2006,22(11)
中国人兽共患病学报ChineseJournalofZoonoses
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文章编号:1002-2694(2006)11-1035-04
实时RT2PCR法检测感染小鼠不同组织标本中的
委内瑞拉马脑炎病毒3
邓永强,姜 涛,于 曼,陈水平,秦成峰,刘伯华,祝庆余,秦鄂德
摘 要:目的 为委内瑞拉马脑炎病毒所致疾病的早期诊断和流行病学研究提供技术支持。方法 建立了委内瑞拉马脑炎病毒特异、敏感和快速的实时RT2PCR法,并对委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明小鼠的不同组织标本中的病毒载量进行了定量检测。结果 本研究建立的实时RT2PCR法敏感(10TCID50/ml)、特异(对其它甲病毒成员,如东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒检测为阴性)。该方法可从委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后第1d的血液、脾脏、脑组织中检测到不同含量的病毒核酸,而在感染后第3d仅从脾脏和脑组织中检测到病毒核酸。结论 实时RT2PCR法不仅是一种敏感、准确的检测方法,可用来了解病毒感染量与疾病严重程度的关系和评价病毒病疫苗的免疫效果,而且也为VEEV疾病的临床诊断和流行病学监测提供工具。
关键词:委内瑞拉马脑炎病毒;实时RT2PCR 中图分类号:R373.1 文献标识码:A
DetectionofVenezuelanequineencephalitisvirusindifferenttissuesamplesof
infectedmicebyreal2timeRT2PCR
DENGYong2qiang,JIANGTao,YUMan,CHENShui2pingQINGCheng2feng,LIUBo2hua,ZHUQing2yu,QINE2de
(StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitary
MedicalSciences,Beijing100071,China)
ABSTRACT:Venezuelanequineencephalitisvirus(VEEV)isoneofmedicallyimportanthumanpathogenandpotentialbi2ologicalwarfareorbioterrorismagents.Inordertodevelopasensitive,specificandrapidtechniqueofearliersurveillanceandepidemiologicalresearchonVEEVdisease,thereal2timeRT2PCRassaytargetedcapsidproteingenesequencesofVEEVwasdevelopedandusedtoquantitativelydetecttheviralloadsindifferenttissuesamplesofVEEV2infectedmice.Theresultsshowedthatreal2timeRT2PCRassaywassensitive(todetedctatleast10TCID50/mlofviruses)andspecific(notamplifyinganyotherAlphaviruses,suchaseasternequineencephalitisvirusandwesternequineencephalitisvirus).Inaddition,virusRNAcouldbequantitativelydetectedfromblood,kidney,liver,spleenandbrainsamplesofVEEV2infectedmiceasearlyas1daypost2inoculation,andfromspleenandbrainsamplesonthethirddayafterinoculationofviruses,indicatingthatVEEVpri2marilyreplicatesinspleenandbrainofmouse.Thesesuggestthatreal2timeRT2PCRnotonlyisasensitiveandaccuratemethodtounderstandrelationshipbetweenamountofvirusinfection2severedegreeofdiseasesandassesstheimmunizationefficacyofvirusvaccine,butalsohavegreatpotentialintheclinicaldiagnosisandepidemiologicalsurveillanceofVEEVdisease.
KEYWORDS:Venezuelanequineencephalitisvirus;real2timeRT2PCR
委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequineencephali2tis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒引起并通过蚊媒在马类和较低等脊椎动物中传播的一种急性传染病,伴有人类感染的发生。该病主要流行于南美洲北部,中美洲和美国南部。该病毒可通过气溶胶传播,易感性高,是重要的生物战剂之一〔1〕。尽管我国目前尚未发现委内瑞拉马脑炎病毒,但由于国际贸
易往来与交流的频繁、生物媒介的广泛分布,我国也存在着发生该病流行的可能。
目前,我们对委内瑞拉马脑炎病毒急性和持续感染的疾病特征尚不清楚,而且也缺乏针对这种病
3“十五”国家科技攻关计划项目(2003BA712A和2004BA519A32)通讯作者:秦鄂德,Tel:010266948604
作者单位:军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物
安全国家重点实验室,北京 100071
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毒的快速检测方法,因此,本研究建立了针对委内瑞拉马脑炎病毒的实时RT2PCR方法,并对感染小鼠不同组织标本中的委内瑞拉马脑炎病毒RNA进行检测,观察病毒在小鼠组织中的复制情况,为可能出现的委内瑞拉马脑炎病毒疾病的预防控制和流行病学检测提供重要依据和技术支持。1 材料与方法1.1 病毒株和细胞系委内瑞拉马脑炎病毒,由本室毒种库保存;非洲绿猴肾(Vero)细胞,由本室细胞库保存。1.2 实验动物 3周龄雌性昆明种小鼠,由本院动物中心提供。1.3 主要试剂和仪器 用于RNA提取的RNeasyMiniKit为德国QIAGEN公司产品;AMV反转录
DNA聚合酶为上海生工产品;实时RT2PCR通用
试剂盒TaqMan(r)UniversalPCRMasterMix和
一步实时RT2PCR试剂盒TaqMan(r)MasterMix为美国AB公司产品;基因扩增仪GeneAmp2400和实时PCR仪PRISM(r)7900为AB公司产品。1.4 委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠标本的制备 取3周龄雌性昆明种小鼠20只,分别经腹腔途径接种100TCID50的委内瑞拉马脑炎病毒悬液(0.4ml/只),同时取3只作对照。每天观察小鼠的发病情况,并分别在感染后不同时间处死3只小鼠,同时采集血清、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织标本,保存于-70℃备用。1.5 引物设计 根据委内瑞拉马脑炎病毒的nsP2和C基因的序列设计常规和实时RT2PCR引物,并由上海生物工程有限公司合成。
酶和RNA酶抑制剂为Promega公司产品;Taq
表1 常规RT2PCR法和实时RT2PCR法的引物和探针
Table.1 Primersandprobesofconventionalandreal2timeRT2PCRassays
PrimerF2255
R2612F7295R7413Pb7333
LocationnsP2Capsid
Sequence(5’23’)
AAAAGATCTGGTGGTGAGCGC
TGAGACGACCGAAGTCACAGATTT
TGAACATGACGATGACAGGAGAAAAGTTCCTACGGTTTCATACCTTGA
6FAM2AGTCAACACGCTGGAATCGAGTGGG2TAMRA
Productsize(bp)
3119
F:forwardprimer;R:reverseprimer;Pb:probe.
