层析分离方法-116页word资料

概 述

■ 层析法――是一种使不同分子相互分离的过程，当一混合样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体(移动相)通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。

层析法的特点：能分离一系列结构较为相似的成分，以达到一般分离方法难以达到的目的。

■ 层析常见种类及用途:

a.柱层析――分离量较大，主要用于分离制备；

b.薄层层析――主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。 c.纸层析――主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。 ■ 层析法按分离原理大体上又可以分为

(1) 吸附层析(利用吸附能力的差别进行分离)，常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等；

(2) 分配层析(利用在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离)，常用的支持剂为硅胶、硅藻土、纤维粉等，反相硅胶(键合硅胶)、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发展；

(3) 离子交换层析(利用离子解离强度不同进行分离)，常用的离子交换树脂有强酸性(磺酸型)、强碱性(季胺型)、弱酸性(羧酸型)、弱碱性(三级胺型)； (4) 电泳(利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离)，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳。

(5) 其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等，

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■ 层析方法的选择：

(1) 非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析； (2) 极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析；

(3) 酸性、两性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。

■ 各类化合物适宜的层析方法：

a. 一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析，对极性较高的生物碱也可用分配层析，而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。

b. 甙类的层析分离往往决定于甙元的性质，如皂甙、强心甙，一般可用分配层析或硅胶吸附层析。

c. 芳香油、甾体、萜类(结合成甙除外)包括萜类内酯，往往首选氧化铝及硅胶层析，若在氧化铝柱上有次级反应，则宜用硅胶吸附层析。

d. 黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。

e. 有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析，有时也用分配层析，有些氨基酸也可用活性炭吸附层析。

f. 多肽、多糖等大分子化合物，常用凝胶层析、亲和层析、反相硅胶（键合硅胶）。

第一部分 柱层析

第一章 硅胶层析

一、 层析用硅胶

层析用硅胶一般以SiO2·xH2O表示，系多孔性的硅氧环Siloxane(a)交链结构，由于其骨架

表面具有很多硅醇Silanol(b)基团，能吸着多量水分，此种水分几乎成游离状态存在，因此当加热至100℃左右能可逆地被除去。硅胶的活性水分含量有关(见表7-1)，

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表7-1 氧化铝和硅胶含水量与活性的比较 硅胶加入水量（%） 0 5 15 25 38 活性 氧化铝加入水量（%） I II III IV IV 0 3 6 10 15 含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达17%以上，吸附能力降低，而可作为分配层析载体。

硅胶于500℃加热能不可逆地失去结合水(一般170℃以上即有少量结合水失去)，从硅醇结构变成硅氧环结构，若加热至1,100℃则结合水尽失。由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数量有关，因此加热温度过高吸附能力反而降低。

有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。

层析硅胶应是中性无色颗粒，但是由于制作过程常可带有酸性，如果酸性不强于pH5，一般已可使用。 ■ 商品层析硅胶合格的判定

a.

PH值－一般先检查其是否中性。取硅胶一份混悬于100份水中放置，应得澄清的中性溶液。如滤液为酸性，应水洗至中性，再行活化处理。

b. 铁离子的检查－一般将硅胶混悬于盐酸中，搅拌，如含铁离子则与盐酸结合成复合物而显黄色。有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的可能性，因此最好以盐酸洗涤处理。在特殊情况下，硅胶须经乙醚、氯仿等有机溶

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剂预洗，至洗出液蒸干无残渣为止。

由于硅胶容易吸水，因此用前最好经120℃烘24小时活化，可不作活性测定。 ■ 硅胶的改良：

向层析硅胶中加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果，称改良吸附剂。例如以银处理的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。以1~10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110℃干燥即可。

表7-2 常用改良吸附剂

复合试剂 0.1~0.5 N 酸或碱 AgNO3 硼酸、硼酸钠、碱式醋酸铅 亚硫酸钠 氯化铁 硫酸铜 铁氰化锌 二、硅胶吸附层析的应用 ■ 硅胶层析的优、缺点：

优点：

(1) 有些化合物用氧化铝层析，吸附剂副反应较多，而且某些副反应即使用中性氧化铝仍难以避免。而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化，但一般副反应较少；

(2) 某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析，硅胶则无此特性；

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选择性分离物 pH敏感物质（生物碱、酸性、酚性、两性物质） 具有双键或三键物质 多羟基化合物 醛类 羟基喹啉类 胺类 磺胺类 (3) 氧化铝层析样品损失较多，而硅胶层析样品回收率较高。 缺点：

(1) 即分离效果有时较氧化铝为差，对杂质的吸附能力差； (2) 样品处理量相应的比氧化铝为低。

■ 硅胶吸附层析的操作

快速层析（Flash Chromatography）――既快速简便，又有相当分离效果。 注；玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。橡皮管连接处一般在压力为1kg/cm2

以下不会脱开。 ■ 操作步骤

1． 装柱

A.干法

向层析柱中加入0.5~1cmn高的硅胶H(100～200 mesh/目)，再将硅胶H（300～400 mesh左右，即38

m(10~40

m)）装入柱，敲紧或在出口处抽真空吸紧，使硅胶

层高约18～20cm，硅胶层面应水平，上部再加0.5～1cm高的纯净砂层或滤纸。然后加入洗脱用的溶剂，加压赶去硅胶内气泡，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。 B. 湿法

b1.即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中。最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段，容易影响分离效果。

b2.向硅胶中加入一定体积的溶剂，充分搅匀，加入到预先装有一定体积溶剂的层析柱内（已加粗硅胶H），同时打开活塞放出溶剂，硅胶下降。加压赶去硅胶内气

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泡，至层高约18～20cm，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约15～17cm。 2. 硅胶柱内包含溶剂体积的确定（干法）――取一定体积V0的溶剂，加压至砂板处，将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接受器中，当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填料表面，关闭活塞，量取接受器内溶剂量V1。则V0 V1即氧化铝柱内包含溶剂的体积依据

V。

V，在层析过程中，可知在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时候，

就可知道新换溶剂大致在何流份开始。

3. 加样

用尽量少的溶剂溶解样品，然后加至柱中，加压压入硅胶层。难溶样品拌入少量硅胶再装入，上面再复以砂层。 4. 洗脱

根据薄层层析资料的判断，用在硅胶薄层板上欲分点为Rf=0.2～0.3的展开溶剂洗脱，如有多点需分离时，可以改变洗脱溶剂的比例。用减压阀控制压力以调节洗脱速度，收集馏分。而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。

5. 样品收集

每一馏分用薄层板点样分析，每块薄层板上可点数个馏分点，用原料做对照，前一块板的最后一点应用于下一块板的第一点做对照点。将相同位置点的馏分合并，蒸除溶剂。

柱的粗细和进样量等的关系（表1）

这时施加的压力约0.4～0.7kg/cm2(可用压力表指示)。为了达到最好分离效果，使用者可根据具体样品摸索条件。

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表1

柱内径（mm） 硅胶用量（g） 加样量（g） 流速（ml/min） 每一馏分体积（ml） 14 17 25 35 52 10 16 35 70 150 0.2 0.5 1～2 4 8 5 10 15 20 30 2.5 4 8 15 25 例：

1.2g原料反应5d后，用硅胶薄层层析显示（展开剂：石油醚/乙酸乙酯8主要为二个斑点：Rf分别为0.23和0.14，相应于未反应原料和产物。

用快速层析法分离（柱内径25mm，青岛海洋化工厂硅胶H 35g，硅胶层加压后高17cm）。先用120ml石油醚/乙酸乙酯（8

2）洗脱，再用400ml石油醚/乙酸乙酯（8

2）2），

洗脱。加压力0.7 kg/cm2，流速0.5ml/min。开始80ml未收集，以后收集15ml左右为一馏分。馏分1～7：0.01g，低极性物；馏分8～15：0.49g，相应于Rf 0.23的原料；馏分16～18：交叉馏分；馏分19～34:0.37g相应于Rf 0.14的产物。收集时间约1.5h。

总之，此层析法可用于Rf差0.05到0.1的组分分离，一般在2h左右可分离一个样品，既达到一般柱层析的分离效果，又节省了时间，而且溶剂和硅胶用量也可减少。对不太稳定的化合物，用此法分离尤为适用。

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吸附柱层析硅胶的用量――样品与吸附剂的比例可为1作的难度，较难分离者有时甚至可选用1

500～1000。

30～60，但必须根据分离工

硅胶吸附层析适用范围――使用比较广泛，能用于非极性化合物，也能用于极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。 三、硅胶的再生

1. 由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单，一般可用乙醇或甲醇洗涤，或于索氏提取器连续抽提除去杂质，洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。

2. 硅胶的再生也可用5～10倍体积的1﹪氢氧化钠煮沸半小时，如仍不成强碱性(以酚酞作指示剂)，可追加适量1﹪氢氧化钠，趁热过滤，以蒸馏水洗三次，冉以3～6倍5﹪盐酸煮沸半小时，以蒸馏水洗至中性，120℃活化，过筛即得。 四、分配层析的原理及操作

一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，溶质在两层中浓度都有恒定的比例，这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。

如果需要分离的两种物质，在两相中的分配系数比较接近，则须利用不断地进行反复分配，如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。

1．分配层析的原理――分配层析是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上，因此称为固定相。另用一非极性溶剂(与固定相不相互溶)洗脱，此洗脱剂在层析过程中始终是移动的，称为移动相。溶质在固定相和移动相之间，在柱上作连续的、动态的不断分配，由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。

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2. 影响分离效果片的因素――两者的分配系数差值。如果相差较大，只要用较小的柱和较少的硅胶用量即能满意地分离，如果分配系数差值极小，则同样重量的样品往往要用较大的柱和用较多的硅胶才能分开。

3. 分配层析所用多孔支持剂――主要有硅胶、硅藻土(商品名Celite)、纤维粉等，近年来并有用有机支持剂的，如微孔聚乙烯粉等。

■ 操作――分配层析所用的仪器操作一般与吸附层析相同，将预先选定的固定相溶剂(一般为水溶液或极性溶剂)加入支持剂硅胶中，搅拌混合均匀，倾入事先选定的移动相溶剂中，激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡。层析管中放移动相(事先务必用固定相溶剂剧烈振摇，互相饱和，以造成层析时稳定的平衡条件)，将上述吸着固定相的硅胶湿法装柱，不断轻敲管壁或加压，使固定相支持剂压紧。样品一般可溶于移动相中上柱，继以移动相洗脱，按固定体积收集，分别浓缩处理。 ■ 分配层析操作注意事项：

(1) 移动相体积常大于固定相5～l0倍，即相当于以5～10倍体积的有机溶剂向水溶液萃取，而分配系数的含意为溶质在两相中的浓度比，若体积增大，实际抽提出量也大。因此在分配层析中选择固定相与移动相时，要考虑样品在两相中的分配比（样品于移动相中的浓度/样品于固定相中的浓度），应在0.1～0.2时较适宜。较大则很快从柱上洗脱，分离效果较差，如分配比过大则可采用反相分配层析，即以非极性溶剂作固定相，极性溶剂作移动相。

(2) 所用固定相与移动相溶剂，务必相互饱和，否则层析过程中固定相体积不断减少或增加，平衡条件就被扰乱。

(3) 选用支持剂(硅胶)与吸着固定相的比例为1于本身重量50～100﹪固定相溶剂，较为适宜。

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0.5～1即层析时硅胶吸有相当

(4) 样品上柱可采取三种方式：

a. 如样品能溶于移动相溶剂，可用少量移动相溶剂溶解，加于柱顶再行展开； b. 如样品难溶于移动相，易溶于固定相，则可用少量固定相溶剂溶解，用硅胶吸着，装于柱顶再行展开；

c. 如果样品在两相中溶解度均不大，则可溶于适当的溶剂，拌于干燥硅胶上，待溶剂挥发去尽后，加50～100﹪的固定相溶剂拌匀再上柱。

(5) 层析柱固定相支持剂段直径与长度的比为l的成分分离，往往可加大至1

40以上。

100～1,000，主要决

100～

10～20，对分配系数比较接近

(6) 分离样品时支持剂的用量一般较吸附层析为大，为1

定于分离工作的难易，对分配系数比较接近的成分的分离甚至可采用110,000。

(7) 为使溶质在两相间达到平衡，移动相流速宜慢些，大致固定相支持剂的直径与高度为2.6

50厘米，流速0.07毫升／分钟；4.5

65厘米为0.3毫升/分钟；5.5

90

厘米为0.6毫升／分钟；6.5115厘米为1.2毫升／分钟。

（8）分配系数往往会因温度变化而变化。因此对要求较高的实验，层析管最好有隔层套管，以便通水保持恒定的温度。 五、分配层析溶剂系统的选择

一般酸性酚性物质及生物碱类常可用缓冲液(酸、碱性溶液)作为固定相(见表7-5)。还可根据具体化合物的溶解度、极性情况灵活选用。

表7-5 硅胶分配层析溶剂系统的选择

化合物名称 水溶性生物碱 固定相 水或缓冲溶液 丁醇 移动相 第 10 页

缓冲溶液 水 水 水 乙酸乙酯 氯仿或乙酸乙酯 乙酸乙酯（含0.5%甲醇） 环己烷 甙类 酚性化合物 有机酸 0.05N或0.5N H2SO4 环己烷：氯仿（或石油醚、苯、乙醚）=3:1 磷酸缓冲溶液 氯仿:乙醚=1:1或环己烷 氨基酸的DNP衍生物 甾体化合物 不同pH的缓冲溶液 乙醚、氯仿、正丁醇 水 甲醇 乙二醇 甲酰胺 石油醚 环己烷 甲苯 异丙醚 六、硅胶分配层析的应用

分配层析分离主要决定于分配系数的差异，一般说各类型化合物均能适用，特别适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者，因此刚巧能弥补一般吸附层析(如氧化铝层析适用于亲脂性物质)的不足。但分配层析样品处理量较少。

分配层析往往适用于水溶性及极性较大的生物碱、甙类(强心甙，皂甙)、有机酸、酚性成分、糖类及氨基酸的衍生物，对某些非极化合物如甾体、油酯…等有时也可用反向分配层析进行分离。 七、硅胶分配层析操作实例

狄戈辛(Digoxin) 即异羟基洋地黄毒甙)的分离

国产层析硅胶80～100目用量为分离样品的100倍，加2／3量的水(预先以乙酸

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乙酯饱和)调匀，再以乙酸乙酯(水饱和)浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比为1：20以上。

取毛地黄次生甙总甙与1～2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇)洗脱，分部收集，各流份均作纸层析及薄层层析（硅胶G硬板)检查，比移值相同部分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得洋地黄毒甙(Digitoxin)、羟基洋地黄毒甙(Ci-toxin)、异羟基洋地黄毒甙(Digoxin)等三种单体。

硅胶G薄层层析展开溶剂：二氯乙烷-甲醇-甲酰氨(80：19：1)；显色剂：三氯醋酸。

第二章 氧化铝层析

■ 氧化铝层析――适用于亲酯性成分分离。广泛用于生物碱、甾体化合物、强心甙、精油、内酯化合物等中草药成分的分离。

■ 优缺点――有价廉、分离效果好、再生容易等优点；缺点是能与部分酚性化合物（如有些黄酮类化合物、部分三萜酸）结合因而不能应用。 一、各种氧化铝的制备及其应用 层析用氧化铝的种类及用途：

1. 碱性氧化铝pH 9～10。用于碳氢化合物的分离，和从碳氢化合物中除去含氧化合物，以及某些对碱溶液比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物碱、醇，以及其他中性、碱性物质的分离。

2．中性氧化铝 pH7.5。应用最广泛，适用于醛、酮、醌、某些甙及酸碱溶液中不稳定的化合物如酯、内酯等化合物的分离。

3．酸性氧化铝pH 4～4.5。适用于天然及合成酸性色素及某些醛、酸的分离。 水提取液二、氧化铝的活化及活性的改变

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1．氧化铝的活化

氧化铝的活性与含水量关系极大，在一定温度下除去水分就可以使氧化铝活化。氧化铝加入一定量水即可使活性改变。活性水量的关系大致如图6—l。

表6 1 氧化铝中加入水量与活性关系

加入水量% 0 3 6 10 15 氧化铝活性 I级 II级 III级 IV级 V级 氧化铝（碱性、中性或酸性）的活化――400℃左右加温6小时，即得I～Ⅱ级氧化铝。

如果活化温度过高，引起氧化铝内部结构的改变，它的吸附力将引起不可逆的下降，而不能供层析应用。 三、氧化铝层析操作

1．操作基本与硅胶吸附层析相同

2. 氧化铝的用量――一般采用样品量的20～50倍，根据被分离化合物的性质而定。遇到碳氢化合物如萜烯、倍半萜烯…等，氧化铝对这些化合物的吸附力较弱，层析时氧化铝用量略增，为样品量的100～200倍， 3．层析洗脱用的溶剂

a. 洗脱能力――与溶剂极性有关。极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步增加溶剂的极性，可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物逐个洗脱，达到分离的目的。

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表6-4 常用层析洗脱用溶剂次序与介电常数关系

溶剂 介电常数 层析洗脱时使用次序 己烷或石油醚 苯 氯仿 乙醚 乙醇 水 1.88 2.30 5.20 4.50 25.80 81.00 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 更换溶剂时，为了逐步提高溶剂的洗脱能力，常用混合溶剂作为过渡，开始时逐渐缓慢地增加较大极性溶剂的比例(自0～10%)； 以后每次递增5～10%，使较大极性溶剂比例自10%递增到50%；然后再更换较大极性溶剂。实际操作过程中，根据薄层层析资料的判断，及初步层析结果的分析。 b. 层析用溶剂的处理：

①．除去溶剂中某些极性较大的杂质(如氯仿中的乙醉)； ②．除去溶剂中某些不挥发物质，以免污染洗脱流份； ③．并应注意溶剂中含水量。 4．氧化铝的再生 ’

a. 层析后，除去氧化铝柱上端含聚合物及带有深颜色的氧化铝；

b. 用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用； c. 为了使吸附在氧化铝表面的有机物分解，高温活化时间可适当延长。 活化后，氧化铝的颜色比使用后的稍淡。一般来说，氧化铝可重复使用多次，随

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层析过程中有机物污染的程度而定。 四、氧化铝层析过程中引起的一些副反应

氧化铝层析时引起的一些副反应，例如某些化合物层析时引起的异构化、氧化、皂化、水合，以及脱氯化氢形成双键等反应，已有一些报道。进行层析时应加以注意。

1．溶剂洗脱法——洋艾中内酯成分的分离

第三章 聚酰胺层析

■ 聚酰胺(Polyamide)――是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，商品名：锦纶、尼龙。

■ 聚酰胺层析用途――分离极性和非极性物质的广泛的层析方法，如黄酮体、酚类、醌类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、甙类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等。尤其是对黄酮体、酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法优越。

■ 特点：对黄酮体等物质的层析是可逆的，分离效果高，可使性质极相近的类似物得到分离；其柱层析的样品容量大(吸附剂用量为样品量的10~20倍)，适于制备分离。 一、聚酰胺的性质 ■ 层析用聚酰胺的种类：

常用锦纶6(聚己内酰胺)、锦纶66(聚己二酰己二胺)，其亲水、亲脂性能较好。既可分离水溶性物质，又可分离脂溶性物质。 ■ 聚酰胺的溶解性和稳定性：

锦纶6和锦纶66可溶于浓盐酸、甲酸；微溶于乙酸、苯酚等溶剂；不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等常用有机济剂。对碱较稳定，对酸的稳定性较差(特别是无机酸)，温度高时更敏感。

■ 分子量的大小对聚酰胺的理化性质及层析性能的影响：

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锦纶6和锦纶66的分子量在16,000—20,000较好。其熔点在200℃以上。分子量太小的聚酰胺，在常用有机溶剂中的溶解度较大，而且不太稳定，在处理过程中易被酸、碱破坏；在层析过程中易溶于洗脱剂而污染分离样品。分子量太大的聚酰胺，亲水性及可塑性较差，亦不适用。 二、基本原理

(一) 吸附层析

一般认为聚酰胺层析是吸附层析。由于聚酰胺分子内有很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而对这些物质产生了吸附作用。

形式氢键的能力与溶剂有关，一般在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。各种化合物由于与聚酰胺形成氢键的能力不同，聚酰胺对它们的吸附力也不同。在含水溶剂系统中，大致有下列规律：

（1）形成氢键的基团（如：酚羟基、羧基、醌基、硝基等）越多，则吸附力越强。如：丁二酸>丁酸

(2)形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。如：

(3)芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附力小。如： (4)若形成分子内氢键，则使化合物的吸附力减小。如： (二) “双重层析”

