临床肺科杂志２０１０年６月 第１５卷第６期 ８２３ 结核分枝杆菌早期分泌抗原靶６ ｋＤａ蛋白原核载体 的构建及在Ｅ．ｃｏｌｉ中的高效表达 李兵 刘威龙 张晶 张明霞 邓群益 李晓鹤 罗瑞玲余卫业 陈心春 周伯平 【摘要】 目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶６ ｋＤａ蛋白（ＥＳＡＴ－６）。方法利用ＰＣＲ方法扩增出ＥＳＡＴ－ ６基因片段，将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２１ｂ（＋），酶切分析和序列测定鉴定出ＥＳＡＴ－６基因的阳性 重组子，将其转化入Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），阳性菌株经ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和免疫印迹分析靶蛋白的表达；重组蛋白经Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ⑩Ｒｅｓｉｎｓ纯化。结果成功扩增出ＥＳＡＴ－６基因片段，构建了重组表达质粒ｐＥＴ—ＥＳＡＴ￣，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物分 子量约为６ ｋＤ，经亲和纯化后的ＥＳＡＴ￣重组蛋白纯度高，且能被结核病人血清所识别。结论利用ｐＥＴ原核表达系统成功的 对结核分枝杆菌ＥＳＡＴ￣重组蛋白进行高效表达和纯化，重组蛋白具有良好的免疫活性。 【关键词】结核分枝杆菌；早期分泌抗原靶６ ｋＤａ蛋白；原核表达 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ ｃｏｉｌ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＥＳＡＴ－６ Ｌ／Ｂｉｎｇ，ＬＩＵ眈 —ｌｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ ，ＺＨＡＮＧ －ｘｉａ，ＤＥＮＧ Ｑｕｎ—ｙｉ，ＬＩ Ｘｉａｏ—ｈｅ，ＬＵＯ Ｒｕｉ—ｌｉｇｎ，ＹＵ耽 一 ， ＣＨＥＮ Ｘｉｎ—ｃｈｕｎ，ＺＨＯＵ Ｂｏ－ｐｉｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔｈｅ ｒｄ Ｐｅｏｐｌｅ Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ ｔｏ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８Ｄ２０．Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｅａｒｌｙ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｔｉｇｅｎｔｉｃ ｔｒａｇｅｔ￣（ＥＳＡＴ￣）ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ－ ｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥＳＡＴ￣ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ一 ２１ｂ（＋）．Ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｖｅｒｉｉｆｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｉｒｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｉｌｓ－ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩ２１（ＤＥ３）ｗｈｉｃｈ Ｗａｓ ｔｈｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ— ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＥＳＡＴ￣ｇｅｎｅ Ｗａｓ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＥＴ—ＥＳＡＴ￣ｐｒｕｋａｒｙｏｔｌｃ ｃｒｅｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ Ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｐＥＴ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ＥＳＡＴ￣ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ＥＳＡＴ６ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｔｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｎａｔｉｇｅｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｎｔｉ—ＥＳＡＴ￣）． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｅａｒｌｙ ｓｅｃｒｅｔｏｙｒ ａｎｔｉｇｅｎｔｉｃ ｔｒａｇｅｔ－６；ｐｍｋａｙｒｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 结核病的致病菌结核分枝杆菌分泌许多蛋白到细胞外， ｍａｃｉａ公司，标准分子量预染蛋白是英国ＮＥＢ公司产品；抗 它们在结核病人的免疫反应中起重要作用。早期分泌抗原靶 ＥＳＡＴ￣抗体购自Ａｃｆｉｓ—ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ公司；ＤＡＢ显色剂为天根生 ６ ｋＤａ蛋白（Ｅａｒｌｙ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｔｒａｇｅｔ，ＥＳＡＴ￣）是存在于 物工程公司产品；Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ⑧Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ购自Ｎｏｖａｇｅｎ 结核分枝杆菌培养物滤液中的一种分泌性蛋白，在结核杆菌 公司。 感染早期即可被机体的免疫系统所识别 ０ ，早期分泌抗原 二、方法 靶６ ｋＤａ蛋白（ＥＳＡＴ＆）是重要的Ｔ细胞抗原 ｌ４ Ｊ，采用ＥＳ— １ ＥＳＡＴ－６基目的扩增与克隆根据ＧｅｎＢａｎｋ中结核分 ＡＴ＿６来源的合成多肽被广泛用于检测外周血结核菌特异性 枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ ＥＳＡＴ￣基因的序列合成如下引物（上游引物 ＩＦＮ－ 应答情况以诊断结核分枝杆菌感染。本研究应用带有 和下游引物的５ 端分别引入ＥｃｏＲ Ｉ和Ｈｉｎｄｍ酶切位点）：上 ６×Ｈｉｓ标签的ｐＥＴ原核表达系统，重组得到具有免疫活性和 游弓Ｉ物Ｅ—Ｕｐ：５ 一ＣＣＧＧＡＡ ＩＴＣＧＡＴＧＡｃＡＧＡＧｃＡＧｃＡＧ ＩＩＧＧ一３ ； 特异性的可溶性纯化蛋白ＥＳＡＴ￣，可利用其作为特异性抗原 下游引物Ｅ—Ｌｏｗ：５ 一ＣＣＣＡＡＧＣ＇ＩＴｒＧＣＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴ－ 进行结核患者体内结核菌特异性的细胞免疫检测，为结核的 ＧＡＣＧＴ一３ ；以结核分枝杆菌基因组ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增， 早期诊断提供基础。 扩增条件９４℃预变性５ ｍｉｎ、９４℃变性３０ ｓｅｃ、５６￣Ｃ复性３０ ｓｅｅ、７２℃延伸３０ ｓｅｃ、循环３０次、７２℃延伸２ ｍｉｎ，１．２％琼脂 材 料 糖凝胶电泳分离并回收ＰＣＲ产物，与ｐＧＭ－Ｔ载体连接后转化 一主要试剂标准分子量ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｐｆｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 大肠杆菌ＪＭ１０９感受态细胞，菌落以ＰＣＲ筛选阳性克隆，测 、聚合酶为大连宝生物工程公司产品，ＤＮＡ凝胶同收试剂盒、 序。 小量质粒ＤＮＡ抽提试剂盒为深圳赛百克生物公司产品， ２ ＥＳＡＴ￣蛋白原核表达质粒的构建用ＥｃｏＲ Ｉ和 核酸内切酶和ＤＮＡ连接酶为ＭＢＩ公司产品。Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ⑩ ＨｉｎｄＩＵ双酶切ＥＳＡＴ一６目的片断和ｐＥＴ一２１ｂ（＋）载体，琼脂糖 Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。ｐＥＴ一２１ｂ（＋）购自德国 凝胶电泳分离、切胶并回收酶切目的片段，在Ｔ４连接酶的作 Ｎｏｖａｇｅｎ公司；大肠杆菌ＪＭ１０９和Ｂ［２１（ＤＥ３）购自瑞典Ｐｈａｒ－ 用下２２￣Ｃ孵育２ ｈ，连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９，转化菌液 涂布于含氨苄青霉素（１００ ｍｇ／ｍ１）的ＬＢ固体培养基上，３７℃ 基金项目：深圳市科技计划项目（２００７０１００８） 培养过夜，次日，挑取生长的菌落培养，ＰＣＲ筛选阳性克隆，提 作者单位：５１８０２０广东深圳，广东医学院附属深圳第三人民医院传 取质粒进行双酶切鉴定，测序。 染科 ３ ＥＳＡＴ￣基因的诱导表达将重组ｐＥＴ—ＥＳＡＴ￣阳性 ８２４ 临床肺科杂志２０１０年６月 第１５卷第６期 中；免疫印迹分析显示该表达蛋白能被抗ＥＳＡＴ－６的特异抗 体识别（见图５），表明重组菌成功表达了ＥＳＡＴ－６融合蛋白。 质粒转化ＢＩ２１（ＤＥ３），用含１００ ｍｇ／ｍｌ Ａｍｐ的ＬＢ培养基培 养过夜。次日取培养菌按１：１００稀释转入１００ ｍｌ体积重新 于３７℃培养至Ａ６００＝０．６左右时，用终浓度为０．