1.6 RT2PCR及实时RT2PCR检测 取委内瑞拉
马脑炎病毒感染后不同时间采集的小鼠脑组织、脾
脏、肾脏和肝脏标本,在预冷的乳钵中研磨成匀浆后加入适量的稀释液(含2%小牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养液),3000r/min离心10min收集上清;小鼠血液标本同样离心收集血清。
分别设计了针对委内瑞拉马脑炎病毒nSP2基因的常规RT2PCR引物和针对C基因的实时RT2PCR引物和探针(见表1)并对其特异性和敏感性进行了评价。结果显示二者的检测敏感性分别为100TCID50/ml和10TCID50/ml(见图1)。
2.2 委内瑞拉马脑炎病毒在感染小鼠不同组织中
然后按照RNeasyMiniKit试剂盒说明书,提取
RNA。然后按照文献〔2〕报道方法进行RT2PCR和实时RT2PCR扩增。2 结 果2.1 委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后的实验观察
的复制特征 利用所建立的常规RT2PCR方法对
感染小鼠不同时间采集的组织标本进行检测。从图2可见,除肝脏外,该方法可从感染后第1～5d的脑组织中检测到病毒RNA,而对于小鼠血液、肾脏和脾脏,仅在第1d和第3d。这些结果初步显示委内瑞拉马脑炎病毒可在昆明种小鼠的不同组织中复制。但常规RT2PCT的结果只是定性,并不能对组织中的病毒RNA复制情况进行定量。因此,本研究又利用建立的实时RT2PCR法对感染昆明种小鼠的不同组织标本进行检测。从图3可看出,小鼠血液、肝脏和肾脏标本中的病毒滴度在感染后第1d即达到最高,分别为62.11TCID50/ml、50.86TCID50/ml和2866.55TCID50/ml,而在感染后第2d仅可检测到微量病毒RNA,到第3d则不能检出;脾脏在感染后第1d的病毒滴度为46.42
及委内瑞拉马脑炎病毒RT2PCR法的建立 本研究采用3周龄雌性昆明鼠,经腹腔途径感染100TCID50/ml的委内瑞拉马脑炎病毒,每日观察发病情况。结果显示,小鼠在感染后第2d即出现轻微立毛、后肢麻痹,随后发展到弓背和不动。小鼠在第3d即有少数死亡,在第4d出现死亡高峰,第5d除1只小鼠存活外全部死亡,死亡率高达99%以上。
为了解委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明种小鼠后在其不同组织中的分布,探讨委内瑞拉马脑炎病毒感染后在小鼠不同组织中的复制情况,本研究首先
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图1 不同滴度委内瑞拉马脑炎病毒的实时RT2PCR检测结果3
A:扩增曲线;B:标准曲线;1～6:病毒滴度为1×10～1×100TCID50/ml
Fig.1 Real2timeRT2PCRresultsofVenezuelanequineencephalitisviruswiththedifferenttitersA:Amplificationcurve;B:Standardcurve;1-6:1×103to1×100TCID50/ml,respectively
图2 委内瑞拉马脑炎病毒感染的小鼠组织标本的常规RT2PCR检测结果
A～D:血液、肾脏、脾脏和脑组织标本;A1～5:感染后0.5,1,2,3和10天;A6:阴性对照;B～D:1～6:感染后0.5,1,2,3,5和10d;D7:阴性对照
Fig.2 ConventionalRT2PCRresultsoftissuesamplesofVEEV2infectedmice
A～D:bloods,kidneys,spleensandbrainsofmice,respectively;A1-5:0.5,1,2,3and10daypost2inoculation,re2spectively;A6:negativecontrol;B～D:1～6:0.5,1,2,3,5and10daypost2inoculation,respectively;D7:negativecontrol
图3 委内瑞拉马脑炎病毒感染的小鼠组织标本的实时RT2PCR检测结果
A:血液标本;B:肾脏、脾脏和肝脏标本;C:脑组织标本
Fig.3 Real2timeRT2PCRresultsoftissuesamplesofVEEV2infectedmice
A:bloods;B:kidneys,spleens,andlivers;C:brains