聚酰胺具有“双重层析”性能。因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪链，又有极性酰胺基团。当用极性移动相(如含水溶剂系统)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行径类似于反相分配层析。当用非极性移动相时，聚酰胺则作为极性固定相，其层析行径类似正相分配层析。

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例：聚酰胺层析可以分离某些很难与聚酰胺形成氢键的物质——萜类、甾体、生物碱等。如：黄酮体甙与甙元的分离（前者比后者极性大），若以含水溶剂(如：甲醇—水)作洗脱剂，黄酮体甙比其甙元先洗脱下来；而非极性溶剂(如：氯仿—甲醇)的洗脱结果恰巧相反——黄酮体甙元比其甙先洗脱下来。 三、聚酰胺层析的应用

1.分离黄酮体及某些酚类物质――聚酰胺层析是最有效的方法，可将植物粗提物中的黄酮体与非黄酮体、黄酮体甙元与甙分开。若采用含水溶剂系统（如：乙醇-水)，非黄酮体水溶性成分及少数黄酮体甙可用水冲洗下来。大多数黄酮体甙在10~30%乙醇液中洗脱下来，而甙元则在50一96%乙醇液中才能冲洗下来(见实例1)。黄酮体甙元的混合物用非极性溶剂系统分离较好。

2. 除去植物粗提取物中的鞣质――聚酰胺对鞣质的吸附特别强，高分子鞣质对聚酰胺的吸附是不可逆的。 ■ 聚酰胺层析的溶剂系统

(1).含水溶剂系统适用于各种甙类、糖类、有机酸等水溶性成分的分离，以及黄酮体甙与甙元、黄酮体与水溶性脂肪族成分(如糖类、脂肪族有机酸)等的分离。在含水溶剂系统中增加有机溶剂的比例，可使Rf值升高，洗脱能力增加。

(2) 非极性溶剂系统。非极性溶剂系统则用于萜类、甾体、黄酮体甙元、酚类、醌类等极性不太高的化合物的分离。在该溶剂系统中增加极性溶剂的比例，可使Rf值升高，洗脱能力增加。

若在各种溶剂系统中加入少量酸或碱，可克服层析中的“拖尾”现象，并使色带集中。

表3-1聚酰胺薄膜层析常用溶剂系统

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化合物类别 黄酮体甙元 展层溶剂 氯仿-甲醇（94:6或96:4），氯仿-甲醇-丁酮（12:2:1） 苯-甲醇-丁酮（90:6:4或84:8:8），氯仿-甲醇-甲酸（60:38:2） 氯仿-甲醇-吡啶（70:22:8），氯仿-甲醇-苯酚（:28:8） 甲醇-醋酸-水（90:5:5），甲醇-水（4:1），乙醇-水（1:1），丙酮-水（1:1） 黄酮体甙 异丙醇-水（3:2），30%~60%醋酸，醋酸乙脂95%乙醇（6:4） 氯仿-甲醇（7:3），正丁醇-乙醇-水（1:4:5），氯仿-甲醇-丁酮（65:25:10） 酚 类 丙酮-水（1:1），苯-甲醇-醋酸（45:8:4），环己烷-醋酸（93:7），10%醋酸 醌 类 10%醋酸，正己烷-苯-醋酸（4:1:0.5），石油醚-苯-醋酸（10:10:5） 糖 类 生 物 碱 醋酸乙酯-甲醇（8:1），正丁醇-丙酮-水-醋酸（6:2:1:1） 环己烷-醋酸乙酯-正丙醇-二甲基胺（30:2.5:2.9:0.1） 水-乙醇-二甲基胺（88:12:0.1） 苯-醋酸（8:2或9:1），50%醋酸，甲酸-水（1.5:100或1:1） 醋酸乙酯-甲醇-醋酸（20:1:1），0.05M磷酸三钠-乙醇（3:1） 二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇（5:10:30:20），氯仿-醋酸（8:2） 己烷-丙酮（4:1），氯仿-丙酮（4:1） 甲醇-水-甲醇（60:35:5），醋酸乙醋-甲醇-水-甲酸（50:20:25:5） 第 18 页

氨基酸衍生物 甾体，萜类 甾 体 甙 四、酰胺层析实验技术

1．聚酰胺粉的处理

■ 锦纶中通常有两种杂质：一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物。另一种是蜡质(锦纶丝在制成后，表面曾涂过一层蜡)。这些杂质必须除去，否则原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物。蜡质能被醇液洗脱下来，与分离之物质混在一起难以除去。

■ 除去单体及小分子聚合物的方法:

(1) a. 除单体及小分子聚合物------二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇(5:10:30:20)混合液洗涤。

b. 除去蜡质------用甲醇-二氯乙烷(1:1)混合液洗涤。 (2) 依次用90~95%乙醇、5%NaOH、10%醋酸洗涤：

取制得的聚酰胺粉以90~95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中。用3~4倍体积的90~95%乙醇洗涤：洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用2~2.5倍体积的5％NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2~2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，备用。

2．柱层析操作

(1) 装柱：

a. 用含水溶剂系统层析，常以水装柱--------层析管内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部。并除去玻璃纤维中的气泡。处理过的聚酰胺粉以蒸馏水浸泡l小时左右，不断搅拌除去气泡。倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。一般在上节所述锦纶的处理中柱已装好，不必再装。

b. 用非极性溶剂系统层析时，常以溶剂组份中极性低的组份装柱。若以氯仿装

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柱，因其比重较大使聚酰胺粉浮在上面。加样时应将柱底端的氯仿层放出，并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧。洗脱过程中，需关柱暂停时，应将顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层带。

(2) 加样：聚酰胺的样品容量较大。一般每100毫升聚酰胺粉可上样1.5～2.5克。可根据具体情况适当增加或减少-------当欲分离之成分在样品中的相对含量较低，且易吸附于柱上，而其他成分不易吸附时，则可将上柱量增大。使大部分成分很快从柱上流下，而欲分离之成分经适当洗脱即可得到；当欲分离之成分不易被吸附且不易吸附之成分不只一个，则样品上柱量必须大大减少。

若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱量可大大增加。通常观察鞣质在柱上形成橙红色色带的移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。

样品常用洗脱剂溶解。浓度在20~30%。不溶样品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易挥发溶剂溶解。拌入干粉中，拌匀后将溶剂减压蒸去，以洗脱剂浸泡装入柱中。

(3) 洗脱： ① 溶剂体系：

a. 含水溶剂――水，由稀至浓的乙醇液（10%、30%、50%、70%、95%）依次洗脱； b. 非极性溶剂――氯仿，氯仿-甲醇(19:1，10:1，5:1，2:1，l;1)，甲醇依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用3.5%氨水洗脱。

c. 若用锦纶分离芳香硝基化合物或DNP-氨基酸。因其对锦纶的吸附很牢，上述洗脱剂很难洗脱，可用DMF-HOAc-H2O-EtOH（5;l0:30:20）混合液洗脱。

② 洗脱剂的更换

一般根据洗脱液的颜色，当颜色变为很淡时更换下一种溶剂。以适当体积分瓶收集，分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其成分，成分相同者合并。

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(4) 聚酰胺粉的回收

用过之聚酰胺粉，一般用5%NaOH洗涤，洗至氢氧化钠液颜色极淡为止。有时因某些鞣质与聚酰胺有不可逆吸附，用氢氧化钠很难洗脱时，可用5%NaOH液在柱中浸泡。每天将柱中之氢氧化钠液放出一次，并加入新的氢氧化钠液浸泡，这样浸泡洗涤一周后，鞣质可基本沈完。然后用蒸馏水洗至pH8～9，再以2倍量10%醋酸洗，最后以蒸馏水洗至中性，供重复使用。

3. 聚酰胺薄膜

■ 聚酰胺薄膜――将聚酰胺在涤纶片基上涂成一薄膜，供薄层色谱用，市售产品出厂时己初步活化。

■ 活化――使用时，可将膜在恒温干燥箱内40℃~60℃干燥 4h, 取出置干燥器内冷却，备用。

■ 再生――层析后可用丙酮和氨水(25%~28%) 或丙酮和90%甲酸 (9:1，V/V) 浸泡6h , 把污物洗去后 , 再用甲醇洗涤，凉干后活化处理后重复使用。一般可重复使用10 次以上。

五、聚酰胺层析操作实例

1．染料木素和染料木素-4'-葡萄糖甙的分离

槐Sophora japonica L.角的酒精提取物，以酸水解后析出沉淀物，该沉淀物依次以乙醚、甲醇提取。取甲醇提取物28克，以甲醇溶解，拌入聚酰胺粉(60克)中，减压抽干，磨细。加在预先以水为溶剂填装的5.3

59厘米的聚酰胺柱顶。依次以水、

30%乙醇、50%乙醇洗脱，每种溶剂洗至有很少物质洗下时改换下种溶剂。在30%乙醇洗脱之各流份中，析出白色针品，以二甲基甲酰胺复结晶，熔点257℃，经鉴定为染料木素-4'-葡萄糖甙(Genistein-4'-glucoside，Sophoricoside)。50%乙醇洗脱物的

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前几个流份，析出黄色针晶，以甲醇-水混合液复结晶，熔点：294~296℃，经鉴定为染料木素(Genistein)。

第四章 大孔吸附树脂层析

一、原理

大孔吸附树脂是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。它的性质与活性炭相似，可以有效地吸附不同化学性质的各种类型化合物，它所具有的吸附性与范德华引力或形成氢键吸附有关。

a).大孔吸附树脂具有吸附作用的一个重要方面是因为它具有各种不同的表面性质，例如疏水性的聚苯乙烯能将低极性的有机化合物吸附，主要依靠分子中的亲脂键、偶极离子及氢键的作用。

b).大孔吸附树脂的吸附能力不仅与自身的化学论结构、物理性能有关、而且与溶质的性质有关。根据“相似相溶”的原则,一般非极性吸附树脂适宜于从极性溶剂(如水)中吸附非极性物质，极性树脂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，而中极性吸附树脂则对上述两种情况都具有吸附力。由于是分子吸附，这种吸附力的特点是解吸容易。

c).此外，由于吸附树脂具有多孔性网状结构，还具有筛选性分离的特点，因此欲分离的物质可依其分子体积的大小及吸附力的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂上，以适当的溶剂洗脱而达到分离的目的。 ■ 优点：

大孔吸附树脂由于具有选择性好，吸附容量大，机械强度高，再生处理方便，吸附速度快， 解吸容易等优点， ■ 用途：

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现广泛应用于工业废水的处理，维生素、抗生素的分离提纯及水溶性天然产物成分的提纯 , 近年多用于皂甙及其它甙类化合物的分离。 二、大孔吸附树脂的类型及性能：

■ 理化性质――大孔吸附树脂一般为白色颗粒状，粒度多为20目～60目，理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性较好，不受无机盐类存在的影响。 ■ 按性能类型：

a).非极性吸附树脂――以苯乙烯为单位、二乙烯苯为交联剂聚合而成，故称为芳香族吸附剂。

b).中极性吸附树脂――以甲基丙烯酸酯作为单体和交联剂聚合而成，也称为脂肪族吸附剂。

c).极性吸附剂――在结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。

日本三菱化学(Mitsubishi Chemical) 大孔吸附树脂

DIAION DIAION SEPABEADS SEPABEADS 类型 HP20 HP21 SP825 SP850 SP207 HP2MG(L) CH3CH2CCCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHSEPABEADS DIAION CH3COOCH3CH2CO化学结构 O(CH2)2CH2CH CH2CHBr OCCH2CCH3O 孔容积1.3 (mL/g) 比表面600 570 1000 1000 第 23 页

600 500 1.1 1.4 1.2 1.3 1.2 积(m/g) 孔半径20 (nm) 表观密度(g/L-R) 水含量55-65 (%) 均匀系 1.6 数 皂甙、黄酮、萜适宜分类、天然色素、离成分 内酯 ► 苯乙烯类 Diaion HP20、HP21 是大孔合成吸附和脱附树脂，有相当大的孔径适合对大分子的吸附。用通常的有机溶剂、酸、碱来洗脱被吸附的物质。在工业上被广泛应用，特别对天然产物和小分子的吸附、脱盐、脱色。

► 苯乙烯类 SEPABEADS SP825、SP850 树脂是大孔聚苯乙烯吸附树脂。比HP系列树脂有更大的表面积的和窄均匀的孔径分布。其表面积约为HP20树脂的2倍 , 对小分子的吸附容量是HP20的2倍以(< l500MW) 可用于吸附、脱盐、脱色。

► 化学改性的苯乙烯类 SEPABEADS SP207 是用溴基团化学键合到己交联的聚苯乙烯基体上的大孔吸附树脂。他比纯聚苯乙烯树脂有更高的憎水性 ( 对非极性分子有

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酯 低聚糖 酚性甙、黄酮、弱极性生物碱、皂甙、内生物碱、酚性甙、黄酮、 1.6 45-55 52-62 46-52 43-53 55-65 680 625 690 670 780 720 8 5.7 3.8 11 12 2较高的选择性 ) 。比其他苯乙烧树脂的比重高1.2倍左右向它适合用于逆流洗脱 (EBA)

► 甲基丙烯酸酯类 Diaion HP2MG。是一种中等极性的吸附树脂，有较强的亲水性。它适合脱盐和吸附较强极性的化合物。 ►三菱大孔吸附树脂使用性能

1 、韧性大、机械强度高、不易破损。 2 、载量大，是国产同等类型的 3－5 倍。

3 、寿命长、注意保护使用可重复使用 l00 次以上。 4 、颗粒均匀、分离效果好。

5 、残留物少、干净己处理极其方便。 7 、膨胀系数小、分离效果好。

美国罗门哈斯(ROHMHAAS)Amberlite XAD系列大孔吸附树脂

均一系树脂 类型 树脂 牌号 比表面积(m2/g) 平均孔径(nm) 偶极距 平均粒数 径(μm) D90/D40 聚 苯 XAD4 乙 烯 750 10 0.4 0 1.6 分子非极性物质 除去有机溶剂和其他小应用 第 25 页

基 提取小分子的抗生素和XAD16 800 15 － 700 1.6 植物有效成分，如黄酮、皂甙类物质 提取小分子的抗生素和XAD1600 800 15 － 400 1.2 植物有效成分，有色谱分离作用 提取大分子的抗生素、XAD1180 700 40 － 530 1.6 维生素、多肽和动植物有效成分 甲 基 丙 XAD7HP 500 45 1.8 560 1.7 提取多肽和植物色素、多酚类物质 第 26 页

烯 酸 酯 XAD761 200 60 1.6 700 1.5 提取蛋白质、多肽和动植物有效成分，用于果酸、有机酸的脱色 ■ 树脂类型应用的选择

依据树脂的孔径、表面积及极性不同，

a).分离极性较大的化合物应选用中极性的树脂，而极性较小的化合物则选用非极性树脂来分离。

b).凡要吸附分子量大的化合物，应选择较大孔径的树脂，吸附分子量小的物质，则选择比表面积高及孔径较小的吸附剂。 三、大孔吸附树脂的预处理及再生

1、预处理

为了保护树脂不受霉菌的侵蚀，新购的树脂一般是用氯化钠及硫酸钠处理过的，同时树脂内部尚存在未聚合的单体，残余的致孔剂、引发剂、分散剂等，故用前必须除掉。

a).将新购的大孔树脂加足量的水，使其溶胀至体积不再增加为止，然后倒入内有少许水的交换柱内，使管内树脂量不要超过管长1/2以上，水在柱内的高度没过树脂；

b).装好柱后，先缓慢地让水从柱的底部流入反洗，并逐渐加速，使树脂全部移动，直至树脂内的气泡全部赶出，同时悬浮不洁物、破碎及过小颗粒从管顶逸出为止；

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c).然后再用甲醇或95%乙醇或丙酬浸泡24h后洗涤,也可将树脂与有机溶剂一起在水浴上回流,直到洗涤液加水混合后不呈白色浑浊为止,最后用水洗掉所用的有机溶剂，备用。

或甲醇（也可是乙醇）与水交替洗脱2~3次，每次用量为树脂体积的2~3 倍，最后用水洗脱。

2、再生

a).若洗脱剂为非水溶性的有机溶剂，可用甲醇反复冲洗树脂柱。 b).若洗脱剂为水溶性的，用蒸馏水反冲洗净洗脱剂即可。

c).经反复使用，当吸附树脂颜色变深，吸附效果下降时，可用3%盐酸或3%氢氧化钠依次浸泡12h, 然后用蒸馏水洗至中性即可。

d).如果柱上有悬浮物和破碎的小树脂颗粒，可将树脂盛于烧杯中，用浮选法除去，再重新装柱。大孔吸附树脂应湿态保存，如部分颗粒暴露在空气中失水，可用乙醇或丙酮浸渍处理后使用。 四、装柱和上样

■ 大孔吸附树脂采用湿法装柱，湿法上样。上样液一般为浓缩液，以澄清的为好，由于上样溶液的pH对化合物的分离影响很大，所以应引起注意。一般酸性化合物在适当的酸性溶液中可被充分吸附，碱性化合物在碱性条件下易被吸附，中性化合物则在中性条件下吸附较好，

■ 树脂吸附容量的测定――取10mg/ml的溶液10ml，加入0.1g树脂，摇匀，(于冰箱中)放置3d.,充分吸附后，测定溶液浓度，计算差值。各量可视情况而变。 五、洗脱剂的选择

a. 是采用对化合物有较好溶解度的溶剂，这样可以得到高浓度的洗脱液。最常用

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的是水、低级醇、丙酮、乙酸乙酯等；

b. 对非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱力越强（丙酮>乙醇>水）。 c. 对极性大孔树脂和极性较大的化合物，则用极性强的溶剂更能满意分离； d. 对弱酸性的化合物可用碱来解吸 , 如 XAD-4 吸附酚后 , 可用氢氧化钠解

吸 , 氢氧化钠最适浓度为0.2%~0.4%;

e. 对弱碱性物质 , 可用酸来解吸；

f. 可用几种不同浓度洗脱剂洗脱，以确定最佳洗脱剂浓度 , 或采用不同极性梯

度的洗脱剂分别洗下不同组分；

g. 洗脱速度一般控制在 0.5ml/min~5ml/min 比较合适。 洗脱液经检测后 , 将

相同组分合并。

六、树脂柱的清洗

层析后的树脂表面或内部残留着杂质。杂质中非吸附性成分一般用水洗涤即可，

吸附性杂质可根据其性质，选用低浓度的醇洗除，一般情况下，洗至近无色即可。

第五章 活性炭层析

■ 用途――活性炭柱层析对于分离水溶性物质(如氨基酸、糖类及某些甙类)是一种较好的方法，它是分离水溶性物质的主要方法之一。

■ 优点――样品上柱量大（一般每100毫升活性炭可上样5~10克），分离效果好，活性炭来源较易，价格便宜，适用于大量制备分离。

■ 缺点――由于活性炭的生产原料不同，制备方法及规格不一，其吸附力不象氧化铝、硅胶那样易于控制，目前尚无测定其吸附力级别的理想方法，因而了其广泛应用。

一、活性炭的来源、规格及性能

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■ 来源――动物炭、植物炭和矿物(煤)炭三种。分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。医药用活性炭及层析用活性炭多以木屑做原料，加氯化锌在700～800℃高温炭化、活化，经适当处理除去杂质而制成。由于植物体内含有各种金属离子及生产过程中加入氯化锌，故易含有微量重金属离子。 ■ 用于层析的活性炭，基本上可以分三类：

(1) 粉末状活性炭：一般采用医药用或化学纯活性炭。该类活性炭颗粒极细，呈粉末状，其总表而积特别大，吸附力及吸附量也特别大，是活性炭中吸附力最强的一类。但是，由于其颗粒太细，在层析过程中流速极慢，需要加压或减压操作。

(2) 颗粒状活性炭――颗粒较前者为大，其总表面积也相应减小，吸附力及吸附量也较次于前者。但是，在层析过程中流速易于控制，勿需加压或减压操作。 (3) 锦纶-活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成颗粒。其总表面积较颗粒状活性炭为大，较粉末状活性炭为小，其吸附力较二者皆弱。因为锦纶不仅单纯起一种粘合作用，它也是一种活性炭的脱活性剂，因此可用于分离前两种活性炭吸附太强而不易洗脱的化合物。用其分离酸性氨基酸及碱性氨基酸：可取得很好效果。流速易控制，操作简便。 二、活性炭的选择及运用

