第１２卷第２２期２０１２年８月 科学技术与工程 Ｖｏ１．１２ Ｎｏ．２２ Ａｕｇ．２０１２ １６７１～１８１５（２０１２）２２—５４３８—０５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ⑥２０１２ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｅｎｇｒｇ． 生物科学 恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达 和多克隆抗备 沈 燕赵亚黄豫晓 梁姣刘忠湘 李英辉 （第四军医大学微生物学与病原生物学教研室，西安７１００３２） 摘要原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达 载体的基础上，将测序正确的ＡＭＡＭＥＧ基因克隆入原核表达载体ｐＧＥｘ４Ｔ一１并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的 蛋白，以ＡＭＡ一１抗体对纯化蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－－ｂｌｏｔ分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过ＰＣＲ成功获 得长度为１ ０００ ｂｐ的恶性疟原虫ＡＭＡ一１胞外域基因片段，获得了与多表位基因连接后的ＡＭＡＭＥＧ基因。通过诱导表达， 显示在相对分子量约９５ ０００处有预计大小的特异性条带，表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产 生特异性抗体，其滴度达到１：１０ 。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。 关键词 恶性疟原虫 疫苗 多表位基因 中图法分类号Ｑ９５９．１１５．４； 文献标志码Ｂ 疟疾是危害人类健康的严重传染病。最新数 据表明，全球有约３５％的人口（约２３．７亿人）生活 在有一定感染疟疾风险的环境中，全球有１０亿人生 活在疟疾发病高危地区。全球疟疾形势的恶化，迫 切需要采用新技术研制新的疟疾防治方法以控制 龄婴儿的保护率仅为５３％左右…，但已属疟疾疫苗 研究领域非常重大的突破。本研究在前期构建恶 性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基 础上，构建恶性疟原虫复合多期多表位重组原核表 达载体，并表达蛋白和进行抗备，该工作可能 对研究有效的恶性疟原虫预防／治疗性疫苗提供重 要的理论和实践基础。 其流行。目前在研的方法包括研制不同作用机制 的新型抗疟药和能抵抗疟原虫感染的转基因蚊虫 以及疟疾疫苗等。研究者普遍认为，研制安全、有 效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途 径。因此，世界各国对疟疾疫苗研究给予了前所未 有的关注和支持：疟疾、爱滋病和结核疫苗一起成 为全球优先发展的三大疫苗。但是，由于疟原虫具 １材料和方法 １．１材料 大肠埃希菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５ｃ￣为本室保存。 Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠购自第四军医大学实验动物中心。 ｐＧＥＸ４Ｔ一１原核表达质粒为瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司产 有复杂的生活史、抗原高度变异等特点，有效疫苗 的研制仍旧面临极大困难。至今尚无有效疫苗应 用于临床实践，作为目前免疫保护效果最好的ＲＴＳ， ｓ疫苗研究耗时２０余年，在ＩＩＩ期临床试验中对低 ２０１２年４月２５收到 国家自然科学基金项目（３０９０１３７０）资助 品。兔抗谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）ＩｇＧ（Ｃａｔ．１００００－０一 ＡＰ）辣根过氧化物酶ＨＲＰ标记的抗兔ＩｇＧ（Ｃａｔ． Ｏ０００１—２）为Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司产品。ＨＲＰ标记的抗 小鼠ＩｇＧ（Ｃａｔ．ＨＤＯ０３—１）购自北京鼎国生物公司。 化学发光ＨＲＰ底物Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司产品（Ｃａｔ．ＷＢＫＬＳＯ－－１００）。Ｔ—ＡＭＡ一１和 第一作者简介：沈燕（１９８１一），女，陕西西安人，助教，理学硕士， 研究方向：分子寄生虫学。 通信作者简介：李英辉。 Ｔ—ＭＥＧ均为本教研室制备，其余化学试剂均为国 产分析纯。 ２２期 沈燕，等：恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗备 １．２方法 １．２．１ ｐＧＥＸ４Ｔ－－１／ＡＭＡＭＥＧ重组表达载体的 构建 用ＢａｍＨＩ和ＮｄｅＩ双酶切Ｔ．ＡＭＡ．１，获得 ＡＭＡ一１基因片段；以ＮｄｅＩ和ＳａｌＩ双酶切Ｔ—ＭＥＧ， 获得ＭＥＧ片段，将ＡＭＡ一１、ＭＥＧ和经ＢａｍＨＩ和 ＳａｌＩ双酶切的原核载体ｐＧＥＸ４Ｔ一１用Ｔ ＤＮＡ连接 酶连接，转化ＤＨ５ｏ￣。重组质粒ｐＧＥＸ４Ｔ一１／ ＡＭＡＭＥＧ的鉴定采用双酶切鉴定，酶切鉴定得到的 阳性克隆，送ＴａＫａＲａ公司进行核苷酸序列测定。 １．２．２重组蛋白的诱导表达 将重组质粒ｐＧＥＸ４Ｔ－－１／ＡＭＡＭＥＧ转化入感 受态细菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取阳性克隆接种于５ ｍＬ 含１００ Ｉｘｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中， ３７￣Ｃ，２２０ ｒ／ｍｉｎ震荡培养１６ ｈ－２０ ｈ，次日以１：１００ 比例转接种于１００ ｍＬ含氨苄青霉素的ＬＢ培养液 中，３７％，２２０ ｒ／ｍｉｎ。 