１、０．２、０．４、 ０．６、０．８、１．０和２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ ｈ，收集菌体。 ４表达水平的鉴定 菌体悬浮于适量２×ＳＤＳ蛋白上 样缓冲液中，置沸水浴中５～１０ ｒａｉｎ，离心后取上清，用５％的 浓缩胶和１２％的分离胶作ＳＤＳ—ＰＡＧＥ。凝胶经考马斯亮蓝染 色和甲醇一乙酸脱色后，采集图象，用凝胶分析系统分析其表 达情况。 ５重组蛋白表达形式分析收集菌体重悬于ＰＢＳ，用 ｉ■ ｌ ２ １ ２ ３６％强度冰浴超声碎菌１０ ｒａｉｎ，在４￣Ｃ条件下１２０００ ｒｐｍ离心 １０ ｍｉｍ，分别收集上清和沉淀，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析ＥＳＡＴ－６的表 达形式。 ６重组蛋白抗原性鉴定采用Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法，将 重组表达菌全菌蛋白作ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，用半干转移系统以０．８ ｍＡ／ｃｍ 稳流转移２ ｈ，将凝胶上的蛋白质转印到ＮＣ膜上，用 封闭液４℃封闭过夜，ＰＢＳ洗膜３次，每次１０ ｍｉｍ；然后加入１ ：１０００稀释的抗ＥＳＡＴ－６抗体，室温反应１ ｈ，同上述方法洗 膜；再与１：１０００的ＨＲＰ标记的羊抗鼠ｌｇＧ；室温反应１ ｈ，同 上洗膜；最后将ＮＣ膜浸入ＤＡＢ显色液中染色，以蒸馏水冲 洗终止反应。 ７重组ＥＳＡＴ一６蛋白的纯化与鉴定取超声碎菌后的 上清，用Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ⑧蛋白纯化试剂盒纯化重组的ＥＳＡＴ－６融 合蛋白，收集洗脱液，用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析纯 化效果。 结 果 １ ２ ３ 图１ ＥＳＡＴ一６ＰＣＲ结果 １：ＤＩ２０００；２／３：ＥＳＡＴ－６ＰＣＲ产物 二、重组ｐＥＴ—ＥＳＡＴ－６阳性质粒的鉴定ｐＥＴ—ＥＳＡＴ－６阳 性重组质粒分别经Ｅｃｏｒ Ｉ和Ｈｉｎｄ １１Ｉ进行双酶切，琼脂糖凝胶 电泳分别见到２８０ ｂｐ及５．５ ｋｂ两条片段（图２）。以重组阳 性质粒为模板，用ＰＣＲ方法扩增出大小约２８０ ｂｐ的特异性片 段（图３）。重组质粒ｐＥＴ－ＥＳＡＴ－６经测序，确定重组质粒 ｐＥＴ—ＥＳＡＴ－６中正确连入ＥＳＡＴ－６开放读码框。表明重组质粒 ｐＥＴ—ＥＳＡＴ－６构建成功。 三、重组ＥＳＡＴ－６蛋白的表达与鉴定表达的重组菌裂 解液经１２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分离、染色后，在约６ ｋＤ处出现一条 强的诱导表达带（见图４），而未经诱导的重组菌此处的蛋白 带较弱，蛋白主要以可融性存在，主要分泌在细菌裂解上清 图２重组质粒酶切鉴定 １：ＰＥＴ－ＥＳＡＴ－６质粒；２：质粒经ＥｃｏＲ Ｉ 和Ｈｉｎｄｍ双酶切 图３重组质粒ＰＣＲ鉴定 １：ＤＩ２０００；２：重 组质粒ＰＣＲ产物 ４ ６ ＫＤ １ ２ ３ ｇ ５ ６ ７ ８ ９ 图４ ＥＳＡＴ－６重组蛋白ＳＤＳ—ＰＡＧＥ １：诱导前；２：蛋白Ｍａｒｋ— ｅｒ；３：Ｏ ｍＭＩＰＴＧ诱导；４～９：０．１～２ ｍｍＩＰＴＧ诱导 图５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测 １：ＰＥＴ－２１ｂ（＋）空载体对照；２：蛋白 Ｍａｒｋｅｒ；３：ＰＥＴ—ＥＳＡＴ－６诱导包涵体；４：ＰＥＴ—ＥＳＡＴ－６诱导上清 图６ 纯化蛋白丽春红染色 １：纯化蛋白；２：蛋白Ｍａｒｋｅｒ 四、重组ＥＳＡＴ－６蛋白的纯化经ＩＰＴＧ诱导的转化菌裂 解上清，按照Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ⑩Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ说明书操作步骤进 行亲和层析纯化后，ＳＤＳ．ＰＡＧ及免疫印迹分析表明，纯化的 蛋白能被抗ＥＳＡＴ－６的特异抗体所识别，纯化蛋白保存于一 ２０￣Ｃ备用（见图６）。 讨 论 ＥＳＡＴ－６由结核分枝杆菌ＲＤ１位点上的ＥＳＡＴ－６基因编 码，全长９５个氨基酸，理论分子量为９．９ ｋＤ，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ测 得其分子量为６ ｋＤ，故而得名 。编码基因ＥＳＡＴ－６全长２８８ ｂｐ，仅存在于致病性分枝杆菌中㈣。ＥＳＡＴ－６在结核分枝杆菌 临床肺科杂志２０１０年６月 第ｌ５卷第６期 ８２５ ＤＮＡ芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因 潘建华 彭雪峰邓为之石国民 向延根 【摘要】 目的应用ＤＮＡ芯片杂交技术快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对异烟肼（ＩＮＨ）、利福平（ＲＩＦ）、链霉素 （ＳＭ）和乙胺丁醇（ＥＭＢ）的耐药性，并评价其临床应用价值。