■ 选择适当吸附力的活性炭

欲分离的物质不易被活性炭吸附时，则要选择吸附力强的活性炭。当欲分离的物质很易被活性炭吸附时，则要选择吸附力弱的活性炭。

在首次分离某种样品时，一般首先选用第二类活性炭。当发现其对欲分离之物质因不能吸附而未达到分离目的时，则改用第一类活性炭。当发现其对欲分离之物质因吸附过强而不能洗脱，或因很难洗脱而造成洗脱溶剂体积太大流份不集中时，则改用第三

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类活性炭。一般尽量避免应用第一类活性炭(即粉末状活性炭)，它的吸附力太强，有许多物质吸在上面极难洗脱。

■ 三类活性炭联合应用――分离较复杂的植物成分

将欲分离之样品先通过第三类活性炭柱，对活性炭附着力最强的物质吸在该柱上。其不吸附物再通过第二类活性炭柱，附着力稍次之物质吸在该柱上。其不被吸附物最后通过第一类活性炭柱。这样依次通过三根柱，在三根柱上吸附的物质分别用适当的溶剂洗脱，就达到较好的分离效果。 三、活性炭对物质的吸附规律及应用

活性炭在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力如下：

(1) 对极性基团(如—COOH，—NH2，一OH等)多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。

例如，活性炭对酸性氨基酸和碱性氨基酸的吸附力大于中性氨基酸。可借，可将酸性氨基酸或碱性氨墓酸与中性氨基酸分开。又如，活性炭对羟基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸，因为羟基脯氨酸比脯氨酸多一个羟基。

(2) 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。

可将芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸(两者的氨基和羧基数目相同)分开。也可将某些水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。

(3) 对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。

例如，活性炭对肽的吸附力大于氨基酸，对多糖的吸附力大于单糖。因此可利用活性炭分离氨基酸与肽，单糖与多糖。氨基酸、单糖先洗脱下来；肽、多糖后洗脱下来。

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四、实验技术

1．活性炭的处理 (1) 除气

活性炭是一种强吸附剂，对气体的吸附力及吸附量都很大。气体分子占据了活性炭的吸附表面，因而造成所谓活性炭“中毒”，使其活力降低。同时，又有一些气体如氧气可引起某些副反应。最简单方便的方法就是加热烘千，可将吸附的绝大多数气体除去。

一般在用前150℃加热干燥4~5小时即可。锦纶-活性炭，因锦纶受热温度高要变形，在用前100℃干燥4~5小时即可。

(2) 除金属离子

医药用、化学纯、766-1、769活性炭在出厂前对所含杂质及重金属均经检查，符合规定要求。锦纶-活性炭在制备过程中也经大量酸洗、水洗，勿需特别处理即可应用。

工业用活性炭在用前必须进行严格处理，一般处理方法有二：

a. 加入2-3N盐酸，水浴加热半小时，然后减压滤干，如此以酸处理二至三次，再以热蒸馏水洗涤至pH5~6，滤干，烘箱中150℃干燥8小时。置于瓶中，密塞备用。

b. 加20%醋酸水溶液，煮沸5～10分钟，减压滤干，以除去含氮杂质及部分金属离子。如此处理二至三次，再以热蒸馏水洗至pH5~6，滤干。将其悬浮于水中，每100克活性炭中加入50毫克(预防重金属离子的催化作用)，直火加热，在60℃保持l0分钟，趁热过滤，以热蒸馏水洗至pH6~7，烘箱中100℃干燥至恒重，于瓶中密塞备用。

2．减活性的方法

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活性炭对某些物质有不可逆的吸附作用，致使某些物质吸在上面无法洗脱。在此情况下必须对活性炭减活性；一般采用长链脂肪族化合物，如硬脂酸、油酸、十一烷酸、十八烷、十八烷胺等。其中以硬脂酸为最常用。方法如下：

活性炭以1.5%(W/V)硬脂酸乙醇液浸没，搅拌1小时后，在搅拌下用9倍量的蒸馏水稀释，减压滤干，以蒸馏水洗，滤干后空气干燥或真空干燥，备用。

3．柱层析的操作

(1) 装柱：活性炭在水中吸附力最强，一般在水中装柱。层析管内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部。并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡l小时左右，不断搅拌除去气泡。倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。

粉末状活性炭因流速太慢，则需与硅藻土(1:1)混合后，再用蒸馏水调成糊状装柱。并且待样品上柱后，层析管顶端连一有自动控制的加压泵或层析管下端连一减压泵进行层析。

(2) 样品上柱

样品一般用水溶解。浓度在25~50%(g/mL)之间，即1克样品溶于2—4毫升水中。活性炭层析的样品上柱量较大，一般每100毫升活性炭可上样5~10克。在某些情况下，样品的上柱量及样品浓度可适当增加或减少（参看聚酰胺层析实验技术项下“样品上样”）。

某些样品在水中不易溶解时，可加适量甲醇、乙醇或丙酮使其溶解。但样品体积不可太大，样品上柱量也应相应减少，否则影响分离效果。

(3) 洗脱：洗脱溶剂一般采用水、各种浓度的乙醇液。其它如6~10%丙酮液、2～5%醋酸、1～5%苯酚水溶液等（但不常用）。最常用的是水，由稀至浓的乙醇水溶液梯度洗脱。其 洗脱顺序是：水，10%、20%、30%、50%、70%的乙醇溶液。若仍有部分

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物质未洗脱下来，最后可用适当有机溶剂或3.5%氨水洗脱。

4. 回收

用过之活性炭可以用酸碱处理回收。因活性炭来源较易，价格便宜，一般不回收使用。

五、活性炭层析操作实例

鹧鸪菜驱蛔有效成分海人草酸的分离及板蓝根中氨基酸的分离。

第六章

■ 原理

离子交换层析

离子交换――是利用一种不溶性高分子化合物，它的分子中具有解离性基团(交换基)，在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交换作用：

交换反应都是平衡反应，在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正反应方向进行，直至完全，因此可以把离子交换剂上的原有离子全部洗脱下来。当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，因此也可以全部被交换而吸着在交换剂上，

用离子交换法从待分离物质中交换含游离离子基团的酸、碱及两性成分，使与无游离离子基团的中性物质分开，而被吸着的物质可用另一洗脱液洗脱下来法。

如有两种以上的成分被吸着在离子交换剂上，用另一洗脱液洗脱时，它们的被洗脱能力决定与各别洗脱反应的平衡常数。利用各别被洗脱能力的不同进行分离即为离子交换层析。

■ 用途――分离有机酸、酚、碱、氨基酸、肽等

■ 填料――用途最广的是离子交换树脂。另外也有在纤维素或多聚糖上人工引入交换基所成的离子交换剂，后者大多用于植物大分子蛋白质、核酸、酵素及多糖体的分

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离精制。

一、离子交换树脂的种类及性能

（一）种类

离子交换树脂是一种合成高分子化合物，一般呈球状或无定形粒状。离子交换树脂主要可以分为两大类，即阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

a. 阳离子交换树脂中的解离性基团是磺酸(一SO3H)、磷酸(一PO3H2)、羧酸(一COOH)和酚性羟基(－OH)等酸性基团。

b. 阴离子交换树脂中含有季铵、伯、仲、叔胺等碱性基团。

亦有两性离子交换树脂、络合树脂等。各类树脂根据它的解离性能大小，可分为强、中、弱等。

1．强酸性阳离子交换树脂

（1） 苯乙烯强酸型树脂：一般为黑褐色。是最常用的强酸性阳离子交换树脂，以苯乙烯为单位，向上下左右延伸的网状结构是它的母体。母体上连结许多一SO3H，结构如下：

■ 常用种类――国产树脂中强酸1

7(上海树脂厂#732)、强酸性# 1(南开大学树

脂厂)和国外产品Dowex50、Amberlite IR－120、Zeo Karb225、Zerolit225、Wofatit K、Permutit Q、Lewatit Sl00。

■ 稳定性：这种树脂很稳定，经过几百次交换，交换当量也改变不大。对各种试剂也较稳定-，如较长时间浸在5%氢氧化钠、0.1%高锰酸钾、过氧化氢水溶液、0.1当量中也不会改变性能。不溶于水和一般有机溶剂，耐热性也比其他树脂好，必要时可以在沸水浴上100℃左右处理。

（2）酚磺酸型树脂：是在苯乙烯树脂出现以前就被广泛应用的强酸性树脂，可

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以用对羟基苯磺酸和甲醛缩合而成。其基本结构如下：

■ 常用种类――华东强酸阳42和国外产品Amberlite IR-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、Zeo Karb215、Wofatit K、Wofatit KS等。这种树脂一般为黑色，交换量比苯乙烯树脂小，遇碱或氧化剂时，性能易变化。在碱性溶液中酚性羟基也能进行交换，所以这种树脂在不同PH的溶液中离子交换的作用不同。因为有以上缺点，故应用范围较小。

2．强碱性阴离子交换树脂

树脂的母体和苯乙烯强酸性树脂相同。即在此母体上连结季铵，结构如下： ■ 常用种类――国产树脂中强碱性#201(南开大学树脂厂)、强碱性201

7(上海

树脂厂#717)和国外产品Nalcite SAR、Dowex1、Dowex2、Amberlite IRA-400、Amberlite IRA-410、Amberlite XE-98、PermutitSI、PermutitSII、Lewatit MII Zerolit FF等都属于这122种。这种强碱性树脂对酸、碱和有机溶剂亦较稳定，但在浓中不稳定。游离型(OH型)比盐型(如Cl型)的耐热性差，超过40~45℃就不稳定，因此一般商品都是C1型。

3．弱酸性阳离子交换树脂

含有—COOH的树脂，母体有芳香族和脂肪族两种。脂肪族类型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的较多，结构如下：

芳香族类型的用二羟基苯酸和甲醛聚合的较多。国产树脂中弱酸101×128(上海树脂厂#724)、弱酸性#101(南开大学树脂厂)和国外产品Amberlite IRC-50、WofatitC、Zerolit226都属于弱酸性阳离子交换树脂。

4．弱碱性阴离子交换树脂

含有一NH2，=NH，N等基团的阴离子交换树脂。国产树脂中弱碱330(上海树脂厂

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#

701)、弱碱311×2(上海树脂厂704)、华东弱碱阴321、弱碱性301(南开大学树脂厂)、

#

##

弱碱性330(同

上)，和国外产品Amberlite IR-4B、Wofatit M、Wofatit N、Le-watit M、Dowex3、Permutit W等都属于此种。其基本结构如下：

123含有N基团的碱性较强，含有>NH或-NH2的碱性较弱。这种树脂有黄、橙、黑等颜色。

强酸性及强碱性树脂的盐型较稳定，用水继续洗涤也不水解。把这类例脂的游离型改为盐型时，体积的变化较小。交换反应，无论是游离型或盐型都能迅速地进行。

弱酸性及弱碱性树脂的盐型用水继续洗涤时会逐渐水解。 即RCOONa + H2ORCOOH + NaOH

因此把弱酸性树脂的H型用氢氧化钠溶液变为Na型后，用水洗涤时，洗涤也不容易变为中性。另外，把游离型变为盐型时，体积显著增加。这是因为变为盐型后解离性增加，而所产生的离子又进行水合的关系。因此这种树脂交换时，游离型树脂不要装的太满。及所有柱的直径不宜过小，要留有余地。把盐型的弱酸性树脂变为游离型时。—COOH几乎不解离，因此，用稀酸就容易把它变成H型。 即

相反把盐型的强酸性树脂变为游离型时，事—SO3H会解离而产生逆反应。因此需要大量过剩的酸。

+RCOONa + H即

RCOOH + Na+

这个反应根据H+或Na+的浓度，向正方向或逆方向都可以进行。 强碱性和弱碱性阴离子交换树脂也有如上区别。 二、影响离子交换的有关因素

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1.溶液的酸碱度

离子交换剂可以简单地理解为一种高分子不溶性酸或碱，因此溶液的酸碱度对离子交换有很大的关系。当交换溶液中氢离子

124的浓度显著增高时，则因同离子效应，抑制了阳离子交换剂中的酸性基团的电离，故离子交换反应就很少进行，甚至不进行。通常强酸性交换剂交换液的pH应大于2，弱酸性交换剂的交换液pH应在6以上。同样在阴离子交换剂中，当溶液的pH值增大时，亦会发生同样的情况，故强碱性交换剂的交换液的PH应在12以下，弱碱性应在7以下。

2．对交换离子的选择性

离子交换剂对交换化合物来说，主要取决于化合物的解离离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大，酸碱性强者置换容易，但洗脱相对来说较难。解离离子价数愈高，电荷愈大，则它的吸附性愈强，愈易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元素还与它们的原子序数有关，前者原子序数大则交换吸附就强，稀土元素的原子序数小，其交换吸附强。

3．被交换物质在溶液中的浓度

欲交换分离的化合物，离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶剂中进行，这样有利于解离与交换。浓度低的溶液对离子交换剂的选择性大。在高浓度时解离度会趋向减少，有时会影响吸附次序及选择性；浓度过高时，亦会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。所以一般实验操作时，所用的溶液的浓度应该略稀，有利于提取分离。

4．温度的影响

对稀溶液温度的改变对交换的性能影响不大，但在0.1N以上浓度时，温度升高

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对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱酸、弱碱交换剂来说，其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。

5．溶剂的影响

通常在水中进行交换，亦可采用含水的极性溶剂。但在极性小的溶剂中难以进行交换或不进行交换，而且选择性也减少或 125消失。

此外对交换树脂本身来说，交联度大，结构中的网眼较小，大离子就不容易进入，反之交联度小，交联网孔直径大，则易于离子的扩散与交换，因此交联度的大小可以增加交换树脂对被交换物质的选择性。树脂颗粒的大小亦会影响交换速率，颗粒小，表面积大，有利于与溶液中的离子接触，增加交换速度。强酸和强碱性的交换树脂交换基团的解离能力强，则容易与溶液中的离子交换。

三、离子交换的基本操作

离子交换—般都在柱中进行。因为在柱中随流而下的样品相继与新树脂接触，所以不会产生逆交换。如果有两种以上的离子，可利用交换能力的差异把各成分分别洗脱。这就是离子交换层析。

层析柱的准备：把树脂放在烧杯中，加水亢分搅拌，将气泡全部赶掉。放置几分钟使大部分树脂沉降，倾去上面的泥状微粒。反复上述操作到上层液透明为止。粒度小的树脂，搅拌后要放置稍久，因为较难沉降。如果急于倒水、往往损失较大。

准备如图10-1的层析管，在底部放一些玻璃丝。玻璃丝一般含有少量水溶性碱，因此要用水煮沸后反复洗涤到洗涤液呈个性为止。用玻璃棒或玻璃管将其压平，厚约1～2厘米即可。上述准备好的树脂，加少量水搅拌后倒入保持垂直的层析管中，使树

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脂沉下，让水流出。如果把粒度大小范围较大的树脂和多量的水搅拌后分几次倒入，柱子上下部的树脂粒度往往会不一致。另外在离子交换中要注意不让气泡进入树脂层。如果有气泡进来，样品溶液和树脂的接触就不均匀。因此要注意把液面经常保持在树脂层在上面。如图10-1，接侧管是一种好办法。侧管末端要靠近液面。滴加时要注意不要把树脂冲散。放一块玻璃浮球或一层玻璃丝也盼可以避免冲散树脂。

样品量与树脂量的比例：每一种树脂都有一定的交换当量(1克干燥树脂理论上能交换样品的毫克当量数)，如国产弱碱330树 126

图10-1

脂的交换当量为9(毫克当量／克)，强碱201×4为3.5，强酸1×7为4.5等。强酸×7的4.5毫克当量／克，就是说这种树脂的1克能够交换丙氨酸.09×4.5毫克(注：丙氨酸的分子量为.09)。如果用阳离子交换树脂，样品可以加到全交换当量的1／2。用阴离子交换树脂，样品可以加到全交挽当量的1／4~l／3。

四、离子交换层析方法

根据实验的要求不同，可以选择不同规格的树脂，首先必须了解其性能如交换量的大小、颗粒大小、耐热性、酸碱度，然后进行预处理。普通的树脂，粒子都较大，大部分是35～20目(0.42～0.83毫米)。亦有50目，可作为植物成分的粗提及初步划分，但不适用于离子交换层析。离子交换层析一般需要较细的树脂，因此需要把它干燥，粉碎后，过筛或利用浮选法进行选择。 1271．干燥

加热干燥时要参考各种树脂的耐热性界限(请参考表10-1)。 不要超过临界温度。

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表10-1

一般盐型的树脂耐热性比游离型者强。另外，阳离子交换树脂比阴离子交换树脂耐热性强。

常用的干燥法有以下几种： (1)在定温烘箱内加热干燥。

(2)在红外灯光下干燥。把温度计插入树脂中，参考该树脂的耐热临界温度进行干燥。如果快要超过临界温度，就把树脂移远一些。

(3)在真空干燥器中，用五氧化二磷、氯化钙或浓硫酸等干燥剂进行脱水。 2．过筛

取少量干燥树脂在碾钵中(或球磨机)粉碎后放入标准筛中过筛。如果树脂过多，粉碎效果较差，另外粉碎时也容易飞散。不宜作一次粉碎到需要的粒度过筛，这样做往往会产生许多比所需要的粒度更细的泥状粉末，损失较多。应该适当粉碎后就过筛，把留下的粗粒再进行粉碎。这样反复操作，可以避免产生大量微细末， 128因而损失较少。筛子的规格，请参考附录。

浮选法：用图l0-2的装置可以浮选各种粒度的树脂。操作法如下： 图10-2

把粉碎后的树脂加入1～2公升的分液漏斗中(树脂量不要超过漏斗体积的五分之二)，从漏斗的下端通水。然后改变流速，而分别收集流出的树脂。流速慢时流出的树脂小，流速快时流出的树脂大。用Dowex 2时，流速与流出树脂的大小有如表10-2的关系。树脂不同，比重就不同。因此用其他树脂时流速与流出树

表10-2

脂的大小，关系不完全与表10-2相同。但是可以按照以上流速进行浮选，而用所分

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得的各部分树脂进行层析，看哪一部分树临较好。找到后就可以按这个流速选择适当粒度的树脂。 1293．层析的操作

装柱的方法与离子交换部分相同。进行层析时，有时要用100目以下的树脂，但流速太慢，因此需要加压。树脂越细或层析管越长，所加压力就须大一些，才能达到所需的流速。洗脱所用的洗脱液可以用均一的，亦可用提高阶段浓度的方法或浓度梯度洗脱法。

关于树脂量、层析管的粗细、展开溶剂量和流速的关系，可以参考表10-3。 表10-3

1. 酚黄酸型阳离子交换树脂 2. 苯乙烯强酸型树脂

130

3. 强碱性阴离子交换树脂

样品和构脂量的关系；要注意吸收带长度不超过层析拄长度的1／10 五、树脂的预处理及再生 1．预处理

预处理是使用一切离子交换树脂前必不可缺少的手续。一般的树脂都含有在合成时混入的可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质；因此，进行离子交换以前需作预处理，将杂质除去。首先把新树脂浸在蒸馏水中1～2天，使它膨润后，装在层析管中。如需要

处理的树脂量不多，可以用以下方法：

(1)强酸性阳离子交换树脂的预处理：，新树脂一般是Na型。先用树脂体积的

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20倍的2N盐酸以1毫升／厘米／分左右的速度进行交换，使它变为H型后用水洗到流出液呈中性。然后用树脂体积的10倍量的1N氢氧化钠(或食盐)进行交换，使它变为Na

型。再用水洗到流出液不含Na+为止(可观察焰色反应，如果含Na+灼热时有黄色火焰出现)。再重复一次盐酸→氢氧化钠(或食盐)处理。最后用树脂体积的10倍量的1 N盐酸进行交换，使它变为H型，然后用蒸馏水洗到流出液呈中性为止。

(2)强碱性阴离子交换树脂的预处理：新树脂一般呈Cl型

131先用树脂体积的20倍的1N氢氧化钠溶液使它变为OH型，用树脂体积的10倍量的水洗涤。然后用树脂体积的10倍量的1N盐酸溶液使它变为C1型。用蒸馏水洗到流出液近中性为止。再重复—次氢氧化钠→盐酸处理。最后用树脂体积的10倍量的1N氧氧化钠溶液进行交换，使它变为OH型。OH型树脂容易吸收空气中二氧化碳，因此保存时要注意，临用时把Cl型的树脂变 为OH型较好。