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TCID50/ml,随后在第3d达到最高(626.99TCID50/ml),第5d仍然为470.32TCID50/ml。脑
组织中的病毒滴度在感染后第1d为232.36TCID50/ml,然后病毒滴度迅速增加,在第5d达到最高(65287.54TCID50/ml),最终的病毒滴度远高于任何器官,此时小鼠表现的脑炎症状十分明显,并持续到死。3 讨 论
从本研究的结果显示,通过腹腔途径接种委内瑞拉马脑炎病毒的昆明种小鼠,在感染后不同时间可观察到与报道相一致的临床症状,产生与马和人类相似的脑炎症状。尽管采用的感染途径、小鼠种属和使用毒株有所不同,但不同的文献均报道委内瑞拉马脑炎病毒对小鼠、豚鼠和仓鼠等实验动物具有极强的毒力,引起高滴度的病毒血症,疾病特征明显,小鼠在1周内几乎全部死亡,且最低致死量仅需5～10PFU/ml〔324〕。并在感染后不同时间采集的不同组织标本中检测到了不同滴度的委内瑞拉马脑炎病毒RNA,表明委内瑞拉马脑炎病毒可在昆明种小鼠中持续复制。这些结果说明,昆明种小鼠对委内瑞拉马脑炎病毒是易感的,同时由于昆明种小鼠易于饲养且经济适用,适合作为大量应用于病毒感染、评价病毒感染药物治疗和疫苗保护效果的动物模型。
尽管目前国内外尚未建立委内瑞拉马脑炎病毒的实时RT2PCR法,但本研究所建立的实时RT2PCR检测的敏感性要比RT2PCR的高10倍,而对同为甲病毒属的其他重要成员西部马脑炎病毒、东部马脑炎病毒检测均为阴性,表明本研究所建立的针对委内瑞拉马脑炎病毒的实时RT2PCR方法是敏感、特异的。然后,利用本研究建立的实时RT2PCR法对委内瑞拉马脑炎病毒感染昆明种小鼠不同组织标本进行检测。从实时RT2PCR的检测结果可以发现,委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠后首先分布在外周血,然后随血液循环到达肝、肾、脑、脾等全身多种脏器组织,并持续停留在大脑和脾脏中复制增殖。本研究的检测结果与文献报道的委内瑞拉马脑炎病毒在感染SCID小鼠或棉鼠后第1d即在心脏、脑组织、肺组织、肾脏、肝脏、脾脏等组织中持续复制是一致的〔527〕。对于委内瑞拉马脑炎病毒在小鼠脾脏中的复制情况,Carrara〔8〕等报道在委内瑞拉马脑炎病毒感染刺鼠(spinyrats)后第4d无病毒血症的情况下,仍可用细胞培养分离法从脾脏中分离到委内瑞拉马脑类病毒,提示脾脏有可能是病毒早期复制增殖的主要场所。而脑组织中存在的高滴度的病毒与感染小鼠出现脑炎症状的时间和发病的
严重程度是一致的,该结果则说明,委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠的中枢神经系统可能是导致其死亡的直接原因。同时,本研究还利用间接免疫荧光法对不同时间采集的血液标本中进行了抗体检测,均未发现抗委内瑞拉马脑炎病毒的中和抗体,而无明显脑炎症状的刺鼠在感染后第7d的血液中可检测中和抗体(效价为1∶160)〔8〕,这些结果则可能提示,小鼠不能产生有保护性的中和抗体有效地清除病毒是导致其脑炎症状加重的重要原因。
由于实时RT2PCR法具有很高的敏感性、特异性和重复性;并可在封闭的系统中通过Ct值对起始模板量进行定量,无须在扩增后进行操作,从而避免了污染的可能;且反应所需时间短,可进行大量标本的检测。本研究所建立的实时RT2PCR法,可从委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠不同时间的组织标本中检测到病毒。因此,实时RT2PCR对委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠血液及组织标本中微量病毒的快速检测,可用于病毒感染的早期诊断。而且,实时RT2PCR对感染小鼠不同组织标本如脾脏、血液、脑组织中病毒载量的准确定量,可以用来判断小鼠感染的程度,特别是感染量与所致疾病的严重程度。同样,实时RT2PCR法也可用于病毒病疫苗的免疫效果的评价。因此,实时RT2PCR法作为一种敏感、特异、快速的检测方法有可能成为委内瑞拉马脑炎病毒疾病的预防控制以及流行病学监测的有力工具。参考文献:
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收稿日期:2006201228;修回日期:2006205211