震荡培养，当吸光度（ＯＤ值）达到０．６时添加 终浓度为０．１ ｍｍｏｌ的异丙基一Ｂ—Ｄ硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ），２０ ｏＣ，２２０ ｒ／ｍｉｎ震荡培养５ ｈ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ后弃上清，收集沉淀菌体，一８０％保存 备用。同时诱导前后取样各１ ｍＬ，离心收集菌体， 少量ＰＢＳ重悬后加入等体积２ Ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，１００ ℃煮沸５ ｍｉｎ，离心取上清进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物。 １．２．３ ＡＭＡＭＥＧ／ＧＳＴ包涵体重组蛋白的纯化 将菌体沉淀用适量ＰＢＳ重悬，超声裂解菌体， ４℃，１０ ０００ ｇ离心２５ ｒａｉｎ，分别取上清和沉淀少量 进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测表达产物。将包涵体沉淀 分别用含有１．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－－１００和２ ｏｔｏｌ尿素的ＰＢＳ 溶液洗涤，１２ ０００ ｇ离心１０ ｍｉｎ，各重复三次，将沉 淀用８ ｔｏｏｌ尿素／ＰＢＳ溶液室温搅拌溶解２ ｈ，１２ ０００ ｇ离心１０ ｒａｉｎ，分别对各洗涤液上清和沉淀取样进 行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产 物。检测正确后经１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分离后，考 马斯亮蓝染色，切取目的条带，液氮速冷后研磨成 粉，用适量８ ｔｏｏｌ尿素／ＰＢＳ溶解，离心后取上清，按照 试剂盒操作测定蛋白含量，一８０℃保存蛋白备用。 １．２．４重组蛋白免疫小鼠 选取Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠６只，雌性，体重１８ ０ ｇ，将 重组蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，按１０ ｇ蛋８／只小鼠（２００ Ｌ）经腹腔注射，２周后将重 组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，按１０ 只小鼠（２００ ）经腹腔注射，２周后再次加强 免疫，之后第十天摘眼球取血，收集血清，进行 ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测抗体效价及特异性。 １．２．５ ＥＬＩＳＡ检测抗体效价 用抗原包被液将重组蛋白稀释至１０￣ｇ／ｍＬ，每 孔加１００ Ｌ，４℃过夜，次日用ＰＢＳＴ清洗２次，拍 干后用１００ Ｌ／孔５％脱脂牛奶／ＰＢＳ溶液封闭１ ｈ， 将待测小鼠血清以１０～一１０ 倍比稀释至各孔，３７ ℃孵育２ ｈ，ＰＢＳＴ清洗３次，加新鲜稀释的酶标抗体 １００ Ｌ／孔，３７℃孵育１ ｈ，ＰＢＳＴ清洗３次，加入 ＴＭＢ底物溶液１００ Ｉ／孔，３７ ｑＣ显色１５ ｒａｉｎ，加入２ ｏｔｏｌ硫酸５０ Ｌ／孔终止显色，用酶标仪进行测定。 １．２．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测抗体特异性 纯化后的重组蛋白加入５ Ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ煮沸 ５ ｍｉｎ，１０％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，转印ＰＶＤＦ膜４０ Ｖ恒 压１ ｈ。用５％脱脂牛奶／ＰＢｓ溶液封闭转印膜１ ｈ， 以１：５００稀释小鼠血清孵育转印膜，４℃过夜，次日 用ＰＢＳＴ清洗１０ ｍｉｎ重复３次，加入ＨＲＰ标记的抗 小鼠ＩｇＧ，室温孵育１ ｈ，ＰＢＳＴ清洗１０ ｍｉｎ３次， Ｗｅｓｔｅｒｎ显色剂进行显影。 ２结果 ２．１ ｐＧＥＸ４Ｔ－１／ＡＭＡＭＥＧ重组载体的酶切鉴定 经ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切ｐＧＥＸ４Ｔ一１／ＡＭＡＭＥＧ， 得到１ ４００ ｂｐ左右的片段（图１），与预期片段大小 一致，测序分析显示序列与原始设计序列完全一致。 ２．２ ｐＧＥＸ４Ｔ－１／ＡＭＡＭＥＧ重组蛋白的原核表达 及鉴定 ＩＰＴＧ诱导后在相对分子量约为９５ ｋＤ处可见 明显蛋白条带，与预测相符，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳结果显 示，该融合蛋白少量为水溶性，大部分以包涵体形 式存在裂解后的菌体沉淀中（图２）。 ２．３包涵体纯化和鉴定 包涵体沉淀先用２ ｔｏｏｌ尿素／ＰＢＳ溶液清洗，只 有少量目的蛋白包涵体被溶解，随后连续两次用８Ｍ ２２期 沈燕，等：恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗备 ５４４１ 图５小鼠抗血清特异性检测 ＧＳＴ—ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：５００），１—６～ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｔｌｓｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ（ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：５００），７～Ｎｏｍａｌ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ（ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：５００） 样，只要有少数子孢子逃避疫苗的作用，它们即可 通过肝内及红细胞内繁殖产生大量原虫，造成感染 并使机体致病。