方法采用ＤＮＡ芯片技术，将固定于纤维素膜上的四种药物 常见耐药基因的特异性探针，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应产物进行杂交，共对９７株临床分离株进行 检测，并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较。结果ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＳＭ和ＥＭＢ的耐药基因检出的灵敏度分别为８９．６％、 ９８．６％、８１．８％和８８．２％，特异度分别为９３．３％、１００％、１００％和１００％。结论简便快速敏感的ＤＮＡ芯片杂交方法适用于临床 批量结核分枝杆菌耐药性的初筛。 【关键词】结核；分枝杆菌；核酸杂交；药物耐受性；突变 Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｂｙ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ＰＡＮ Ｊｉａｎ—ｈｕａ，ＰＥＮＧ Ｘｕｅ－ｆｅｎｇ，ＤＥＮＧ Ｗｅｉ・ｚｈｉ，ＳＨＩ Ｇｕｏ—ｍｉｎ，ＸＩＡＮＧ Ｙａｎ－ｇｅｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＣｈａｎｇｓｈａ。Ｃｈａｎｇｓｈａ ４ｌｏＯｏ４。Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＮＨ，ＲＩＦ，ＳＭ ａｎｄ ＥＭＢ ｉｎ ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｂｙ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ａｎｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｉｔｓ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｉｆｅｄ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｉｏｔｉｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒｎａｅ— ｂｏｕｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ．Ｔｏｔｌａ ９７ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＭＴＢ ｗｅｒｅ ｎａａｌｙｚｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐ— ｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ．ＲｅｓＩｌｌｔｓ Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＩＮＨ，ＲＩＦ，ＳＭ ａｎｄ ＥＭＢ ｗａｓ ８９．６％，９８．６％，８１．８％ａｎｄ ８８．２％，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｗａｓ ９３．３％， １００％，１００％ａｎｄ １００％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｈｏｒｔ ｔｕｒｎａｒｏｕｎｄ ｔｉｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｒａｐｉｄｌｙ，ｍａｋｅ ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓｕｉｔｂａｌｅ ａｓ ａ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＴＢ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ；ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｎｕｌｅｏｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｍｕｔａｔｉｏｎ 基金项目：国家十一五科技重大专项（艾滋病和病毒性肝炎等重大传 作者单位：４１０００４湖南长沙，长沙市中心医院检验科 染病防治）（２ｏｏ９ｚｘ１ｏｏ０５＿０１８） 通讯作者：向延根，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｎｇｙａｎｇｅｎ＠１２６．ｃｏｍ ） ） 感染早期即能被机体的免疫系统识别，可诱导机体的抗原特 疫检测，为结核菌感染的早期诊断提供基础。 异性ＣＤ４ Ｔ细胞、ＣＤ８ Ｔ细胞增殖及产生大量ＩＦＮ． Ｊ。因 参考文献 此，ＥＳＡＴ－６及其合成多肽被应用于结核菌特异性ＩＦＮ－ 应答 ［１］李永华，庄辉．传染性非典型肺炎的病原学研究进展［Ｊ］．中华 反应的测定，以诊断结核菌感染。 