（3)弱酸性阳离子交换树脂的预处理：新树脂一般是Na型。先用树脂体积的10倍量的1 N扯酸溶液使它变为H型。用水洗到流出液呈中性为止。然后用树脂体积的10倍量的1N氢氧化钠溶液使它变为Na型，此时体积膨胀。用树脂体积的10倍量的水冼涤。流出液仍然呈弱碱性。再重复一次盐酸→氢氧化钠处理：最后用树脂体积的10倍量的1N盐酸浴液使它变为H型。用水洗到中性。

(4)弱碱性阴离子交换树脂的预处理：新树脂一般是C1型。预处理与强碱性阴离子交换树脂基本相同。变为C1型后用水洗涤时因为水解的关系不容易洗到中性。一般用树脂体积的10倍量水洗涤就可以。

除盐酸外有时也用硫酸，也可用氯化铵代替氯化钠。交换终点可以用以下方法来

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2

判定。请参考表10-4。 2．再生

用过的树脂，如还要交换同一种样品，把盐型变为游离型即可。如要交换其他样品，要用预处理的方法再生。不用时加水，保存在广口瓶中。

如需要预处理或需要再生的树脂量较多时，应用表10-4方法来判定交换是否完毕，这样可以节省试剂。

若遇耐热性离子交换树脂，则可在加温条件下处理，市售商品往往是湿的，若遇到干燥状态的树脂时，不要马上加水，这样易引起龟裂，影响物理性能，为了避免此现象，可亢加饱和氯化钠湿润后再加水，控前法处理或再生。 132 表10-4

六、离子交换法的应用

离子交换法在工业上用途很广。在中草药有效成分的分离方面，可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等的分离。由于离子交换树脂的应用，特别对水溶性成分的分离，比以前方便得多。

1．常用于有效部位的分离

民间使用中草药往往用煎剂，一般可用水煎剂通过强酸性(磺酸型)再通过强碱性(季铵型)树脂，分别洗脱，分成酸性、中性、碱性部位供动物或临床试验，如表10-5。

表10-5

1332．生物碱的分离

可用强酸性树脂从中草药水没液或稀酒精提取液或酒精提取部位的水溶部分直接交换生物碱，用氨水或氨性酒精洗脱，所得部位，再用其他分离手段分离。此法由于树脂可反复使用，特别对水溶性生物碱的提取分离，较经典方法有利。

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3．用于有机酸及酚性物质的提取分离能用离子交换层析法满意地分出多种有机酸。

4．氨基酸的提取分离

离子交换层析是分离氨基酸的有效方法(见氨基酸一章))一般利用不同pH的缓冲液梯度洗涤达到分离目的。目前氨基酸自动分析仪，主要也是利用离子交换层析法设计成的。

七、离子交换法操作实例

黄精属植物牛氮杂环丁二烯-2-羧酸的分离

黄精属(Polygonatum)植物的新鲜根36公斤，加水提取后，把提取液浓缩到1.5公升，再加水稀释到10公升后通过ZeoKarb 215(H型，60～80目，100×7厘米)，流速1公升／小时。用30公升水洗涤后，用12公升0.5N氨水洗脱。把含有氨基酸的洗脱液合并后浓缩到10公升，然后调节pH到5。将此溶液再通过Zeo Karb215(H型，60~80目，100×7厘米)，流速1公升\\小时。用15公升水洗涤后，用0.5N氨水洗脱，流速100毫升\\小时。在洗脱液中出现氨基酸后，开始收集，每管17毫升，共收集750管。第1~30管含有天门冬氮酸，第460~505管含有丝氨酸、苏氨酸，第506～534管含有高丝氨酸。第615～667管主要含有天门冬酰脓、γ-氨基丁酸。第668～750管主要含有赖氨酸、精氨酸。第31~459管主要含有氮杂环丁二烯-2-羧酸，另外含有少量天门冬氨酸、谷氨酸。把第31~459管合并，共有7.3公升。在50℃减压浓缩到250毫升。脱色后加10N氨水至pH7，再浓缩到100毫升。然后保持在一10℃，就析出结晶18.9克。把这个母液

134 浓缩后又得到40克结晶。上述58.9克粗结晶，加少量水溶解，加热到沸腾后加适当乙醇，放冷就析出氮杂环丁二烯-2-羧酸的纯结晶33克。

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135第十一章 薄层层析

薄层层析亦称薄板层析，是近廿年来发展起来的一种新型、快速、简单、高效的层析法，早在1938年首次应用，直至1956年，德国Stathl研究设计了一种涂布仪器，并商品化。同时Merck公司把薄层用的硅胶加入一定量的石膏制成规格化的商品，从此，薄层层析始被广泛使用。为了克服玻璃板使用不便的缺点，目前尚有将吸附剂涂在聚酯薄膜及铝箔上等。这样的成品，裁剪或携带更为方便。七十年代，又在薄层层析原有的基础上，发展为高效薄层层析，更具有快速、分离效能好、检出灵敏度高的特点，近年来专刊发表的文献中，屡见介绍采用高效薄层层析的方法。

薄层层析的操作方法是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的，因为层析是在薄层上进行，所以称它为薄层层析。薄层层析对天然产物的分筒、鉴定更有独到之处，结合目前中草药研究在全国范围内的广泛开展，如果要鉴定某一中草药中有无已知有效成分，可将该草药的提取物初步纯化，用已知样品对照作薄层层析，如有比移值和显色情况相同的斑点，证明该中草药可

能含有此有效成分。在分离中草药有效成分过程中，薄层层析法又是一良好的指路灯，从层析谱上斑点的变化，可以了解分离的效果。薄层层析还可用于指导选择柱层析的溶剂系统。一般能用于氧化铝薄层层析分离某些物质的溶剂系统，也可应用于氧化铝柱层析的分离，例如用硅胶、硅藻土、纤维素薄层层析的溶剂系统，同样适用于其柱层析。 其优点是：

(1)价廉，设备简单，操作容易。

(2)展开时间短，整个展开时间只需数十秒到数十分钟，即可

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136获得结果，而纸层析、柱层析展开慢，往往需数小时甚至达数日之久。

(3)薄层层析得到的斑点扩散较少，因而它的检出灵敏度比纸层析高10～100倍。 （4)分离情况受温度影响小。

(5)可以使用腐蚀性的显色剂，如喷浓硫酸及浓盐酸，甚至可将薄层加热至500℃，以观察碳化的斑点。

(6)薄层层析对样品的负荷量比纸层析大得多，故除可鉴定样品外，尚可供纯化分离样品之用。

(7)分辨率高，某些纸层析不能分离的混合物，可以改用薄层层析而获得良好结果。

因此薄层层析不仅已成为分离鉴定中草药有效成分的常用方法之一，而且在分析化学、药物分析、染料、农药、贵金属等的分离鉴定、定量等各个领域中，均得到广泛的应用。

薄层层析亦有不足之处，如它的比移值重现性较纸层析为差，展开大的薄层板时容易出现边缘现象，色谱图不易保存等。因此在鉴定物质时，通常将标准品与样品在同一板上同时展开以克服其比移值重现性较差的缺点。

用于薄层层析的薄层，分为软板和硬板两种，前者是将吸附剂直接铺于板上制成，后者是在吸附剂中加粘合剂或溶剂，调制后涂布于板上。

一、吸附剂的选择

用于柱层析的吸附剂，如氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺、纤维素、淀粉、蔗糖等；一般均可用于薄层层析，其中氧化铝、硅胶由于它们的吸附性能良好，适用于各类化合物的分离，应用最广，本文将重点叙述。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性的吸附剂，适用于碱性物质和中性物质的分离，

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特别是对于生物碱的分离应用最多；而硅胶是微带酸性的

137吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。近年来采用聚酰胺薄层成功地分离了鞣酸、酚类及黄酮体等物质，也有用纤维素分离氨基酸的。

总之，在考虑选择吸附剂时，一般根据化合物性质选用，也可以先采用氧化铝或硅胶，不适用时再试用别种吸附剂。近年来由于薄层层析在各个领域中的广泛应用，国内外均有各类吸附剂及供薄层层析用的预制板的商品出售，常见的有以下几种。

1．硅胶

硅胶G(Type60)，粘合剂为石膏(字母G为石膏Gypsum的缩写，Type 60是指硅胶的孔径60Å)。

硅胶H，不含石膏及其他有机粘合剂，但制成薄层后，亦有粘合力，即使用含水的展开剂亦不松开，与硅胶G相比，适用于分离对石膏有作用的化合物，调制的糊状物可以保。

硅胶HF254，同硅胶H一样，不含粘合剂，它含有一种无机荧光剂，在254nm波长紫外光下呈强烈荧光背景，适用于不易显色或用显色剂能引起化学变化的化合物。

硅胶HF254+366(Type60)，它除含无机荧光剂外，另含一种有机荧光剂，在366nm波长呈荧光，使用这种吸附剂，能使本身不发光的化合物(如类脂体、饱和甾体化合物)由于薄层的荧光而在紫外光下显像，但需注意的是此种荧光物质能被一些溶剂部分溶解。

硅胶60HR，是不含粘合剂的纯产品，适用于需要特别纯的薄层，如分离的物质需要定量测定或光谱研究用。

国产吸附剂及预制板，上述规格基本都有商品出售，都供制备硬板使用；软板用的硅胶颗粒大小以140~180日较为合适，太粗分离效果不好，太细则难以铺层。

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2．氧化铝

氧化铝G(Type 60／E)含石膏粘合剂，Type 60是指氧化铝颗粒的孔径为60Å。 碱性氧化铝H(Type 60／E)，其粘合力同氧化铝G相同，但不含粘台剂，符号E是制备氧化铝时方法不同，有二种型号：E和 T，E适宜于一般分离鉴定用。

碱性氧化铝HF254(Type 60／E)，其情况同硅胶HF254。

软板用的氧化铝颗粒亦应细于140目为宜。

二、薄层的制备

薄层的制备，就是将吸附剂均匀地铺在玻璃板、塑料膜或铝箔上成为薄层，所以使用的板必须麦面光滑，清洁（使用前先用肥皂水充分洗净，再用洗涤液浸泡，最后用水洗涤、烘干)，不然在铺层时有油污的部位会发生吸附剂涂不上去或薄层容易剥落的现象。玻璃板的大小可自4×20厘米的长方形到20×20或10×10厘米的正方形，各种规格都有，根据实验要求而选用。对于一般定性实验来说，在显微镜载玻片(7.5×2.5厘米)制成的硬板完全可以获得满意结果，尤其是高效薄层层析，展开距离有时只需2~3厘米，一块载玻片薄层就可分两头使用。一般薄层层析展开六厘米距离已完全可以达到预期目的。软板常用的吸附剂为氧化铝及硅胶。

1．软板的制备

最简单的制备薄层的方法是：选用一根直径约为1~1.2厘米的玻璃管或大试管，根据薄层的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布，胶布的厚度视所需薄层的厚度而异，常用的为0.4~1毫米，把干的吸附剂倒在玻璃板上，玻璃板的一端固定，防止玻璃管推时移动，然后按照图11—l所示，用玻璃管压在玻璃板上，把吸附剂顺一个方向推动，即成薄层。这样制成的薄层必须光滑、平整、厚度均匀，

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图11—l 138

才能获得良好的分离效果。如条件许可，最好用厚度0.4毫米的铜片，套在玻璃管外成环形，以螺丝帽固定距离(见图11—1)。这样一根玻璃管只需调节铜片的距离，可制得不同宽度的薄层。如遇到吸附剂颗粒过细，铺板有困难时，可改用磨砂玻璃板，这样可以铺颗粒200目以土的吸附剂。

2．硬板的制备

层析专著中载有各种各样的涂布器，是金属或塑料制成，适用于制备大板或定量用的薄

层，常用的有Stahl式涂布器，见图11-2。但在一般定性鉴定试验中，由于要求玻璃板的规格较多，大小长短不一，我们常采用手工方法铺板，也可得到满意结果。方法是将适量调制好的吸附剂倒在玻璃板上，用玻璃棒涂匀，轻敲玻璃板，使表面平坦光滑，然后放置于简易水平台上，空气干燥后进行活化。为了使每次涂布的薄层厚度相同，可以在规格相同的板上定量加吸附剂，以弥补手工制板的不足。也有用二块3毫米厚的玻璃板中间夹一块2毫米厚的玻璃板，把吸附剂向一个方向刮，即成一定厚度的薄层。 图11-2

(1)硅胶硬板：称取市售吸附剂硅胶G或硅胶GF25430克 (含煅石膏约13%)，加蒸馏水75~90毫升，在研钵或锥形瓶中调成均匀的糊状，如有气泡，可加l~2滴乙醇，此操作约需一分钟，从加水到吸附剂中至涂布结束，应在四分钟内完成，因时间太长将变凝固。室温干燥后置烘箱活化，活化条件根据需要各有不同，一般105℃加热30分钟后，置干燥器中保存，但需注意活化温度不要超过128℃，以免引起石膏脱水失

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去粘着能力。我们发现未经活化的硅胶板，往往分离效果也很好，但易受空气湿度影响是其缺点，，作分配层析时，硅胶中含的水分起着固定相的作用，因此不需加热活化，放在室温中12～14小时后即可使用。硅胶G也可以自

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行配制，称层折用硅胶粉（300目)0.85份，加煅石膏0.15份混匀，即得硅胶G。1克硅胶G吸附剂，可涂布载玻片5～7块。硅胶H和含荧光剂的硅胶H，加蒸馏水3～4倍，研磨约需二分钟，因无石膏，故涂布时间不，一般活化温度为120℃加热11小时。

（2）氧化铝硬板：称取氧化铝G 25克(含5%煅石膏)，加蒸馏水50毫升，在研钵中调成糊状铺层，其他操作同硅胶G，空气干燥后置200~220℃烘箱加热四小时，即得活性Ⅱ级的薄层；150～160℃加热四小时得Ⅲ～Ⅳ级的薄层。

此外，如聚酰胺、纤维素干推较难，常需加入溶剂，如5克聚酰胺加甲醇3份、氯仿2份或苯2份、甲醇3份的混合溶剂45毫升，混匀调成糊状铺板。另有纤维素1份与丙酮5~6份，混匀调成糊状而铺板。淀粉亦用作粘合剂，方法是称取硅胶28.5克与1.5克淀粉混匀，加水75毫升，在沸水浴上加热不断搅拌，直至均匀粘稠的糊，再辅成薄层，或用CMC(羧甲基纤维素钠)作粘合剂，于100毫升0.5%CMC中，加入硅胶粉30克(氧化铝取50克)，调制成糊状铺层。用淀粉作粘合剂的薄层较硅胶G硬，可以用铅笔在薄层上写字。

—般制成的硅胶板，只需将制板的条件固定，不需测活性，但也有按下法测定活性的：

取对-二甲氨基偶氮苯、靛酚蓝、苏丹红三种染料各10毫克，溶于1毫升氯仿中，将此混合液点于薄层上，用正己烷—醋酸乙酯(9：1)展开，若能将三种颜料分开，且

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其比移值为对-二甲氨基偶氮苯＞靛酚蓝＞苏丹红，则活性认为合格，约与Brockmann法标定的II级氧化铝的活性相当。

以上制备好或经处理而待用的薄层，应储于干燥器中，以免吸收湿气而降低活性。 有时，上述的薄层尚不能达到效果，又可在吸附剂中加入稀酸或稀碱，或加入缓冲液的，以期改变吸附性能而达到分离目的。有的物质找不到合适的显色剂，而在薄层上喷荧光物质(如0.04%荧光钠水液或0.5%桑色素甲醇溶液)，这样在紫外光下，于整个

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荧光的背景上被检物呈现暗色的斑点。可选用含荧光剂的吸附剂。

三、薄层层析操作方法

1．点样

将被检的样品用合适的溶剂溶解(尽量避免用水、甲醇，因斑点容易扩散，而且影响吸附剂的活性)，一般先配成5%的溶液，使用时再稀释到1～0.01%的浓度，最好采用与展开剂极性相近或挥发性高的溶剂，由于样品的溶剂选择不当直接影响分离效果时，此时可用下法克服，即将样品先用一种易溶的溶剂配成浓溶液，再选一种极性小的溶剂稀释以克服其不足；定性分析可用管口平整的毛细管(内径0.5毫米左右)吸取样品液，轻轻接触到距离薄层下端1～1.5厘米处，每次加样后，原点扩散直径不超过2～3毫米；定量分析时需用刻度精细的微量注射器点样，如果一次加样量不够，可在溶剂挥发以后，重复滴加，样品的量多少合适，有时需试验几次才能知道，因为所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度有关。样品量太少时，样品中含量少的成分不易检出，但是量太多会形成斑点过大互相交叉或拖尾：而不能达到很好的分离。

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一块薄层上如需点几个样品时，样品的间隔约为0.5～1厘米，而且需点在同一水平线上。

2．展开

点样后，让溶剂挥发，然后进行展开。

(1)展开剂的选择：展开溶剂主要使用低沸点的有机溶剂，一般市售的分析纯或化学纯试剂即可，不需另行精制，其选择的原则同纸层析、柱层析一样，主要根据样品的极性及溶解度，在薄层层析的专著中，展开剂的系统很多也是根据溶剂的极性、化合物的吸附性和它在溶剂中的分配系数来选择，也可参考前人的经验，但最重要的还是根据具体情况亲自实践。常用溶剂的极性次序是：

石油醚<环己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醉 141

Neher和Von Arx 体系的溶剂系统是常用的，其极性次序是：

苯—乙酸乙酯(50：50)<氯仿—乙醚(60：40)<环己烷—乙酸乙酯(20：80)<乙酸丁酯<氯仿—甲醇(95：5)<氯仿—丙酮(70：30)<苯—乙酸乙酯(30：70)<乙酸丁酯—甲醇(99：1)<苯—乙醚(10：90) <乙醚<乙醚—甲醇(99：1)<乙醚—二甲基甲酰胺(99：1)<乙酸乙酯<乙酸乙酯—甲醇(99：1) <苯—丙酮(50：50)<氯仿—甲醇(90：10)<二氧六环<丙酮<甲醇<二氧六环—水(90：10)

选择溶剂时，可采用微型圆心法进行预试验，即在薄层上点几个样品斑点，按极性大小选几种溶剂，分别加一定体积至斑点中心，让其展开；如用氯仿时，样品展开很快；而用环己烷时又完全不展开，这时可考虑换用一种极性在此两种中的溶剂如苯去展开，或适当调配这两种溶剂的比例，如环己烷—氯仿的比例以10：1，10：2试之，就可较快的选到一种合适展开剂。值得注意的是，有时溶剂中含少量杂质，如乙

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醚中含少量的水，或氯仿中含有1%乙醇等，可以大大改变对混合物的分离能力，所以在选择展开剂时一定要注意溶剂的规格，不然得不到重复的结果。在作碱性和酸性物质的薄层时，选择不到合适的中性展开剂，则可在展开剂中加入碱类(如二乙胺、氢氧化钠液、吡啶)或酸类(乙酸、甲酸)来展开，展开剂有用一种溶剂，多至三至四种溶剂混合使用的。

(2)展开：薄层层析展开和纸层析一样，须在密闭器皿中进行，根据玻璃板的大小选用不同的器皿，层析缸的式样很多，对于摸索选择展开剂时，宜采用市售的小层析缸(9×28×5厘米)，其他尚有圆形标本瓶、长方形缸等，如图11—3所示。薄层层析的展开方式，也可以有上行、下行、近水平、单向、双向或多次展开等。通常用上行法。但软板只能用近水平式的，即板与水平约成15°角，操作时将玻璃板点有样品的一端浸入展开剂的0.5厘米处(注意样品勿使浸入溶剂中)，在密闭的器皿中展开，根据吸附剂、展开剂的性质不同，展开的时间也各不同，有数分钟到几小时的，一般展

142 图11—3

开到3／4高度左右，即可取出，放置空气中自然干燥。硬板可用热风吹干或烘干。

当使用某种溶剂时，特别是混合溶剂，有时会出现边缘现象，即展开后，同一样品展开后的斑点不在同一水平线上，样品在薄层两边的比移值较中间的为高，边缘效应一般可在层析缸壁贴几张浸满展开剂的滤纸来克服，这种情况往往是由于薄层板大(如20×20，20×10厘米)，展开时间长，溶剂蒸汽挥发不同而造成。近年来，由于高效薄层及载玻片薄层的应用，展开时间大为缩短，边缘现象就不明显。采用上海玻璃仪器二厂生产的“连续薄层层析展开仪”，因饱和快，亦可消除边缘观象。