所以，该期疫苗不仅要诱导高效价 的抗子孢子抗体，还要诱导稳定而高效的ＣＴＬ杀伤 受染肝细胞。为了达到该预期目的，本研究筛选改 造恶性疟原虫红前期抗原的隐性表位，即修饰恶性 疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）、血凝素相关匿名蛋白 （ＴＲＡ Ｐ）和肝期特异性抗原１（Ｌ ＳＡ ２１）这些重要 的红前期疟疾疫苗候选抗原中 的隐性表位，使 其诱导稳定而持久的针对原隐性表位ＣＴＬ ，从 而可能避免优势表位抗原变异而发生免疫逃避。 同时，现今的疫苗设计更倾向于多表位的参与，直 接诱导出针对多表位的广泛的ＣＴＬ应答也显得十 分重要，感染者可能从多特异性ＣＴＬ应答中受益。 恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原ＡＭＡ一１是红 内期重要的保护性抗原，用纯化的天然抗原或重组 蛋白在小鼠和猴体模型中均可诱导出对疟原虫攻 击的有效保护，对众多ＡＭＡ一１等位基因型的分析 表明，人群中的保护性免疫主要针对该蛋白的胞外 结构域。我室研究人员使用ＡＭＡ一１胞外域的多 种形式 联合免疫，较好的诱导了小鼠体内的免 疫应答。选择ＡＭＡ一１胞外域联合前述抗原表位， 兼顾到体液免疫和细胞免疫，以期较好的诱导小鼠 体内的免疫应答，可能对研究有效的恶性疟原虫预 防／治疗性疫苗提供重要的理论和实践基础。 将前述方法得到的表达重组恶性疟原虫多期 多表位原核表达载体在大肠杆菌ＢＬ２１中进行诱导 表达，特异性地表达了相对分子量约为９５ ＫＤ的抗 原，并对其进行纯化后，免疫小鼠制备了多克隆抗 体，研究结果表明，纯化后得到了纯度较高的 ＡＭＡＭＥＧ融合蛋白并得到具有较高效价的小鼠抗 血清，为疫苗研究奠定基础，进一步的功能实验正 在积极进行中。 参考文献 １ Ｔｈｅ ＲＴＳ，Ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ．Ｆｉｓｒｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈａｓｅ ３ ｔｉｒａｌ ｏｆ ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ａｆｒｉｃａｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１：３６５：１８６３—１８７５ ２）Ｒｏｇｇｅｒｏ Ｍ Ａ，Ｍ ｅｒａｌｄｉ Ｖ，Ｌ６ｐｅｚ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｏｘｉｄｉｚｅｄ Ｃ——ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｓｍ ｏｄ ｉｕｍ ｂｅｒｇ ｈｅｉ ｃｉｒｃｕｍ——ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｈｉｇｈ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｅｕｒ Ｊｈｎｍｕｎｏｌ，２０００；３０ （９）：２６７９－－２６８５ ３ Ｓｔｏｕｔｅ Ｊ Ａ，Ｓｌａｏｕｉ Ｍ，Ｈｅｐｐｎｅｒ Ｄ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｖａｌｕａ— ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃｉｒｃｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｌｕｓ— ｍｏｄｉｍｎ ｆａｌｅｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９７；３３６（２）：８６ １ ４ Ｗｅｎｇｅｌｎｉｋ Ｋ，Ｓｐａｃｃａｐｅｌｏ Ｒ，Ｎａｉｔｚａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ Ａ—ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｈａ ｓｐｏｒ￣ｄｉａｒｅ［ａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ＰＩａｓｍ￣ｄｉｕｍ ｆａｌｅｉｐＫＥｕ，ｉｎ ＴＲＡＰ ａｌＪｅ ｉｍ－ ｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｍｏｓｑｕｉｔｏ Ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ．ＥＭＢＯ Ｊ，１９９９；１８（１９）：５１９５－－５２０４ ５ Ｓｕｌｔａｎ Ａ Ａ，Ｔｈａｔｈｙ Ｖ，Ｆ ｒｅｖｅｒｔ Ｕ，ｅｔ ａ１．ＴＲＡＰ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｇｌｉ— ｄｉｎｇ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ．Ｃｅｌｌ，１９９７；９０ （３）：５１１－一５２２ ６ Ｐｅｒｌａｚａ ＢＬ，Ｈｅｒｒｅｒａ Ｍ，Ｂｒａｈｉｍｉ Ｋ，ｅｔ ｕ１．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｅｉｔｙ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍｆａｌｅｉｐａｒｕｍ ｐｒｅｅｒｙｔｈｒｏｅｙｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ Ａｏｔｕｓｌｅｍｕｒｉｎｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ．ｈｆｆｅｃｔ ｌｍｎｍｎ，１９９８；６６（７）：３４２３－－３４２８ ７ Ｔｏｕｒｄｏｔ Ｓ，Ｓｃａｒｄｉｎｏ Ａ，Ｓａｌｏｕｓｔｒｏｕ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎ— ｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ—ａｆｆｉｎｉｔｙ ＨＬＡ—Ａ２．１一ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｐｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍ— ｍｕｎｏｌ，２０００；３０（１２）：３４１１—３４２１ ８ Ｇｒｏｓｓ ＤＡ，Ｇｒａｆｔ Ｄｕｂｏｉｓ Ｓ，Ｏｐｏｌｏｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｉｆ— ｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｌｏｗ—ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎ— ｖｅｓｔ，２００４；１１３（３）：４２５—４３３ ９ Ｖａｈｎｏｒｉ Ｄ，Ｆｏｎｔｅｎｅａｕ Ｊ Ｆ，Ｌｉｚａｎａ Ｃ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｔｕｍｏｒ－－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＭｅｌａｎＡＰＭＡＲＴ－－１ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９８；１６０（４）： １７５０－－１７５８ １０李殉，薛采芳，缪军，等．恶性疟原虫ＡＭＡ１不同类型疫苗组 合免疫接种研究．中华微生物学和免疫学杂志，２００５；２５（１１）： ９２３—一９２６ １１李淑梅，李殉，薛采芳，等．恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ ＤＮＡ 与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答．中国寄生虫学与 寄生虫病杂志，２００５；２３（２）：９３—— ６ １２ Ｍｉａｏ Ｊ，“Ｘ，Ｌｉｕ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅ—－ｂｏｏｓｔ ｓｅｈｅｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｐｉｃａｌ ｍｅｍ— ｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＰｆＡＭＡＩ）一ｂａｓｅｄ ＤＮＡ，ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６；２４（３７ ９）： ６】８７—＿６１９８ （下转第５４４６页） ５４４６ 学校学报．２００２；１９（４）：４５—５２ 科学技术与工程 １２卷 业科技，２００９；３０（６）：２１７—２２２ １２周胜男，陆宁．马铃薯中多酚类物质提取方法的研究．食品工 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｄａｔｅｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｗａｖｅ ＬＩ Ｘｉａｏ ，ＣＡＯ Ｙａｎ—ｐｉｎｇ ，ＧＡＯ Ｌｉ—ｇｕｏ ，ＭＡ Ｘｉａｎｇ—ｒｏｎｇ ＧＡＯ Ｘｉｎ ，ＺＨＯＵ Ｍｉａｏ－ｍｉａｏ ，（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔ￣ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙｕｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。，Ｙｕｌｉｎ ７１９０００，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ； Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｉｔｉｃｓ ａｎｄ Ｌａｗ，Ｘｉ’ａｎ ７１００６３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） ｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｄａｔｅｓ ｉｎ ｎｏｒｔｈ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ ｗｉｔｈ ｕｈｒａｓｏｎ． ｉｃ ｗａｖｅ．（１）ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ；（２）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｉｍｅ，ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｅｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｌ。（３ ）ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｉｔ ｉｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ：（１）Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｙ ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｅ＞ｔｒａｄｉ． ，ｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｌｕｅｎｅｅ＞ｓｏｘｈｌｅｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ＞ｄｉｐｐｅｄ ｉｎ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ａ１ｃ０． ．ｈｏ１．（２）Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｄａｔｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ａｌｃｏｈ０１ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ７０％（Ｖ／Ｖ），ｔｈｅ ｆｅｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｗａｓ １：４０，３０ｒａｉｎ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ．Ｔｈｅ ｃ０ｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｄａｔｅｓ ｉｎ ｎｏｒｔｈ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ ｉｓ ４４４．６ ｍｇ／１００ｇ・．Ｉｔ ｉｓ ｅｏｎｅｌｕｓｅｄ ｔｈａｔ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅ． ｎｏｌ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ ｉｓ ｍｕｃｈ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｉｔ ｈａｓ ｓｈｏｒｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｏ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｗｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｃａｎ ｇｏｔ ｉｔ ｅａｓｉｌｙ． ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｃｈｉｎｅｓｅ ｄａｔｅｓ ≯ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ （上接第５４４１页） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅ ｐａｒｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ ＳＨＥＮ Ｙａｎ，ＺＨＡＯ Ｙａ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕ—ｘｉａｏ，ＬＩＡＮＧ Ｊｉａｏ，ＬＩＵ Ｚｈｏｎｇ—ｘｉａｎｇ，ＬＩ Ｙｉｎｇ．ｈｕｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１００３２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｙ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｆｕｓｉｏｎ ｍｕｌｉｆｅｐｉｔｏｐｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ＹＮ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ＡＭＡ～ｌ ０ｆ Ｐ． ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ａｍｉｎｏ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＸ４Ｔ一１，ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＸ４Ｔ－－１／ＡＭＡＭＥＧ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ＢＩ２ １（ＤＥ３）．Ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｕ． ｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ ｗａｓｈｉｎｇ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅ’ｓ ａｎｔｉ—ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＸ４Ｔ一１／ＡＭＡＭＥＧ ｃｏｄｉｎｇ ｍｕｌｔｉ—ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ＡＭＡ～１ ｇｅｎｅ ｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ ＧＳＴ／ ＡＭＡＭＥＧ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｓｅｌｑｌｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＴ／ＡＭＡＭＥＧ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍｕｈｉｅｐｉｔｏｐｅ ｇｅｎｅ