流行病学杂志，２００３，２４（５）：３４２—３４３． 本文利用融合表达的方式成功的克隆了含有结核分枝杆 ［２］何兴舟．环境与疾病一环境病因学研究中值得注意的问题［Ｊ］． 菌ＥＳＡＴ－６基因的原核表达重组质粒，该重组质粒在ＢＬ２１ 中华流行病学杂志，２００３，２４（１Ｏ）：８５７—８５８． （ＤＥ３）中经ＩＰＴＧ诱导后得到高效表达，纯度达到８５％左右， ［３］Ｐｅｒｎｉｌｌｅ Ｒａｖｎ，Ｍａｒｔｉｎ Ｅ．Ｍｕｎｋ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｗｈｏｌｅ・Ｂｌｏｏｄ Ｔｅｓｔ Ｕｓｉｎｇ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ・－Ｓｐｅｃｉｉｆｃ Ａｎｔｉ－ 通过免疫印迹分析显示，表达的重组蛋白能被抗ＥＳＡＴ－６的 特异抗体识别，并具有良好的抗原活性。通过对其诱导后表 ｇｅｎｓ ＥＳＡＴ－６ ａｎｄ ＣＦＰ一１０ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，１２（４）：４９１ 达产物裂解液上清及沉淀分析，我们所表达的ＥＳＡＴ－６蛋白 —４９６． 以可溶性的形式存在于裂解液上清液中，不需变性直接用于 ［４］Ｈａｒｂｏｅ Ｍ，ＯｅｔｔｅｉｎｇｅｒＴ，Ｗｉｋｅｒ ＨＢ，ｅｔ ａ１．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ 纯化即可得到具有免疫活性的蛋白。 ｔｈｅ ＥＳＡＴ－６ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｕｒｌｅｎｔ Ｍｙ－ 我们采用Ｈｉｓ・ｔａｇ与Ｎｉ“特异结合性进行固定化亲和 ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ａｂｓｅｎｃｅ ｉｎ Ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ 层析的方法进行快速纯化蛋白。组氨酸在一般蛋白质中属稀 ［Ｊ］．Ｉｎｆｃｅ Ｉｍｍｕｎ，１９９６，６４（１）：１６—２２． 有碱基，引人６个连续的组氨酸的融合蛋白具有很高的特异 ［５］Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ＡＬ，Ｎａｇａｉ Ｓ，Ｈｏｕｅｎ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｆｉａｚ— 性；相应的纯化方法快速、简便、仅需一步，即可达到目的，而 ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｗ—ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｍａｓｓ Ｔ—ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｃｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ— 且Ｈｉｓ—ｂｉｎｄ树脂稳定性好，再生方便，容量大；层析介质上的 ｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ，１９９５，６３（５）：１７１０—１７１７． 配基为金属离子，廉价易得，纯化蛋白具有生产成本低、易于 ［６］ Ｂｅｈｒ ＭＡ，Ｗｉｌｓｏｎ ＭＡ，Ｇｉｌｌ ＷＰ，ｅｌ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ＢＣＧ 操作等优点。 Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｙ Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４ （５４１９）：１５２０—１５２３． 综上所述，我们利用ｐＥＴ原核表达系统成功表达得到了 ［７］Ｐｏｌｌｏｃｋ ＪＭ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｐ．Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＳＡＴ－６ 结核分枝杆菌ＥＳＡＴ－６重组蛋白并通过亲和层析的方法纯 ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｓｒｔ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｗｉｔｈ Ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ｉｎ 化，所表达的ＥＳＡＴ－６具有较好的免疫活性和特异性，可利用 ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｉｆｎｅｃｔ Ｉｍｍｕｍ，１９９７，６５（７）：２５８７—２５９２． 其作为特异性抗原进行结核患者体内结核菌特异性的细胞免 ［收稿日期：２０ｏ９—０９—１５］