3．显色

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显色是鉴定物质的重要一环，一般用于纸层析的显色剂也可用于薄层层析，通常展开结束后，如有紫外线分析灯，可在紫外线下先观察有无荧光斑点，用小针在薄层上划出斑点的位置，再选择显色剂显色。软板与硬板的显色法不同，现分别叙述：

(1)软板的四种显色法：软板因不加粘合刑，如直接喷洒显色剂，往往将吸附剂吹散，而使整个试验失败，故现采用以下方法显色。

①喷雾法： 当薄层展开结束后，趁吸附剂上的溶剂尚未挥发呈潮湿状态时，立即喷洒显色剂。但是此法对低沸点的展开剂如乙醚、丙酮之类不能适用。

②碘蒸气法：薄层展开结束后，取出，使展开瓶全部挥发（必 143

要时可在红外线下烘干，因溶剂的存在，影响显色的灵敏度)，放入用碘蒸气饱和的密闭器皿中显色，许多物质能与碘生成棕色的斑点。

③压板法：薄层展开结束后，待展开剂尚未全部挥发，薄层上残留少许溶剂时，用另一同样大小清洁玻璃板，上涂均匀的显色剂，立即覆盖在薄层上，压紧，即可显色。这里须注意的是，残留的展开剂须适当，太干，吸附剂粘到另一玻璃板上，而破坏色谱；太潮，不能立即显色，或不能得到清晰的色谱。而涂的显色剂量太少时不能全部呈色；太多时，将吸附剂都糊化，这些都须实践多次才能

表11-1 144

获得满意结果。此法的局限性是显色剂的溶液需粘度较大，如浓硫酸、磷酸，才能在玻璃板上涂成一均匀薄层。例如用1%硫酸铈铵磷酸液作为长春花生物碱的显色剂(氧化铝软板)，l%香草醛硫酸液(70%V／V)作为中草药红孩儿中酚性化合物的显色剂(硅胶软板)，均获满意结果。

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④侧吮法：薄层展开结束后，待展开剂全部除去，再将薄层的一侧微微浸入显色液中，以与展开方向相垂直地进行侧吮显色，显色剂很快地扩及全部薄层，取出，加热干燥，即可显出清晰的斑点。但若被检物质能被显色剂展开，此法即不能采用。

(2)硬板的显色：将显色剂直接喷洒于硬板上，根据显色剂的不同，有立即显色的，也有加热一定温度后才显色的。

一些重要类型化合物的常用显色剂见表8—1。浓硫酸及碘蒸气适合于各类化合物显色，但不是专一性显色剂。如各种方法都不能显色，可以用荧光背景法或加热炭化法。

显色后的薄层谱，如需长期保存，载玻片可直接贴一透明胶纸，大的薄层用火棉胶等保护。

4．比移值(Rf)的测定

样品经显色后，用比移值来表示某一化合物于薄层谱上的位置，当然，展开剂不同其比移值亦不同，所以在叙述化合物的比移值时，一定需要注明所用的展开剂。

Rf值=

四、制备性薄层层析

上述薄层层析法可以初步检定是哪类化合物或几种化合物，但是最后确定需分离到纯品后再证实。有时还需经过一系列的化学工作才能确证。近代由于科学技术迅速发展，应用紫外、红外、核磁共振、质谱等方法，有时若干毫克的样品，就能确证为何种化合物。由于薄层层析的载样量比纸层析大，分离近百毫克样品并

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不困难。因此，对于微量的混合物或天然化合物的降解产物，可利用制备性薄层层析法分离。

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制备性的薄层层析与鉴定用的薄层层析的基本操作是相似的，其不同点： (1)样品液的浓度一般在5~10%。

(2)板的厚度一般增加到0.5～1毫米，制备性板的宽度、块数根据样品多少而定。 (3)一般分离样品量在10~50毫克，有时为了分离较大量的样品，可用许多块薄板分离，如国外有人用150块20×20厘米薄板分离了15克样品。

(4)样品的滴加，有的点成虚线，有的点成一直线，对比移值很接近的物质，分离结果不大满意，但若采用有浓缩区的薄层板，可提高分离效率。

(5)色带位置的确定，最好采用物理方法(如在紫外线分析灯下观察荧光)，如果必须采用化学方法显色时，可将薄板的大部分用另一玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的相应部分作出

图11-4 146 记号。

(6)样品的洗脱：如果是硬板(如图11—4A所示)，按色带刮下带有样品的吸附剂，分别洗脱。如果是软板(如图11—4B所示)，用一试管，将带有样品的吸附剂吸入小层析管中，然后用适当溶剂洗脱。

如最初证实国产长春花中也含有长春新碱，就是用制备的薄板层析分得的。采用氧化铝软板，条件与应用实例中所列举的相同，在紫外线分析灯下观察色带位置，以已知样品对照，照图11—4B所示，吸取长春新碱相应部位，用氯仿洗脱，制成硫酸盐，与国外样品同时做红外光谱，吸收峰完全一致，证实为同一物。

五、薄层层析操作实例

1．氧化铝软板的应用

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(1)国产乌头中生物碱的板层鉴定：用氧化铝软板分离鉴定了七种已知结构的乌头生物碱，即乌头碱(Aconitine)、新乌头碱(Mesaconitine)、次乌头碱(Hypaconitine)、牛扁明碱(Delsemine)、甲基原牛扁碱(Methyllycaconitine)、牛扁灵碱(Delsoline)及翠雀灵碱(Delpheline)。其中前三者为双酯类，次二者为单酯类，其他是胺醇。氧化铝采用上海试剂厂化学纯，pH 9．4，活性Ⅱ级，细度为150—200目，以石油醚—乙醚(1：10)或环己烷—乙酸乙酯(l：1)或乙醚为展开剂，用碘蒸气显色，均能获得较好结果(见图11—5)。采用此条件，还检查了川乌、附子、北乌头、南

图11—5 147

京草乌及劳氏乌头中的生物碱，发现其中分别含有乌头碱、新乌头碱及次乌头碱等，而其含量比例也可从显色的斑点大小、深浅作粗略的估计，以上的五种乌头中所检出的生物碱，均已由提取、分出并获得纯品证实。 ·

(2)生药中掺杂马钱子的检查：一种草药在临床前作药理试验，发现毒性很大，而原草药民间作食用时却没有很大毒性，经调查可能因混入少量极毒生物碱士的宁(Strychnine)及马钱子碱(Brucine)，后将该草药的提取物碱化，氯仿抽提，氯仿液浓缩，用氧化铝软板检查，活性Ⅱ级，150一200目，以乙酸乙酯—苯(2：1)为展开剂，用标准马钱子碱与士的宁作对照，进行展开，以碘蒸气显色，在马钱子碱与士的宁的相应位置上，出现比移值相同的斑点，很快确定了此草药的毒性是由于不慎混入生物碱所致。

(3)长春花抗癌生物碱的板层鉴定：国内在应用柱层析分离长春花中三种抗癌生物碱长春碱(Vinblastine)、异长春碱(Leurosidine)、长春新碱(Vincristine)时，曾试图采用纸层析法检查此三种生物碱，选择了几十种展开剂，均未获得满意结果，后

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用薄层层析法，成功地分离了三种生物碱，方法为：氧化铝软板，活性Ⅳ~V级，150~200目，展开剂为氯仿—乙醚—石油醚(10：10：1)，以1%硫酸铈铵磷酸液为显色剂(压板法)可获得清晰的三个斑点，异长春碱在前，长春碱次之，长春新碱比移值最小，依次呈现淡红、红、蓝灰色的不同斑点，根据斑点的出现次序及颜色的变化而得知分离。

2。硅胶板的应用

(1)甾体化合物的分离鉴定：

国内曾应用硅胶软板，对20种甾体化合物进行了分离鉴定，用180~250目的硅胶粉，活性I~Ⅱ级，以醋酸乙酯—苯(3：7)为展开剂，采用3%磷钼酸水溶液侧吮显色，16种

甾体化合物斑点分布位置如图11—6。

图11—6 148

其比移值及显色情况见表11—2。

表11—2

(3)土槿皮酸的硅胶板层检查：国内曾采用硅胶硬板(105℃活化30分钟)，自土槿皮Pseudolarix kaempferi Gorden中分离提出的总酸，以乙醚—石油醚(4：1)作展开剂，以浓硫酸喷雾显色可得比移值不同的六个斑点，其比移值与显色情况如表11-3。

过去分离土槿皮中有机酸时，曾分得一针状结晶，熔点敏锐(141～142℃)，曾误认为一单体，后经采用薄层层析法检查，才得知为三种酸的混合物，并根据此线索，用硅胶柱层析成功地分离出各种单体。

149 表11-3

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六、薄层层析领域中的若干新进展

随着薄层层析在各个领域中的广泛使用，人们对薄层层析的分离效能要求亦不断提高，根据薄层制备方法和分离效能，又有下列新进展：

1．烧结薄层层析

由于一般薄层板抗磨性能差，吸附剂容易剥落，不易携带，更不便于野外操作，而且一块薄层板只能使用一次。七十年代初，国外曾采用玻璃粉与硅胶、氧化铝、硅藻土等吸附剂按不同比例混合制成烧结板，目前已有商品出售，我国上海玻璃仪器二厂亦试制成功了一种硅胶烧结板，有各种规格供使用。

制备方法是将吸附剂硅胶H和颗粒度为200~300目的玻璃粉，按一定配比(1：2～1：4)倒入研钵中，加入适量蒸馏水和硫酸镁溶液研磨呈糊状匀浆，立即倒入涂布器，在玻璃板上铺成0.25毫米厚度均匀的薄层，干燥后放在乎整的不锈钢板上500~600℃保温15分钟即成，这样制成的薄层，供定性定量用，使用后可用清洁液洗涤，活化后可反复使用。

2. 高效薄层层析

高效薄层层析是在薄层层析原有的基础上采用颗粒度更小(5—7μ)及粒度分布范围更窄的吸附剂，结合特殊粘合剂发展起来的，它的特点是点样量少，展开时间短，斑点集中，分辨力高，检出限度低，达微微克(pg)水平，可直接供定量测定应用。在常规薄层层析中板高30μm，在高效薄层中可减少至12μm，如果展

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开距离为3～7厘米的话，它的理论板数可达数千，因此分离效能大大提高，表现在展开距离及时间大为缩短，一般薄层展开时间30～200分钟，移行距离10~15厘米左右，而高效薄层展开时间只需3～20分，移行距离3~7厘米，即可获得满意结果。目

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前高效薄层的展开方式有圆心层析和线性层析两种，：国外有专门仪器配套使用，因为是鉴定毫微克量，需要微量点样器，而Hamilton注射器可适应这一要求，高效薄层层析的用途，除了定性定量外， 可作高效液相色谱选择展开剂预试验用。

3．有浓缩区的薄层层析

近两年来，在层析的领域里又有了新发展，就是试制成功了一种有浓缩带的薄层预制板，西德Merck公司已有商品出售，这种预制板是采用特殊的铺板技术，由两种不同的硅胶层组成，两层间有一明显的界线，但彼此间仍然相通，所以样品展开通过界线时没有阻力。薄层的一端是无活性的大孔二氧化硅浓缩区(孔径为50，000Å)，它宽约2.5厘米，厚度约0.15毫米，而邻接另一活性层析层(硅胶Type60)的厚度一般为0.25毫米，样品在实际层析开始前，在浓缩区前沿形成非常狭窄的线形，其长度就是原来斑点的直径，所以点样时不需特别注意点样的斑点大小，位置上下，只要加样在浓缩区，它就随着溶剂移动到有活性的层析层后，才开始分离。如图11—7→11—9为有浓缩区薄层板，与图11—10比较，可以看出有浓缩区的薄层较一般薄层分离效能佳，尤其是点样量多时，

图11—7 图11—8 151 图11—9 图11—10

其优点更为突出。它的特点是①在加样时不需特别注意所点斑点的形状及大小，因之点样时节省了大量的时间。②在点样区域可避免敏感的物质在活性硅胶上干燥时的分

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解和不可逆吸附，这些物质仅仅在通过浓缩区以后才接触真正的吸附剂，这时它们处于溶解状态。③样品在浓缩区除浓缩作用外，在浓缩区移行时直接进行了一次“纯化”，它可以代替要层析的活性物质的提取，特别适合于生化、临床化学和药物的质量控制。④样品都是在起点线才开始

真正层析，所以避免了由于加样时不在水平线上所引起的误差，这对点样量较大，溶液非常稀时尤其显著，明显改善了分离效率。 4．双波长薄层层析扫描定量法

由于仪器的进步，各种精密度高的层析法如柱层析、纸层析、薄层层析、气相层析、高效液相层析等，被应用于天然产物的研究中，采用薄层层析进行定量主要有两种方式，一种是将测定的化合物自薄层上洗脱后，再选择适当的方法测定。另一种方式是层析后直接在薄层上进行测定，其中有目测法、测面积法、仪器测量法(如用光密度计)等。这两种测定方式，国内外已有专著详述，下面简单介绍一下双波长薄层层析扫描仪定量法。

采用光密度计直接测定薄层上的斑点所作出的定量曲线有时会不够线性，其原因有①薄层本身引起的误差，如薄层厚度不均匀，会使空白值不稳定，所以供定量应用的薄层，一般要求高，用机

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械涂布较好。②测定仅沿着一个方向直线进行，而斑点有时不圆会产生误差。③有时薄层谱上斑点面积与化合物量不一定成正比。而双波长薄层层析扫描仪(如岛津CS910)解决了上述缺点，提高了测定准确度。特别适用于生药中多成分的含量测定。它的特点是采用两种不同光源的波长(紫外区光源用重氢灯，可见光区光源用钨灯)，用一种波长(λs)测定样品，用另一种波长(λR)扫描样品邻近的薄层，作为空白值，即观察

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两种波长的强度差，这样可

表11-4 153

以消除薄层空白值所引起的误差。测定时一面对薄层上斑点沿X方向进行锯齿形扫描，同时也沿Y方向极缓慢地扫描，所以能够测定斑点的全部面积。有时两个化合物比移值相同，而最大吸收不同，则可以通过改变扫描波长来发现而直接定量。对化合物本身没有紫外吸收的，可选用合适的显色剂使之显色，再进行同样测定。

如葛根是葛根汤等中药方中有名的主药，含葛根素、大豆素、大豆甙等异黄酮体。采用Merck公司的硅胶HF254预制板，用氯仿—甲醇—水(65：35：10，下层)展开，在波长λs280nm、λR 400nm处测定不同产地的葛根中各种异黄酮体的含量，结果如表11—4。

从表11—4中知葛根素为葛根中的主要成分，因产地不同，各种成分的含量亦不相同，日本产的葛根和朝鲜产的很类似，但与中国、泰国产的葛根明显不同。因之采用双波长薄层层析扫描仪，可以很快鉴别生药的真伪和质量的优劣。

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第十二章 纸 层 析

纸层析是以滤纸作为支持剂，用一定的溶剂系统展开而达到分离分析目的的层析方法。此法可用于定性、定量，也可用于分离制备(微量方法)，而在中草药化学工作中则主要作为定性分析手段。

纸层析法的一般操作：将待试样品溶于适当溶剂，点样于滤纸一端，另用适当挑选的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开。展开完毕，滤纸取出阴干，以适当的显色剂显色，即得如图12—1的纸层析谱。样品经层析后往往用比移值Rf

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来表示其一化合物于纸层析谱中的位置。

Rf= 图12—1 155

因此纸层析可以看作是溶质(试样)在固定相与流动相之间的连续抽提，依靠溶质在两相间的分配系数不同而达到分离的目的。一定的物质在两相之间有固定的分配系数，因此在纸层析谱上也有固定的比移值，借此可以达到分析鉴定的目的。

由于滤纸纤维常能吸收20~25%的水分，而且其中6～7%的水是以氧键形式与纤维素上的羟基结合；在一般条件下较难脱去。所以一般的纸层析实际上是以水作为固定相，挑选的展开溶剂作为流动相；以达到分配层析的目的。在特殊情况下，主要是分离芳香油等非极性物质，往往采用以石蜡油、硅油(Silicone)等作为固定相，以水溶液(或有机溶剂)作为流动相，这方法称反相纸上分配层析。

一、滤纸的选择与处理

目前国外资料记载所用的滤纸种类较多，有关专著均有记载。一般常以华德门(Whatman)滤纸作为标准。国产层析滤纸为杭州新华造纸厂出品，规格见表12—1。

表12—1

一般国产或进口层析滤纸都能适用，而对特殊需要则须另加处理，挑选滤纸纤维松紧适宜，厚薄得当，一般中速滤纸使用较多。

156

另外滤纸的选择也可结合展开溶剂来考虑。以丁醇为主的溶剂系统粘度较大，展开速度慢；相反，石油醚、氯仿等为主的溶剂则展开速度较快。可据此结合实验要求来挑选快速、中速、慢速的滤纸。一般定性用较薄的滤纸；厚质滤纸往往作制备用。

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由于植物中存在的酸碱性物质大部分都是弱酸弱碱，因此在分离酸(酚)性、碱性或两性物质时，展开溶剂和样品的酸碱度对层析结果影响很大，主要是样品的游离形式和成盐的形式在水和有机溶剂中分配比相差极大，因此PH必须恒定才能得出满意的层析结果。恒定pH的办法，一种是展开溶剂中采用一定比例的酸或碱，另一种是将滤纸经恒定pH的缓冲液处理，在中性溶剂中展开，缓冲溶液可采用柠檬酸—磷酸氢二钠系统，配制方法见附录。一般可将层析滤纸于缓冲液中浸湿(或者均匀喷洒)，再用普通滤纸吸去表面的多余水液，经阴干即可使用。有时也可用甲酰胺、二甲基甲酰胺等试剂预处理。其作用与缓冲液相似。在特殊的要求下，滤纸上可分段以不同pH的缓冲液处理，即采用梯度pH纸层析。

二、展开溶剂的选择

要得到一个满意的纸层析结果，往往与展开溶剂的选择关系极大。但实际上不可能有一种万用溶剂系统能适用于一切化合物，对于各种类型的化合物必须选择其独有的溶剂系统。一般首先可参考前人对于此类型化合物所用的展开溶剂，另外是通过自已的实践摸索，找出满意的溶剂系统。一个理想的溶剂系统必须具备下述条件：

(1)被分离的物质在该溶剂系统中比移值在0.05~0.85之间，而分离两个以上的混合物，相互间比移值最好大于0.05，以免斑点重叠；检定单纯化合物则比移值最好在0.4～0.6之间。

(2)溶剂系统中的每一组成与分离物质之间不起化学反应。 (3)纸层析谱所得斑点圆整，并且圆整程度不因点样多少而 157 有差异。

(4)分离物质在溶剂系统中的分配比恒定，最好不随温度变化而变化，而且容易迅

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速达到平衡，这样易得圆整的斑点，并且可不需保持恒温的实验条件。

(5)溶剂系统中尽可能少用高沸点溶剂，便于纸层析谱干燥。 (6)多元系统溶剂中，组成恒定，尽可能少因温度变化而变化。

三、操作步骤

纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行、径向三种，而一般在中草药工作中所应用的以上行较为普遍。上行法中又可分为单向、双向。对一般成分较为简单的样品单向展开即能达到目的。成分较为复杂的样品，由于其中某些斑点重叠，必须用双向，即先以一种溶剂系统展开后，再以另一溶剂系统于其垂直方向作第二次展开，即得双向层析谱，如图12—2，有时用双向层析可分离识别四十几个斑点。

1．点样

取层析滤纸一张，长20～30厘米(长短可根据分离目的和仪器设备情况而选用，甚至用10厘米正方形的滤纸，也能成功地进行双向层析)，纸的宽度则根据所点样品的个数而定。 试样溶于适当溶剂中，用玻璃毛细管吸取试液点于

图12—2 158

距纸底边约2厘米处的起点线上，每点间距2厘米左右，点的大小直径一般不超过0.5厘米。如采用较短的滤纸则原点应更小，点样所用毛细管可由实验室自己拉制，内径约0.5毫米，用过一次即弃去。点的形状可为圆形，也可点成3～5毫米横的长条。由于样品在展开过程中，斑点常是向展开的方向拉长，因此横长条形的原点有时更易得到斑点圆整的结果。

