃温度下加热６０ ｍｉｎ （５）消解结束后，将消化管从消解仪上取出放 置于试管架上冷却至室温（该操作依然在通风厨内 进行）。 （６）样品冷却后，进行下一步定氮操作。 １．７．２定氮 （１）将定氮仪加酸、加碱分别设置为３０ ｍＬ、 ４０ｍＬ，蒸馏时间设定为５ ｍｉｎ，向锥形瓶中加入５滴 溴甲酚绿一甲基红指示剂，装上消化管，开始蒸馏。 （２）用标定好的盐酸滴定馏出液。 （３）数据处理： 一∞： ∞＝—————— ————一 Ｘ ＵＵ￣１００％ ／ｏ （１）， 式中：（１）——样品的含氮量（％）； ——滴定样品消耗盐酸量（ｍＬ）； 厂滴定空白消耗盐酸量（ｍＬ）； Ｃ—一盐酸溶液的标准浓度（ｍｏｌ／Ｌ）； ’——样品质量（ｇ）。 １．８水解度的计算 采用水解度的定义式来计算，用所测得水解液 游离氨基浓度来代替ｈ，用水解液氮含量来代替ｈ ， 计算公式如下【１１】： ＤＨ＝ ×１００％ （２） 式中：Ｃ。——水解液游离氨基浓度（ｍｏｌ／Ｌ）； ——水解液氮含量（ｍｏｌ／Ｌ）。 ２ 实验结果与讨论 ２．１ ＯＰＡ法标准曲线 以Ｌ一亮氨酸为标准品绘制标准曲线，如图１ 所示：亮氨酸浓度与吸光度呈较好的线性关系，线性 方程为Ｙ＝Ｏ．７５３１ ＋０．００５１，相关性Ｒ ＝０．９９９６６。 图１ ＯＰＡ法标准曲线 ２．２ ＴＮＢＳ法标准曲线 以Ｌ一亮氨酸为标准品绘制标准曲线，如图２ 所示：亮氨酸浓度与吸光度呈较好的线性关系，线性 方程为ｙ＝１．２０１２１ｘ＋０．０１３６４，相关性Ｒ ：０．９９９８４。 ・３０・ 皮革与化工ＬＥＡＴＨＥＲ ＡＮＤ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ０ ０ Ｏ ０ ０ ８ ７ ６ ５ ４ 第３４卷 装 ２．４．２ ＴＮＢＳ法测蛋白水解液吸光度 Ｏ ０ ０ ０ ３ ２ １ ０ 将制备的革屑水解液、毛发水解液、乳清蛋白水 解液分别稀释１００倍，按照１．４中实验方法测水解 液的吸光度，结果记录如表４。 表４水解液吸光度 图２ ＴＮＢＳ法标准曲线 ２．３ 茚三酮法标准曲线 以甘氨酸为标准品绘制标准曲线，如图３所示： 甘氨酸浓度与吸光度呈较好的线性关系，线性方程 为Ｙ＝０．１４４７７ｘ一０．００６７６，相关性Ｒ。＝０．９９９５６。 ２．４．３茚三酮法测蛋白水解液吸光度 将制备的革屑水解液、毛发水解液、乳清蛋白水 解液分别稀释１００倍，按照１．５中实验方法测水解 液的吸光度，结果记录如表５。 表５水解液吸光度 图３茚三酮法标准曲线 ２．４水解液吸光度的测定 ２．４．１ ＯＰＡ法测蛋白水解液吸光度 ２。５ 水解液氨含量的测定 根据１．７中实验方法测得各水解液的氮含量 为：革屑水解液氮含量０．０１３４５２ ｇ／ｍＬ，毛发水解液 氮含量０．００６１６０５ ｇ／ｍＬ，乳清蛋白水解液氮含量 ０．００３００６ ｇ／ｍＬ。 将制备的革屑水解液、毛发水解液、乳清蛋白水 解液分别稀释１００倍，按照１．３中实验方法测水解 液的吸光度，结果记录如表３。 表３水解液吸光度 ２．