点样时对有些难溶的样品，由于配制溶液过稀，点样时可反复点上数次，并用红外线灯或电吹风加速干燥。由于溶液过稀，点样时溶剂扩散而起展开作用，容易点成

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空心圈。空心圈原点展开后，易出现畸形斑点。

点样不宜太集中，即点样量大的原斑点也宜大一些。由于样品在滤纸纤维上分配，总是先溶解再分配，如点样太集中，使溶解过程拉长，最后使斑点拉长，而且Rf偏低。

对要求较高的实验，如与标准样品对照，二者点样量最好大致相等。 2．纸层析用具

一般纸层析器具，如样品只有一两个，则可采用滤纸条，长25厘米，用纸层析管进行。如样品较多，则可将滤纸卷成筒状，层析缸可用市售圆缸，或将普通标本瓶顶端磨平，配以磨沙玻璃作盖。

图12—3 159 160

一般装置最好有悬钩，以备滤纸饱和溶剂蒸气用(如图12—2)。对一般比移值较小的样品，由于展开距离较小，对不同成分分离效果较差，可用下行法，使溶剂连续展开，斑点移动距离增大，不同成分能满意地分开。下行法所用仪器大体与上行法相似(如图12-4) 图12-4

顶装分液漏斗，备作添加溶剂用(溶剂槽如能装足够的溶剂，则可省略)。如用滤纸条展开，层析槽可用普通表面皿，如滤纸较阔，层析槽可用长方形槽、玻璃船或普通氏方形墨水缸等，滤纸下端剪成锯齿状，以备溶剂下滴。 3．展开及显色

上行层析缸或层析管放平(不宜倾斜)，底部放入事先挑选的展开溶剂，放置片刻使缸内空气为混合溶剂蒸气饱和，即将层析滤纸放入（一般展开溶剂水平面应在点样基

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线以下至少1厘米)，溶剂即由毛细作用于滤纸上上升，样品也随溶剂展开。有些溶剂系统层析滤纸不宜直接插入，须于溶剂蒸气中放置一定时间，使滤纸纤维为溶剂蒸气饱和，再插入展开。

纸层析展开完毕后，取出，于溶剂到达的前沿划线作记号，滤纸可室温阴干，干燥的纸谱一般先在紫外线分析灯下检查有无荧光斑点，并记录其颜色、位置及强度，然后喷洒显色剂。采用的显

161色剂种类根据所需检查成分而定(参看附录)。

径向纸层析是最早发展的纸层析，它的主要特点是由于平面展开，展开速度较快，仪器简单方便，由于展开过程中溶剂前沿不断扩大，分离效果良好，所得斑点较狭，成清晰的层次。最简单的方法可将滤纸剪成圆形，中间裁剪折开，如图12-5，展开时可用培 图12-5

养皿进行，上覆一培养皿作盖，但由于两块培养皿间密闭程度极差，因此放在干燥器中进行更佳。又如图12-5用两块不同直径的表面皿进行，并适用于须事先使滤纸饱和的溶剂系统，饱和过程可按图把表面皿一端搁起，展开时放平即可。 此外，尚有离子交换纸层析，即将层析滤纸经化学处理在纤维 素上制成交换基团，如：

162进行纸层析，但制作麻烦，这里不作介绍。

四、纸层析的应用

纸层析和薄层层析在中草药提取分离工作中主，要作为侦察手段，主要应用于： (1)中草药化学成分的预试验。检查中草药的主要成分，或检查某种植物中是否含有某种有效成分，这对药物资源的找事用处极大，方法方便且较准确，原料用量也

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很少。

(2)检查某一有效部位的主要成分及成分的复杂程度，作为衡量所选用的分离方法是否恰当的考查手段。

（3)检查分离得到的结晶是否单体并检查其纯度，并通过与标准样品的对照比较，鉴定是否为某一已知成分。

(4)微量样品的分离制备，但由于制备量较小，中草药分离工作中一般较少采用。 (5)指导分离工作，一般在纸层谱上比移值差别较大的，基本上能在相同的溶剂系统条件下用纤维粉分配层析达到分离的目的。

薄层层析与纸层析的应用各有其优缺点，近年来在中草药的成分分离工作中薄层层析的应用较纸层为广，但对某些极性较大的化合物，诸如氨基酸、单糖等，纸层析仍有其独特的分离效果，另外并可用微晶纤维粉薄层层析，由于微晶纤维粉具有与纸层完全相同的分离性能，因而能适用于纸层分离的各类型化合物。 五、纸层析操作实例

1．石蒜生物碱的纸层析(上行法)(图12-6) 材 料：新华滤纸

点样间距：2厘米 起点线与底距：4厘米 样 品：10毫克／毫升浓度每点用毛细管点样三滴 163 图12-6 表12-2

1点直径：1．5～2毫米

展开时间：6小 时温 度：℃

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展开溶剂：丁醇-醋酸-水（4：1：2或9：1：2) 显色剂：1．紫外线分析灯下观察荧光

2．改良的碘化铋钾试剂

层析结果见表12-2。

2．根据纸层析条件设计逆流分溶 参见本篇第七章硅胶层析 六、常用溶剂系统及显色剂

纸层析展开溶剂系统的选择，主要根据层析样品类型及极性决定，表12-3列出一些常用的溶剂系统，读者可根据具体工作灵活掌握，所列混合溶剂有些不成一相，如正丁醇-醋酸-水(4：1：5)，均应于分液漏斗内剧烈振摇充分互溶，分出有机溶剂相作展开溶调剂。混合溶剂中由于各组份挥发性不一样，因此要求较严格的实验，混合溶剂倒入层析缸内后只作一次层析试验，实际工作中常不很严格，但必须注意第二次层析与第一次层析比移值往往会有一些改变。

表中所列溶剂可根据实际条件选用，象己烷、庚烷如手头没有，可改用性质相近的如60~90℃石油醚试验，异戊醇可用正戊醇或正丁醇代替。混合溶剂用量比例也可根据实际情况调节。一般如比移值偏高可增加非极性溶剂比例使比移值降低，如比移值偏低，可增加极性溶剂比例，以使比移值增高。如果层析结果成一长条，则必须改换整个溶剂系统。

表中所列显色剂，一般只列通用的，这些通用的试剂对有些化合物灵敏度并不是很高，可根据具体化合物选择特殊的显色剂，参看附录： 165 表12-3

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166 167

168第十三章 电泳技术

电泳技术较前述几种层析技术发展略迟。1937年考奈格(Konig)用滤纸进行了第一次纸电泳。由于电泳具有快速、准确、易重复的特点，并可用洗脱法和光密度法求出各组份的含量，因此近年来已发展为层析的基本技术之一，广泛应用于生物化学、药物化学，以及临床诊断方面。在植物成分分析中，电泳技术也成熟地用于生物碱、有机酸、氨基酸、蛋白质、糖类的分离和鉴定工作。

一、 电泳的原理

带电质点在电场作用下产生定向运动，由于混合物中各组份所带电荷性质、电荷数量

以及分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组份泳动的方向和速度不同，因此在一定的时间内各自移动距离不同，而可以达到分离鉴定的目的。 二、影响电泳速度的因素

(1)分子所带的电荷：一般说分子在溶液中呈离子状态则电泳速度快，但分子中暴露在表面上的极性基团也受电场的作用，对电泳速度也有很大的影响。

(2)电场强度(电位降／厘米)：对电泳起着决定性作用，电场强度越高则带电质点移动越快。

(3)溶液离子强度：电泳的介质缓冲液离子强度越高，则质点移动越慢。 (4)电渗：在电场中，液体对于一个支持固体相对移动称为电渗。电泳所用的支持物并非电中性，即具有一些极性基团而带

169电荷，在此固定物丧面的液体则产生相反的电荷。当进行电泳时，产生电荷的液

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体按其电场决定的方向也要移动，因此，电泳后各成份的相对位置取决于电泳泳动力与电渗流相互作用的结果。

此外，缓冲液粘度、温度对电泳速度都有一定的影响。电泳速度以厘米／秒／伏特表示，称离子迁移率。

电泳可分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳三种，其中区带电泳操作简便，容易推广，因此常用于分离鉴定。

区带电泳又称区域电泳，即电泳在不同的惰性支持物中进行，使各组份分成带状区间。区带电泳按所用支持物的性状不同，或支持物的形式不同，又可分为许多类。现就常用的两种电泳方法简单介绍如下： 三、纸 电 泳

以纸作为带电质点溶液的支持物来进行电泳，称为纸电泳。在化学成分分离鉴定中，纸电泳常常与其他层析方法配合使用以达到预期的效果。在植物化学成分中，除生物碱、有机酸、蛋白质等本身带有一定的电荷可以进行电泳以外，对于本身没有电荷的分子，如糖类、三萜类，可利用生成衍生物的方法使分子带有电荷，再用纸电泳进行分离(见表13-1)。在植物成分分离工作中，了解成分的电负性，对于选择分离手段很有帮助。如氨基酸，通过纸电泳可了解是酸性、碱性还是中性氨基酸，然后再采用相应的手段进行提取、分离。有些成分可以根据它们纸电泳的结果，判断可否用离子交换树脂进行分离。并可作为选择树脂的参考(见图13-1)方法如下：

备试样品在电压、电流、时间相同的情况下进行酸性及碱性缓冲液的电泳试验，由两次电泳结果分析判断。如两次电泳在两个并联的电泳槽内进行更好。 操作方法及注意事项： 170

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2

表13-1 171

1.装置（图13-2）

调压稳压整流器一台：0~800伏特；0~50毫安培。 172 图13-2

电极：0.5毫米直径铂金丝；或用炭棒、不锈钢丝。 缓冲液槽：可用有机玻璃胶合制成，也可用玻璃槽。 2．缓冲液的选择

使用缓冲液目的，在于控制电泳过程中电泳速度的恒定。缓冲液最适合的离子强度在0.02~0.2之间。如果离子强度高，通过滤纸的电流大，发热量高，使滤纸上的溶液蒸发快，甚至可使滤纸烧焦，电泳中断。选用挥发性的缓冲液比较好，因为电泳后滤纸烘干时容易除去，减少对显色的影响。常用的低离子强度缓冲液见表13-2。

3．点样

样品原点应在滤纸，点样形状，有圆点、带状两种，如果在同一张滤纸上要点数个样品时，最好每两个样品中间的滤纸用刀片划一段细缝，以免电泳时样品扩散，互相干扰。点样完毕，把滤纸条两端浸入缓冲液湿至距样品4—5厘米处，立即取出，用手以水平方向拉直，使缓冲液向中间样品处扩散，直到两侧缓冲液都接触到样品，使样品湿润后，将此滤纸条夹在干滤纸中轻压，吸去多余的缓冲液，放在支架上进行电泳。 ；

4．电泳

点好样品的滤纸条，放在支架上，滤纸条两端下垂浸入槽中的缓冲液里。然后通

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电流：在接通电极与电源数分钟后，再打开稳压整流器的电压粗调节，每升高一格要停1~2分钟，然后再用细调节调至所需电压，数分钟后即可稳定。如果只有电压而无电流通过，可能是电极或滤纸条与缓冲液接触不良。如果电压、电流均无，说明电流没有接通。在电泳过程中由于滤纸上缓冲液含量可能有变化，导致电流也有微小变化，这对电泳影响不大，但如发现电流突然降低，则必须停止，检查原因，否则滤纸将被烧断。

一般使用的电场强度为10伏特／厘米，电泳2小时。和其他层析方法一样，对各种不同样品需要通过实践，以探索出适合的 173 表13-2 条件。

5．显色

电泳完毕，滤纸烘干或吹干，即可显色，所用显色剂与纸层析相同。对于成分不明、不能确定适当的显色剂时，可用碘蒸气显色，了解区带的位置和组份的情况。 174碘蒸气显色方法如下：

电泳纸条用硫酸铝溶液喷湿[20克Al(SO4)3.18H2O溶于 表13-3

175100毫升水中]，置空气中晾干后，挂在碘蒸气缸中过夜，取出在空气中挂4山5小时，令滤纸底板上吸附的碘挥发掉(可先用淀粉试剂在纸条边上试一下碘是否挥发净)。然后喷0.5%淀粉溶液，电泳区带显蓝色。

纸电泳用于制备样品时，所用滤纸要厚，样品点成一长条，电泳完毕，只需剪下边上一小条显色，确定区带位置，剪下相应部位，用溶液冼脱。

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6．纸电泳的异常现象和处理方法 见表13—3所示。 四、琼脂乎板电泳

琼脂电泳是凝胶电泳的一种，具有下列优点：

(1)琼脂含液体量达95%，样品以琼脂板作为电泳的支持物进行电泳近似于自由电泳。琼脂对蛋白质吸附极微，因此琼脂电泳是蛋白质分离鉴定的主要方法之一。 (2)琼脂作为支持体有均匀、区带整齐、分辨力高、重复性好的优点。

(3)电泳速度快。 (4)区带易染色。 、 (5)样品容易洗脱，利于制备。

(6)透明而不吸收紫外线，可以直接利用紫外线作定量。 (7)千膜可以长期保存。

电泳时由于琼脂并非中性物质，它有一些带负电荷的极性基团，但琼脂是固定相不能移动，只有液相部分向阴极方向移动而产生“电渗流”。简单的琼脂电泳装置见图13-3。

操作方法及注意事项： 1．—破璃片的处理

琼脂电泳所用玻璃片(鉴定可用显微镜载片)在用前必须用清洁液浸泡过，以免玻璃表面有油状沾污而使琼脂不易涂布。有油状

176沾污的玻璃片要用氢氧化钠—硼砂溶液浸泡10分钟(硼砂50克，氢氧化钠100克，加水1，000毫升)，取出洗净晾干后立即使用，否则玻璃表面又会有沾污可能。

2．琼脂的处理

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市售琼脂需除去杂质，如灰尘、盐类、低分子化合物及含氮化合物，处理方法如下：

琼脂剪成小段，用蒸馏水浸洗2天，倾去水，加入沸水，使最后浓度为3%左右，然后继续在水浴中加热使溶（煮的时间尽量短)。待全部溶解后，乘热离心除去杂质及颗粒状物，再溶解后倒入搪瓷盘中，使其厚度为3～5毫米，切成小方块，移入大烧杯中再用蒸馏水浸洗3天，每天换二次水。洗好的琼脂块放入带盖玻璃瓶中，加水浸泡并加少量抗菌剂(如0.01%柳硫汞)，放入冰箱保存使用。

3．缓冲液的配制

琼脂电泳常用缓冲液的pH多在6~9之间，离子强度为0.02~0.05。如果离子强度过高时将有大量电流通过琼脂板，产生热量使板中水分大量蒸发析出盐的结晶，甚至使板上的琼脂断裂，电泳中断。

常用缓冲跟有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。一般选用硼酸盐缓冲液，因为不易长菌，价格便宜，制成的缓冲琼脂板清亮。

缓冲液配制方法：

(1)巴比妥缓冲液(pH8.4，离子强度0.05) 巴比妥钠 l0.3克 巴比妥 1.84克 蒸馏水 加至3，000毫升

(2)硼酸盐缓冲液(pH8.6，离子强度0.05) 硼酸钠(Na2B4O7·10H2O) 19.05克 硼酸 6.2克 水 加至3，000毫升

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注意：为防JL电泳时两极缓冲液槽内pH、离子强度的改变，可采用每次电泳时调换正负极的方法。或者每次电泳后合并两极

177糟内的缓冲液贮存，必要时可加水稀释至所需离子强度后再使用。

4．制板

常用琼脂板最合适浓度为l~1.5%，因为此浓度形成的凝胶富有弹性，坚固不脆。 取一定量的琼脂块，放小烧杯内在水浴上热溶，趁热与等体积预热至60℃左右的缓冲液混合，继续加热至表面无气泡。迅速用滴管涂布在水平的玻璃片上，由于表面张力的作用可使琼脂厚度达3毫米左右，冷后凝固即成为缓冲液琼脂板。

注意：(1)两极槽中缓冲液，与制琼脂板所用缓冲液离子强度之间有一定的关系。如琼脂板的离子强度过低，电泳时则会导致阳极琼脂面下陷；反之，板之高子强度过高，电泳时阴极琼脂面下陷。

(2)制板所用的缓冲液较槽内缓冲液离子强度要高一倍，这样与等体积的琼脂混合后，制成缓冲琼脂与槽内缓冲液离子强度相同。

5.点样

一般样品，初次电泳都点在琼脂板的，以后根据电泳结果，对点样位置可再选择。点样形式可以是圆点，也可以是带状。

圆点状： 即在琼脂板中线上用尖嘴吸管吸一小孔，再用毛细管将样品溶液加入孔内。

带状：在琼脂板垂直于电场方向用窄刀片插一段裂缝，用一小片蘸有样品的滤纸片准确地插入缝中。

注意：(1)样品不能沾在琼脂板面或溢出加样孔。

(2)样品浓度4~5%为宜，浓度太高时易拖尾，引起色带扭曲不正。

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(3)琼脂电泳所加的样品应无沉淀颗粒，否则拖尾无法分离。

(4)样品溶液离子强度不宜过高， 以免发生琼脂面高低不平现象，对于硫酸铵沉淀的蛋白质，琼脂电泳前要透析除去一部分离 子。

(5)样品pH不应过高或过低，否则影响电泳速度，甚至可与 178琼脂发生作用。

6，电泳装置(图13-3)

电源：0~1，000伏特的调压稳压整流器。

电极：直径0.5毫米白金丝二根，作正负电极用。为保证电场均匀，电极与缓冲液槽等长。

电桥：要求毛细管作用大，吸水力强，用泡沫塑料或用4~6层滤纸做桥。 缓冲液槽：用3~5毫米厚的有机玻璃胶合成长方形槽，高4厘米，宽7~8厘米，长30~50厘米，中间用多孔有机玻璃板把槽隔为二部，一半放电极，另一半放电桥。

最简单的缓冲液槽可用肥皂缸，每只可容缓冲液150毫升左右。 7.电泳

加样完毕，琼脂板两边轻轻夹入二缓冲液槽内海绵电桥之间，接通电路，调节至所需电压，一般电位降为6伏特／厘米。

注意：（1)琼脂板与两极缓冲液液面距离最好不超过1厘米。

(2)电泳宜在4~20℃进行，如室温过高则散热不良，水分蒸发过多，蛋白质的自由弥散加速，影响电泳效果。

（3)由于外加电压的存在，电场强度的实际数值与计算结果相差较大，最好用伏特计直接测两端电压。一般8厘米长小板电泳，电压要用200~250伏特。

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179 8．染色

染色的目的是利用待检物特殊显色反应或生物学活性作定性鉴别。染色后的标本板可直接印相。染料配制方法见表13-4

表13-4

染色步骤如下：

（1）固定： 电泳完毕，琼脂板浸入以70%酒精配制的2%醋酸固定溶液中15~20分钟进行固定。以增强检出区带的不溶性，并使之与染料结合力强。固定后的电泳板，必须用自来水漂洗数次，除去酸性固定液及盐类。

（2)干燥： 琼脂板干燥后染色，可使着色均匀，且便于操作。上述漂洗后的琼脂扳，表面盖嚅滤纸，在40℃左右烘干或吹干，则琼脂成一膜附在玻片上。

上述四种染料中，氨基黑与蛋白质结合力最强。干燥电泳板染色30～50分钟后，取出用10乃醋酸漂洗，使背景染色脱净。取出用自米水冲洗一次，室温晾干即可。 180五、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，是以聚丙烯酰胺作为支持体的凝胶电泳技术，具有以下特点：

(1)聚丙烯酰胺是合成的多聚体，可以根据需要来控制孔径的大小。

(2)在聚丙烯酰胺凝胶中进行电冰，可根据蛋白质的二个参数进行分离。即：电泳与蛋白质的静电荷有关；又与蛋白质的分子量有关，因此其分辨率超过一般的电泳技术。

(3)聚丙烯酰胺凝胶性质稳定，机械强度大，透明度强，染色后便于观察结果。 (4)样品用量少，一般为10微克左右，对稀溶液也适用。 (5)适于分离物质的分子大小范围广，图谱重现性好。

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因此，目前在生物化学、分子生物学、细胞学、免疫学等方面的研究中已被广泛采用。在中草药及天然活性物质的研究中，这门技术也用于蛋白质、多肽和酶的提取、分离、鉴定上，并成为不可缺少的工具。

目前聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛使用的有两种形式： 圆盘电泳和薄片电泳。其原理相同，可根据工作需要决定采用哪一种形式。

1．基本原理 (1)丙烯酰胺的聚合

聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和交联剂，甲叉双丙烯酰胺(N，N)-Methylenebisacrylamide)在催化作用下，聚合成；维网状结构。凝胶的孔隙性质可因为单体与交联剂之配比，和使用催化系统的不同而不同。常用的催化系统有： ①过硫酸铵—TMED(四甲基乙二胺)系统。通过产生游离氧原子，使单体成为具有游离基的状态。从而发生聚合作用。

②核黄素—TMED系统。是一个光激发的催化反应，通常需要日光灯做光源。 181 分子式

聚合好的凝胶为无色透明、具弹性的固体。在一定范围内改变凝胶总浓度(单体加交联剂)和单体与交联剂之比，即可改变凝胶的孔隙度及其机械性质。凝胶浓度高，空隙小，适于分离小分子物质；反之，凝胶浓度低，孔隙大，适于分离分子量大的物质。如果单体浓度低于2%交联剂小于0.5%则不能聚合，单体与交联剂重量之比—般以30左右为宜。当增加单体浓度时，要适当降低交联剂浓度。 182

凝胶浓度与被分离物质的分子量大小的关系，大致范围如表13-5：

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表13-5

(2)电泳原理

利用电泳在不连续系统(凝胶孔径不同，缓冲液离子成分不连续，电位梯度不连续)中进行，使样品浓缩成一个较狭窄的起始区带，再通过电泳过程，从上到下产生三个物理效应：浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，使分辨率提高。其不连续过程，主要通过制胶浓度、配制不同离子的缓冲液，以及电泳过程自动形成的电位梯度 的不连续性实现的。

以圆盘电泳、pH8～9系统为例说明：

凝胶在玻璃管内聚合后，与上、下两电极槽的缓冲液相连，电泳方向自上而下。

在通电之前，有三种胶接在一起的胶柱，自上而下顺序为：样品胶、浓缩胶、分离胶(见图13-4甲)。

样品胶：包含有样品在内的大孔胶，其主要作用是固定样品，防止与上槽缓冲液对流。

浓缩胶（间隔胶)：也是大孔胶，其主要作用是：当电泳开始后，从样品胶走下来的样品，在此层胶内，按其迁移率递减的顺序，逐次在分离胶的界面上形成区带。

分离胶(小孔胶)：适当孔径的胶，样品在此胶层内进行电泳，并进行分子筛分离。样品本来在大孔胶中受阻力小，速度快，下行 183 图13-4

到小孔胶受到阻力大，速度减低。因此，在大孔胶和小孔胶界面上压成狭窄的区带。

配制三种胶的缓冲液均含有电泳时迁移率最大的离子，如K+、C1-，称为先行离子；而在上、下二电极槽内的缓冲液中则含有符号相同，但有效迁移率小的离子，称为尾

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随离子。一般尾随离子为氨基酸，或弱酸、弱碱。再选择适当pH使样品有效迁移率介于二者之间。这样，在电泳时，先行离子走在前面，尾随离子走在后面，样品分子则夹在中间。在pH8～9系统中：先行离子为Cl，尾随离子为[甘氨酸]。

在电泳开始后，先行离子自样品胶的最上端开始下降，来自电泳槽的尾随离子接着进入胶内。在先行离子离开之后，电导度降低，电位梯度变大，使尾随离子被迫加速而赶上先行离子，样品则被两种离子所夹(见图13-5)，浓缩成薄层。

移动界面进入分离胶时，因pH与上面的浓缩胶不同，尾随离子成分的解离度发生了变化，迁移率大于样品的每个成分，结果便越样品成分，而与先行离子一起移动，并使样品处于均一的电位 184

图13-5 图13-6

梯度和pH值的区域中电泳移动。各种组份在份离胶内，按分子大小和电荷差别而分离

(见图13-4丙)，其分离程度由凝胶所含的丙烯酰胺浓度所决定。

2．装置与电泳系统

(1)电泳槽：一般用的为篮式电泳梢(见图13—6)，上槽可以上、下移动；能适用于不同长度的胶棍

(2)直流稳压电源：一般采用 0~600伏60毫安。

(3)其他：玻璃管，内径5毫米，长10厘米；2毫升针筒一只，长注射器(8厘米)，细嘴玻璃吸管等。

(4)电泳系统：缓冲系统一般分为三类：

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高pH值—一常用pH8.9，适用于酸性和中性成分。

中性pH值——常用，pH7.5，适用于酸性或中性蛋白质、酶． 低pH值——常用pH4.3，用于碱性或中性蛋白质。 具体配制方法见袁13-6。

贮备液：置棕色瓶中在冰箱中可保存数月。

工作液：按各组份的比例混合，在冰箱中可保存数周。过硫酸铵溶液：在使用前配制可在冰箱中保存一周。 185 表13-6 186

丙烯酰胺为剧毒品，可通过皮肤、粘膜吸收，是神经毒，故操作要小心。当聚合之后则毒性减低。

3．操作步骤

(1)制备凝胶：将欲使用的贮备液，从冰箱中取出，在室温放置。计算好所使用各溶液的体积。将洁净干燥的玻璃管垂直插入橡皮垫中(可用小翻口橡皮塞代替)。

先配制分离胶；按分离胶的配方取贮备液(除过硫酸铵溶液以外)混合之。再取所需要的过硫酸铵溶液与上述混合液分别放入真空干燥器中，脱氢。然后再将二种溶液混合，用吸管吸取此溶液，沿管壁加到插入皮座的玻璃管中，每支玻璃管加5～6厘米高，然后用注射器沿管壁徐徐加入2~3毫米厚的水层，以防止胶凝固后表面呈凹形，并使胶与空气隔开。将此胶柱静置，待聚合后，可看出在水层与凝胶表面形成明显的界面，再放置30分钟，除去上 面的水层，用滤纸将水吸干。

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再配制浓缩胶；先用少量浓缩胶混合液洗涤一下玻璃管和小孔胶表面，立即吸于；再加入此溶液0.5～1厘米高度，上面再徐徐加入一薄层水，待聚合后，上面即可加入样品胶。

(2)加样：将固体胶溶解在大孔胶溶液中(样品可用5～100微克)，如果为溶液状态，则可适当减少配制大孔胶溶液中水的含量，与浓缩胶配法相同。加入上述已装好二层凝胶的玻璃管中，上面再复一薄层水，待聚合后，室温再放置0.5~1小时即可电泳；如果样品溶液太稀，加样体积太大时，样品胶的体积，玻璃管的长度均应增加，浓缩胶也要相应地加长。

如果不用样品胶，也可以将样品直接加在浓缩胶上。样品应配成含10%甘油溶液，或加入20～40%浓度的蔗糖溶液。待一切准备工作结束，最后再加样品，方法是：

将聚合好的玻璃管从橡皮座中取出，取时先用手指从橡皮座 187

的底部，挤住玻璃管的下口，再从橡皮帽边缘剥离，取出玻璃管。套好橡皮塞，插入上缓冲液槽。上、下槽各加200毫升缓冲液，上槽缓冲版应淹没每一支玻璃管，每一支玻璃管的下口使悬一滴电极液．以防浸入下面槽的缓冲液时带入气泡。将上槽向下移动，至l／4浸入溶液中。用微量注射器吸取样品蔗糖溶液，通过缓冲浓层，在胶的表面轻轻注入一薄层。然后在上槽溶液中滴入指示染料搅匀。在碱性系统用0.1%溴酚蓝溶液1~2滴；在酸性系统用甲基绿或次甲基蓝做指示剂。

(3)电泳：电路系统应在样品上柱前全部检查好，特别要注意各种pH凝胶系统电泳时，其正、负极勿接错。pH8.9系统，负极在上端。加完样品应立即打开电源开关。开始几分钟，电流应不超过2毫安／管，至样品进入凝胶后，电流可稍加大，一般控制2—4毫安／管。如果电流加至5毫安／管， 电泳过程会产生欧姆热，在室温条

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件下，样品区域温度为35~40℃，温度过高可致使电泳区带弯曲，分离失败。必须降低电流，延长电泳时间，或进行有效的冷却。当指示染料已下行至管长的3／4时，即停止电泳，关闭电源，吸出上槽缓冲液。取出玻璃管。上、下槽缓冲液分开贮存，可重复使用数次，但不能颠倒使用。

(4)取出凝胶：用带长针头的注射器，装蒸馏水，把针头插入玻璃管上端壁和凝胶之间。针头紧贴管壁，将玻璃管与针头平行旋转，并向里面注入水，边推进针头，将玻璃管与凝胶分离。待插入玻璃管妁1／2以后，抽出针头，再插入另一端，同样操作，抽出针斗以后，用洗耳球在玻璃管上加压，把胶柱压出玻璃管。一般凝胶浓度超10%时取胶较困难。此外，可以在制胶之前，玻璃管内壁；蘸少量硅油的棉球通过一下，便于凝胶从玻璃管中取出。

（5)染色：胶柱在10~40倍12.5%浓度的三氯醋酸中固定30分钟，然后在0．025%考马斯蓝R950(Coomassic brilliant blue R250)的10%三氯醋酸中染色一小时以上，再保存于10%三氯醋酸中，染色液可重复使用，如染料不够，可加几滴1%染料酒精溶液。 188

氨墓黑(Amido black 10B)染色：将胶柱浸7%醋酸配制的含1%氨基黑的染色液中二小时以上。此方法要在染色之后再浸入7%的醋酸溶液，以脱底色，并经常更换新的浸洗泊，直到不再有染料被浸出为止，一般需要2～3天。

4．旋胶聚焦电泳技术

在制备聚丙烯酰胺凝胶柱时，在胶的混合液中加入载体两性电解质。含有载体两性电解质的凝胶柱，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个从阳极到阴极连续增加的PH梯度。如果把蛋白质加入此体系中电泳时，不同的蛋白质即移动并聚焦于

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相当其等电点的位置， 可以达到以下目的：

(1)按等电点的不同来分离蛋白质。分辨率高，可做分析和制备的方法。 (2)测等电点以鉴定蛋白质。电聚焦后，测其蛋白质最高浓度部位的pH，即为等电点。

(3)在聚丙烯酰胺凝胶中进行等电聚焦，所得的区带不产生对流，可以切割相应的区带，经洗脱后，得到较纯的部位。

(4)对于很稀的溶液，如0．005%的蛋白质样品也可以适用。其操作如下： ①配制溶液：丙烯酰胺30克，Bisl克，溶于100毫升水中；1%过硫酸铵溶液； 上电极槽(正极)溶液：0.2%硫酸(或磷酸)水溶液； 下电极槽(负极)溶液：0.4％乙二胺水溶液；

载体两性电解质(AmPholine)为40%浓度的水溶液，有各种pH范围的制品，国产Ampholine为20%浓度的水溶液。一般测未知样品，先使用pH3~10的载体，初步测定范围之后，再改用较狭的pH范围，提高分辨力。

②制胶柱：制胶溶液体积之比为：水8.0；载体两性电解质0.3(40%)；丙烯酰胺溶液3．0；

过硫酸铵0．7。样品溶解在上面规定的水体积之内，如果样品为水溶液，则加样体积应由规定的水体积之内除去；以使胶的总浓度不变。将上述液体混合均匀，立即装 1进垂直插在橡皮帽上的玻璃骨中，胶柱高10厘米左右，上面盖一薄层水，静置，待其聚合后可进行电泳。

③电泳：将聚合好的胶柱绕到电泳槽中。上槽为上极，内装硫酸溶液。下槽放入乙二胺溶液为负极。全部检查完毕，打开电源，调节电流，使每管为2毫安，总电压

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不应超过200伏。在进行聚焦的过程，电流不断下降，降至电流接近于0，即使再增大电压，电流也不上升时，表明聚焦已经完成。切断电源，分去上层缓冲液，取出胶柱。

④求等电点：

上面取出的胶柱，经染色后，平放在一块玻璃板上，玻璃板下面压一张坐标纸，通过坐标纸的小方格可以数出胶柱的长度和显色区带的位置。计算每一小格相当于多少pH，然后计算出每一区带相当的pH，此值即为该蛋白组份等电点的近似值。 5．凝胶电泳测定分子量

用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子凰又称为SDS(十二烷某磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳法。当蛋白质在pH 7.1，1%SDS，1%巯基乙醇中，在37℃培育三小的后，所有蛋白质与SDS结合，形成差别极小的带负电荷的复合物。此时电泳移动的情况与电荷无关，而其移动速度与物质分子量的对数成反比，在一定范围内呈线性关系。

如果用已知分子量的蛋白质或多肽作标准物凰 以各蛋白质的移动距离与分子量的对数做固，划印一条标准曲线，可用来测定未知物质的分子量。这种测分子量的方法目前已代替了超离心法。 190

191第十四章 凝胶层析

近年来在中草药有效成分和天然活性物质的研究中，陆续发现一些水溶性的高分子化合物具有很强的生理活性。对于这些成分的分离、分析需要使用一些特殊的方法，凝胶层析法就是常用的方法之一。

凝胶层析法是六十年代发展起来的一种分离分析技术，所使用的固定相“凝胶”具有分子筛的性质，设备简单，操作方便，获得结果正确可靠，数年之内已发展成为

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生物化学研

究中的常规分离分析方法。凝胶层析在文献资料中出现的许多同义词有：凝胶过滤(Gelfiltration)、分子筛过滤 (Molecular Sieve filtration)、阻滞扩散层析(Restricted diffusion

chromatography)、排阻层析(Exclusloll chrolilatography)、凝胶渗透层析 (Gel permeatioa

CaromatograFhy)等。在葡聚糖凝胶的使用之后又相继发展了多种凝胶，例如丙烯酰胺凝胶

(商品名为Bio—Gel P)、琼脂糖凝胶(商品名为Sepharose，Bio-Gel A)等，同时还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基交联葡聚糖凝胶(CM—Sephadex)、二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶(DEAE—Sephadex)、磺丙基交联葡聚糖凝胶(SP-Sephadex)、苯胺乙基交联葡聚糖凝胶(QAE—Sephadex)等带有离子交换基团的凝胶；因此这类凝胶具有离子交换及分子筛双重性质与功能。还有羟丙酰基交联葡聚糖凝胶(Sephadex LH20)，为亲脂性的可在有机溶剂中进行分离的分子筛。本章主要介绍应用最广的葡聚糖凝胶及其层折方法。

一、葡聚糖凝胶的性质及其类型

交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂(一般为 192环氧氯丙烷)以醚桥的形式互相交联形成的三维空间网

状结构图（14-1)，是水不溶性的白色球状颗粒；在酸性环境中能水解，在碱中稳定。凝胶颗粒的表面有许多孔隙；其孔隙的大小决定于葡聚糖 图14-1 表14-1

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193与交联剂的配比及反应条件。其交联度越大，网状结构越紧密，孔隙越小，吸水膨胀就越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，孔隙越大，吸水膨胀就越大。商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以叹水量宋表示：英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的阿拉伯数

字表示凝胶的吸水量再乘以lo的值。例如：G—25的吸水量为每克2．5毫升。不同型号的葡聚糖凝胶的性能见表14-1。

由衷可知，凝胶的工作范围板广，分子量从0~700直到5，000～800，000。

二、 葡聚糖凝胶层析原理

葡聚糖凝胶的层析，除葡聚糖凝胶LH20之外，均在水溶液中进行，凝胶颗粒在适当的溶液中浸泡，待充分膨胀后装入层析柱，加样后用同一溶液洗脱。在洗脱过程中，较小的分子渗入凝胶，较大的分子随溶液流动，而渗入的情况随分子大小而定，并处在一个动态的平过程中，因此，在多种成分进行凝胶层析分离时，从柱中流出的次序按分子量递减的顺序排列，其简单原理可用图14—2表示。

图12-4 194

在层析过程中，凝胶的分离特征直接和洗脱溶液的体积有关，为了准确地表示层析过程，几个常用的术语及其概念说明如下；凝胶装柱以后，柱床所占的体积为“床体积”，用Vt裹示。柱床内存在于凝胶外面的水凋积称“外水体积”，用Vo表示(图14—3)。凝胶颗粒内部矿含的水相体积称“内水体积”、：用Vi表示。Vg为凝胶颗粒本；身的体积。其相互关系如下：：Vt=Vo+V1+Vg

图14-3

自加入样品时算起，至流出组份最大浓度出现时，所流出的体积称“洗脱体积”

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用Ve表示对同一类型的化合物，洗脱特性与组份的分子量有关。

Ve=K1—K2㏒M

K1、K2为常数，M为分子量。说明不同组份流经凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的，洗脱体积小，最先流出来。当条件固定时，Ve的重现性很好，可以用来表示组份的洗脱性质。Ve—Vo为二条洗脱峰的间距，称为“分离体积”(图14—4)。

三、葡聚糖凝胶层析实验技术 1．凝胶的选择

在一般情况下，欲分离分子量极为悬殊的物质时，使用较粗颗粒，可用100~150目粒度，

慢速洗脱，即达到要求。如对肽类和低分子量物质的脱盐可米用G—10，G—15。一般脱盐采用G—25较妥。但对于分离分子量比较接近，洗脱曲线之间易引起重叠的样 195品，不但要选择合适的凝胶类魏而且对商品凝胶还要做适当的处理。用水浮选法，除去葡聚糖凝胶的单体、粉末、碎片。可选用75微米的粒子（相当于200目)。将选择好的颗粒，加入欲使用的洗脱浓中溶胀，溶胀时间随凝胶不同而有差别(见表14—1)。 图14-5

2．层析装置

在进行粗分离时，柱高可用30厘米左右，也可再艮一些。希望装柱后内水阵积在100毫升以上，使流出液读数的误差减小。柱的直径可采用2．5厘米左右。需要提高分离效果时，可选用细而长的柱，柱高可达1~1．5米。在柱的下端装有滤板，滤板下面的空间应尽量小，以减少样品在洗脱离开凝胶后扩散，避免拖尾现象。为了使柱床装的均匀，要求尽

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量一次装柱；装柱时，在柱的顶端接上一个与层析柱直径相同，高度为柱长1／2至1／3的引伸管，整个凝胶层析过程最好维持恒压，恒速，这就保证下浦出滴休的恒定，在使用计时分部收集枯时，这种装置尤为重要（图14—5)。

3．装柱操作

先将柱校正于垂直位置，柱顶装引伸管，柱内加少量洗脱液，移动出口细管排除滤板下面的空气；旋紧出口螺旋夹，将洗脱液加入层析管1／4左右，再把脱过气的凝胶浆从引伸管上口连续加下。立即打开出口，勿使流速太快，随着凝胶的沉降，流速渐慢，最后全部打开出口。超过一米高的柱床流速相当慢，待全部凝胶沉降后，静置20分钟，层析床表面不再下降，沉降紧密即可。如果床表面不平，或在柱壁上粘有凝胶粒时，可在床表面上端2厘米处，沿柱壁圆周旋转轻轻搅动溶液，使凝胶重新悬浮再沉降。

层析床是否均匀对分离效果起决定作用，检查层析床最简便 196

的方法是用肉眼观察有无“纹路”和“气泡”。如果在柱的背景上透一支与柱平行的日光灯则观察更方便。

但较精确地校正层析床的均匀性，是用完全被凝胶排阻的标准有色物质，如：蓝色葡聚糖(Blue Dextran 2，000)、细胞色素C(Cytochrome C)等。常用的为蓝色葡聚糖2，000，其平均分子量为二百万。配制其0.2%含量的0．02M氯化钠溶液，使用体积为

0.5～1毫升／厘米2柱横截面。将此染料溶液仔细地加到床表面，再开始用0．02M氯化钠溶液洗脱。当染料开始层析时，在出口收集流出液，直到染料开始流出为止。所收集的溶液即为该层析床的Vo值。在此过程中可以从蓝色区带移动的情况知道层

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析床的均匀程度。

4.加样

装好的层析床，至少要用3倍于层析床体积的洗脱液平衡，待平衡液流完，液面在床表面上1～2亳米时，关闭出口，用滴管吸取样品溶液，在床衷面上约一厘米高度，沿柱壁圆周，徐徐将样品注入。加完后打开出口，使样品完全渗入层析床。再关闭出口，用少量洗脱液如上操作，将管壁残留的样品洗下，再打开口，至上面少量溶液渗入柱内，关闭出口，柱床上面覆一薄层脱脂棉，以保护柱床表面，然后加入洗脱液，接上高位瓶，打开出口，即开始层析。

样品溶液体积要小，尽量浓，这样流出的峰形好。当制备性分离时，所允许的样品体积可大一些。可多至床体积的四分之一。样品在上柱前要过滤或离心。如果被分离物质沉淀与温度有关；则必需使样品温度与层析温度一致。