６测定方法比较 将不同方法下测定的水解液的吸光度平均值分 别带人对应的标准曲线直线方程，计算出水解液的 游离氨基浓度以及标准方差，结果如表６所示。 根据１．８中所述公式以及２．５、２．６中数据，计算 出各水解液的水解度结果如表７所示。 表６水解液游离氨基浓度以及相对标准偏差 ０ＰＡ法 ＴＮＢＳ法 茚三酮法 水解液种类 游离氨基 ＲＳＤ串 游离氨基 ＲＳＤ 游离氨基 ＲＳＤ ｆ１０ ｍｏｌ／ｍＬ） 革屑水解液 毛发水解液 （％） ０．３５２ ０．６３３ ｆ１０ ｍｏｌ／ｍＬ） ５．６４ ２．９７ （％） ０．２８９ ０．５４０ ｆ１０ ｍｏｌ／ｍＬ） ５．３５ ２．５４ （％） １０．３ ５．４７ ５．６８ ２．０３ 乳清蛋白水解液 ＊ＲＳＤ为相对标准偏差 ４．５ ０．７７０ ４．５６ ０．４７１ ４．Ｏ８ ３．５５ 第２期 罗艳华，等：蛋白水解物水解度测定方法的研究 ・３１・ 表７不同测试方法下水解液的水解度 从表６的相对标准偏差可以看出：茚三酮法的 相对标准偏差明显比其他两种方法大得多，吸光度 波动较大。这可能是因为茚三酮与游离氨基反应时 位阻较大，反应产率较低引起的［８１。 由表７可以得出结论：三种方法中，ＯＰＡ法和 ＴＮＢＳ法在测革屑水解液游离氨基浓度时结果比较 接近，ＴＮＢＳ法略低，这可能与两种方法的操作条件 不同有关，ＴＮＢＳ法的操作步骤明显比ＯＰＡ法复杂， 而且耗时较长；但是在测毛发水解液时ＯＰＡ法比 ＴＮＢＳ法所得结果要小得多，这是因为毛发水解液 中含有较多的羟脯氨酸和胱氨酸，而ＯＰＡ与这两种 氨基酸的反应比较弱，从而导致结果略低；ＯＰＡ法 和ＴＮＢＳ法既能测定出ｎ一氨基的浓度也能测量出 ｓ一氨基的含量（如赖氨酸），而茚三酮法并不能与 ８一氨基发生反应，故其所测结果一般略低于前两 种方法 。 因此在实际应用中ＴＮＢＳ法及ＯＰＡ法的测定 结果更能接近实际的游离氨基浓度，从而水解度的 计算更准确。而且ＯＰＡ法操作更简便，反应时间更 短，是测水解度的首选方法。但是在测量含羟脯氨酸 和脯氨酸多的物质时，不能使用ＯＰＡ法，推荐使用 ＴＮＢＳ法 ３ 结论 本文先分别得到ＯＰＡ法、ＴＮＢＳ法、茚三酮法测 定游离氨基浓度的标准曲线，然后分别利用这三种 方法测革屑水解液、毛发水解液、乳清蛋白水解液的 游离氨基浓度，并由此得到各水解物的水解度，根据 结果分析比较了三种测试方法的适用条件。 结果表明ＯＰＡ法测量水解度时，操作简便，所 需时间短，测量结果准确，但是ＯＰＡ法不能测量胱 氨酸、半胱氨酸、脯氨酸含量多的样品（例如毛发水 解液）。ＴＮＢＳ法测量水解度时测量结果较准确，但 是操作步骤繁琐，反应时间过长。茚三酮法测试吸光 度时，数值波动较大，和ＯＰＡ以及ＴＮＢＳ法相比有 较大劣势。 参考文献： 【１】李晓东，牛治霞，张柏林．乳清蛋白水解物水解度 ３种测定方法的比较Ｕ］．中国乳品工业，２００６，３４ 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