5．洗脱

洗脱液的选择，决定于上柱样品的性质，对于分离中性物质，多用水及电解质溶液。如酸、碱、盐的溶液及缓冲液。对于阻滞较强的组分，也有使用水与有机溶剂棍合，如水—甲醇、水—乙醇、水—丙酮等为洗脱液。芳香化合物在高交联度的凝胶上层析时，有阻滞作用，这种阻滞作用因洗脱溶剂的改变而改变，可使阻滞减弱或消除。若用交联葡聚糖G—25测定肽的分子量时，以酚—醋酸—水

197

(1：1：1，重量／体积／体积)作为洗脱剂时，芳香基团的肽就不被阻滞。同样，用氢氧化钠溶液或醋酸—吡啶缓冲液，以及脲和硫等都能消除芳香基的影响。近年来离子交换分于筛层析时；用线性梯度缓冲液洗脱可达到较好的分离效果。

6．收集和检出

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凝胶层析流速比较慢，收集流份要多，最好和分部收集器相连，按被分离的物质特性进行检出。样品如为蛋白质、核苷酸或多肽，则需用紫外分光光度计检出，分别在280nm、260nm或230nm测每一流份的光密度。然后以样品管数为横坐标，光密度值为纵坐标，画出各组份的洗脱曲线。

7．样品的浓缩和干燥

用凝胶层析所收集的水溶液组份，如果是对热不稳定的物质，则需进行冰冻干燥，现介绍一种我们实验室应用的简易冰冻干燥器，操作简便，不需五氧化二磷，并减少真空泵运转时间。全套仪器由四部分磨口玻璃零件组成：1为真空活塞部分；2为冷凝井，在上部烧

结一与井体外径相切的侧臂卸在侧臂的末端与接头4相连，接头下面的四只阴磨口再连接具有阳磨口的样品瓶5。操作时，先将样品瓶中装满收集液(可放满瓶的3／4体积)，然后放入

干冰中冷冻。将井体插入装满干冰的保温瓶中。活塞和各磨口涂好油脂。冰冻好的样品装到仪器上之后；立即抽真空。开始抽真空要注意；瓶内的冷冻样品是否有气泡产生如有气泡说明冷冻不完全，必须停止抽真空将样品重新冷冻。在正常情况下用真空泵只需抽气15分钟即可关闭真空活塞，由于干冰的冷却和仪器结构的特点，系统内一直维持浓高的真空度，可使样品水分全都抽干，冷结在井内。一昼夜可 图14-6 198

干燥溶液120毫升。如果在停止抽真空后不久样品全部溶解；说明仪器系统漏气，或油泵真空度不高。对于实验室小量的水溶液冰冻干燥可以采用此仪器。

8．凝胶的再生

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一般说来使用过的凝胶不需经任何处理；只在层析柱用完之后，用缓冲液稍加平衡即可进行下一次层析。但往往有一些“污染物”沉积在柱床表面，或是柱层表面的凝胶改变颜色，可将此部分凝胶用刮刀挖掉，适当加些新溶胀的凝胶再进行平衡；如果整个柱有微量污染，可用0．2N氢氧化钠(内含0．5N氯化钠)处理。如果层析床严重污染时，必需将凝胶再生，重新装柱。

凝胶柱经多次使用后，如发现凝胶的色泽改变，流速减低，衰面有污染物等情况时则需要再生。常用温热(50℃左右)的0．5N氢氧化钠和。0．5N氯化钠混合液浸泡，再用水洗净。经常使用的凝胶足以湿态保存，加入0．02%的叠氮钠(NaN3)，可保存一年不致发霉。

凝胶的干燥方法：再生后用大量水洗涤，然后逐步提高酒精的浓度，使之逐步皱缩，如皱缩太快要引起结块。然后在60～80℃干燥，或最后用乙醚洗涤快速干燥。在操作过程中所用的蒸馏水、器皿和实验室都要干净无灰尘，避免操作时再度污染凝胶。

四、亲脂性交联葡聚糖凝胶

在交联葡聚糖分子上引入一个基团，则增大其亲脂性。如LH—20型交联葡聚糖凝胶即为在G—25上引入羟丙基基团。这种凝胶具有亲水性又有亲脂性，可以在多种有机溶剂中溶胀后应用，如：氯仿、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等；但在甲苯、醋酸乙酯中溶胀不多。这种凝胶在pH大于2的无氧化剂溶液中稳定。

使用方法与一般交联葡聚糖凝胶类似。用低级醇为溶剂时，芳香族、杂环化合物在凝胶上有阻滞作用；但用氯仿为溶剂时，使这些化合物不受阻滞；而对含羟基与含竣基的化合物有阻滞作用。 199

葡聚糖凝胶LH20适用于有机物质的分离，如脂类、固醇类、保护多肽和脂溶性维

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生素等。其吸水量为2毫升／克干凝胶，其分离范围为100～2，000和100～20，000两种(在氯仿中)。其羟丙基[HO(CH2)2—CH2O-]还可以根据需要将烷炷加长，曾经加长到11~14和15~18个碳原子，这种凝胶分辨力更高。

五、葡聚糖凝胶层析的应用

凝胶层析法在植化方面的应用实例： 1．山杨

从植物山杨Populus tremula的皮和叶提取物中，经Sepha—dex G—25层析、以水—甲醇(9：1)洗脱得到五个峰，分别为：水杨甙(Salicin)、白杨甙(Populin)、特里杨亭(Tremuloidin)、大齿杨素(Grandidentatin)、柳匍匐甙(Salireposlde)。 2．黄酮

用Sephadex LH20层析，以甲醇为溶剂洗脱，可将多种黄酮(Flavone)分离开。黄烷酮(Flavanone)也可以进行分离。 3．槲寄生

从槲寄生(Viscum albumL．)叶或茎的提取物中，分到三个蛋 白粘毒索(Viscotoxin)，分别为：粘毒素A3、粘毒素A2、粘毒索B。其方法如下：

槲寄生叶或茎的提取物，经Sephadex G—95层析得粘毒素粗晶。将粗粘毒素用磷酸基纤维素析层，用含0．2M氯化钠的pH5．0，0.05M醋酸钠缓冲液洗脱，得I～Ⅱ曝然后将洗脱液的氯化钠浓度增至0．7Mo得到Ⅲ、Ⅳ、V峰(图14-7)。

将峰Ⅳ和峰V分别经磺乙基葡聚糖凝胶(SE—Sephadex)层析，用1/15pH 5.0磷酸盐缓冲液和1/15pH 8.0含氯化钠0.125M的磷酸盐缓冲液，以线性梯度洗脱。从峰Ⅳ中分出5个峰，其主要的峰3即为粘毒索B，见图14—8。 200

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图14-7 图14-8 图14-9

从峰V中，以相同方法得到4个峰，其中两个主要的峰3、峰4分别为粘毒素A2和粘毒素A3，见图14—9。

此三个毒素均为碱性蛋白质 201

六、薄层凝胶层析

使用超细粒度(10~40u)的凝胶，可以做薄层凝胶层析，但要使用交联度较小的凝胶（G—50以下)，较易制板。待凝胶在缓冲液中充分溶胀，放置沉降，倾去上层水，即可铺制薄层，不必加粘合剂。玻璃板必须洁净，一般用板为20×40厘米。用10克凝胶可制板2~3块。胶层厚度以0.6毫米为最佳。铺好的板即放入层析槽中两端先用滤纸杀与缓冲液相联，调节板和水平线夹角约为7～8°，展开24小时。速度为1.7~1.9厘米/小时(可用细胞色素C或蓝色葡聚糖-2，000为标记)。每个样品可用5微升，含30~50微克。一般薄层展开16~18小时，展开完后；凝胶板可置碘缸中显色。亦可用滤纸复印后，在滤纸上显色。亦可用滤纸复印后，在滤纸上显色。用此方法可以进行小量多肽和蛋白样品的分子量测定。凝胶薄层这一技术尚在不断发展中。

202

第十五章 液滴逆流层析

利用混合物中各组份在二液相间的分配系数的差别，由流动相成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的方法称为液滴逆流层析(Droplet counter—current chromatograPhy简称D.C．C)。该方法是1970年由日本谷村急德(Takenori Tanimura)

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在液相层析的基础上创建的，它与以往的层析概念不完全一致，但其操作及获得的结果不仅与以往的层析类似，而且比之具有更多的优点。液滴逆流层析开始用于生物化学，后来用于生药的半微量及至制备性分离。经过实践证明液滴逆流层析在天然物的分两纯化及定量测定方面是一种有用的新技术。

液滴逆流层析不仅与以往的层析比较具有同样的分离效果，而且在不少方面与其他层析比较具有独特的优点。它不用固体作为固定相担体，因此避免了固体担体如氧化铝、硅胶等而引起的固体表面化学反应，造成分离样品的变性。在应用固体作为担体的层析分离中，往往会存在不同程度的不可逆吸附，造成分离样品的损失，尤其在分离微量样品时，这些层析就受到，而液滴逆流层析就不存在这种弊病，即使分离不成功，供分离的样品亦可以定量地回收。在分离过程中，分离样品不接触空气，因此不必考虑样品的氧化。再者，通常层析在用溶剂冲洗时，尤其在用极性溶剂冲洗时，往往固体担体上的杂质被溶出而造成分离样品的污染。在重现性上液滴逆流层析也较一般层析要好，通常的柱层析，其分离的效果与固体担体的纯度、吸附活性及装柱技术有很大的关系，而液滴层析不存在这些技术性问题。

液滴逆流层析原理相仙于逆流分配，但逆流分配装置有许多玻璃制的带有接头的复杂分配管，在分离操作中为了使分离样品在二相中很好的分配，必须充分振摇所有的分配管，这样很容易引 203

起分配管接头的破损及漏液，而且溶剂系统容易乳化，整个过程所需的溶剂量很大，而液滴逆流层析仪的分离管虽然也有用玻璃管制的，但是它是固定的，故不易破损。同时作为分配的二液相的液滴不必很细，因此也不致乳化，另外，不进行振荡不会产生泡沫，因此非常适合于皂素的分离。所用的溶剂量一般在数升以下，比逆流分配用

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溶剂量少得多。

最近几年的实践证明液滴逆流层析是一种装置和操作比较简便，而且条件也缓和的层析技术，它不仅克服了其他层析的缺点，而又保留了其他层析的优点，无论在分离纯化皂甙、生物碱、酸性化合物、蛋白质、多肽、氨基酸及糖类等方面均取得较满意的结—果。

一、液滴逆流层析的原理

液滴逆流层析的原理相似于逆流分配，而液滴逆流层析是巧妙地应用一组垂直排列的分离管充填固定相，而使移动相成液滴通过固定相的液柱，促进溶质的分配，其原理模式如图15—1所示，

图15-1

与逆流分配一样，首先将移动相与固定相溶剂充分振摇平衡，然后分出重相(下层)及轻相(上层)，可以任选重相或轻相作为固定相，如重相阼为固定相，则轻相作为移动相，称为上升法(Ascending 204

method)；反之则称为下降法(Descending method)。现以上升法为例说明，如图15-1(a)，分离管内充满固定相，移动相以微型泵加压输送到分离管中，此时移动相在分离管下端形成液滴，由于重差在固定相内上升如图15—1(b)，液滴到达分离管上端f，如果微型泵继续加压送液，移动相就通过细的四氟乙烯输液管送到下一分离管，在第二管下端又形成液滴，如图15-1(c)，只要分离管和输液管继续连接，微型泵继续加压送液，液滴就一直连续的流到最后分离管流出而收集。从进入的混合物组份，依靠液滴通过固定相液柱而进行充分分配，流出的流动相分部收集，就得到分离的组份了。这种分配过程主要是当液滴通过分离管时，固定相在液滴和管壁之间形成薄膜，

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与液滴接触摩擦，在液滴内高效的拌搅，不断形成新的表面，促进混合物中各组份在二相中的分配，即使是在同一分离管中，由于液滴是连续的，因此固定相把移动相隔开，上下层液柱的搅拌混和电受到，因此在同一分离管中也保持了浓度的梯度，有利于分配的进行。

生成液滴的大小对分离的效果有很大影响。液滴大小则是由二液相间的界面张力、比重差、输液管的口径和分离管的材料决定的，其中影响最大的是二液相间的界面张力，如果界面张力大的二液相组合，例如水—己烷，自然生成液滴的直径为5毫米左右，因此通常在内径为2毫米的分离管内就不能生成液滴，选择任何一相为移动相，都将以活塞式流动(Plug flow)进行。这样用泵加压送入的移动相将把固定相挤出，最适合的溶剂系统二相间的界面张力为)，10达因／平方厘米，适合于液滴逆流层析用的溶剂系统列于表15—1。因此在选用溶剂系统时，不但要考虑溶质在二相间的分配系数，而且要考虑此溶剂系统是否能生成适当大小的液滴。在实际使用时，先选用数根分离管试验一下能否生成适当大小的液滴。表15—1的溶剂系统在实际应用时可以作一些变动亦可以生 成适当大小的液滴。

在分离生物碱时，亦可以在溶剂系统内加入适当的缓冲溶液，使移动相成不同的pH值，而进行pH梯度洗脱。

205 表15-1

分离管的内径可以改变，在实际应用中可以准备几种不同口径的分离管。分离管口径加大，就不易形成活塞式流动，但增加过大、则分离效果不好，口径太小(一般小于1毫米)则易引起活塞式流动。

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液滴在分离管内移动的速度，由二相比重和管壁的摩擦决定，泵输送辞动相的速度不影响液滴移动速，只影响液滴的生成及液滴的间隔，送液速度加快，则液滴的间陌变小，加速分离的时间。但速度过大，则液滴间隔几乎没有，变成线流，影响分配。在实际操作时通常选择在一定时间内生成液最多的速度。

206 二，装置

图15-2是液滴逆流层析装置的示意图，主要由三部分组成 图15-2

第一部分是输液部分，由微型泵、移动相溶剂贮槽和样品液注入器组成。第三部分是由检出器及分部自动收集仪组成。第二部分是分离管部分，分离管可以用玻璃管，四氟乙烯管或金属管制成，其内径大约在2毫米左右，每根长度可以在20~40厘米，分离管与分离管之间用内径为0．5毫米左右的四氟乙烯输液管连接，分离管可以从100根到1，000根。假如用四氟乙烯作分离管，因为分离管和输液管之间不易牢固的密接，故当分离管太多时，压力就要增加，往往容易引起漏液，因此分离管以100根为限。若用玻璃管做分离管，由于玻璃质较硬，可以与输液管之间牢固地密接，压力较高也不会漏液，因此分离管可以增加，目前日本的液滴逆流分配仪通常在300～500根之间。如日本产D．C．C—A型及D．C．C—S型液滴逆流层析仪均有300根分离管。在用四氟乙烯管作分离管时，若用上升法，则移动相能形成液滴；如用下降法，则移动相在下降时只能沿着管踏移动，不能形成液滴，因此用四氟乙烯管作分离管时，只能进{i逆相层析，即上升法，而用玻璃管作分肉管作分离管时，如果内壁涂以硅油，则能更好地形成液滴。

207

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三、液淌逆流层析的应用实例

液淌逆流层析不仅在分离纯化天然产物是一个有效的方法，而且在配合其他仪器定量测定天然产物的含量方面亦是一个方便而精确度高的方法，下面举几个例子说明。

1，柴胡皂甙的分离

柴胡（Bupleurum falcatum L）里含有多种皂甙，到目前为止，已分得七个柴胡皂甙(Saikosaponin)a、b1、、b2、b3 、b4、c、d因为结构上差别披小，一般分离方法较难分纯，尤其柴胡皂甙a和d仅在C-16位的羟基的构型不同，在板层上的比移值非常接近，柴田等报道用液滴逆流层析成功地将柴胡皂甙a和d分开。

分子式 柴胡皂甙a 柴胡皂甙b 208 柴胡皂甙c

先将柴胡生药粉用5%吡啶甲醇液提取，提取液浓缩眉悬浮于水，用正丁醇提摇，正丁醇溶解部位为总皂甙。用带509根Pyrex玻璃管的液滴逆流层析仪分离。分离管每根长40厘米、内径1．65毫米，用细塑料管连接分离管，每根长55厘米，内径为0.65毫米。溶剂系统为氯仿—苯—乙酸乙酯—甲醇—水(45：2：3：60：40)。采用上升法，即下层溶剂为固定相，用固定相充满分离管，然后取30毫克总甙溶解于下层溶剂，装入样品注入器，由底部压入分离管，接着用微型泵加压，将移动相溶剂连续压入分离管，从最后一根分离管流出的溶出溶剂用自动分步收集仪收集。每3克为一流份，每一流份减压蒸去溶剂，加水6毫升，

取出2毫升，冷却下加5毫升浓硫酸显色，分别在490nm处测定光密度，绘制成如图15-3之溶出曲线。

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图15-3

2．罂粟科紫堇属植物生物碱的分离

卢盛德、Manske等曾从植物Corydalis ophiocarpa Hooket Jhorns中分得了8个异喹啉生物碱，但其中还有不少生物碱在薄层层析上比移位非常接近，通常用一般层析方法准以分开。谷

209千秋等应用液滴逆流层析成功地分得了21个异喹啉生物碱，其中15个是叔胺生物碱，6个是季胺生物碱。分离过程中移动相采用了不同的pH溶剂，进行pH梯度洗脱。先将生药用常法分成非酚性叔胺生物碱(1)，酚性叔胺生物碱(Ⅱ)，季胺生物碱(Ⅲ)。

液滴逆流层析仪带500根1．8毫米×40毫米的分离管，其他条件如表15-2。 表15-2

(1)

非酚性叔胺生物碱的分离：先将S1的下层溶剂充满分离柱，样品(Ⅰ)5克用S1下层溶剂溶解，由底部注入分离管，然后依次用S1S2S3的上层溶剂作移动相逆流展开，每10克为1流

图15—4

份，每流份在280nm处进行光密度测定，绘成图15—4(a)的溶出曲线，从图上可以看出有10个不同的化合物峰。从峰1，2，3，4，5，6，7，9，10流份中得到生物碱A，B，C，D，E，F，G，J。从峰8流份中先析出结晶，为生物碱H，其母液中分得生物碱I。其中生物碱F及J为新生物碱，经结构鉴定分别为13—β—Hyotroxystylopine和Carpoxidine。

(2)酸性叔胺生物碱的分离：用上面同样方法分离，样品量为l克，结果作出图15—4(b)的溶出曲线，由图上可看到第11到

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210

第21峰，从峰13，17，18，21流份分别得到生物碱L，M，N，O。

(3)季胺生物碱的分离：用上面相同方法操作，样品量为1克，结果作出溶出曲线图15—5，、从第23到29峰，其中第28，29峰

是分离结束后，分离管分为二部分的流份峰。从峰23，24，25，26，27，28，29分别得到生物碱P，Q，R，S，T，U。

3．人参皂甙的分离及其含量测定

人参是大家熟知的滋补强壮中药，它具有多种药理作用。经柴田、田中、庄司等研究证明其有效成份为人参皂甙(Gensenoside)而人参皂甙又由Ro、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rf、Re、20—葡萄糖—Rf、Rg1、Rg2等10多个皂甙组成。进一步研究夜明Rb1具有抑制中枢神经系统及镇静作用，它是20—S—人参原二醇甙的代表成分。而Rg，则具有兴奋中枢神经系统及抗疲劳作用，它是20—S—人参原三醇甙的代表成分。 人参的同属植物很多，而同种植物的产地亦不同，加工方法也

211

不同，因此同属植物是否能代替人参供药用？不同产地及加工的人参效价如何？这就需要有一个简便而正确的方法来测定这些皂甙的性质和含量。以前曾建立了一些层析方法，但均较烦锁。最近柴田等应用液滴逆流层析测定了朝鲜白参Panax ginseng、西洋参P．quinquefolium、三七P．pseudoginseng Var．notoginseng、竹节人参P．pseudoginseng subsp．Japonicus 及狭叶竹节人参P．pseudoginseng subsp．Himalaicus Var．angustifolius等的各种人参皂甙的含量。

取5—10克生药粉末，经苯脱脂后用甲醇提取，提取物溶解于500毫升水中，用水饱和的正丁醉提摇，正丁醇溶解部位即为人参总皂甙，作为供分离及含量测定样品。

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液滴逆流层析仪装配有509根分离管(长40厘米，内径1.65毫光)，溶剂系统为氯仿—甲醇—正丁醇—水(体积比45：60：6：40)，下层作固定相，上层作移动相，用25毫克总皂甙溶于下层溶剂中，溶出溶液每3毫升为1流份，用自动分步收集仪收集，对每一流份用薄层层析与已知标准品对照检查，作定性测定，同时以酚—浓硫酸显色，于490nm波长进行定量测定，共收集220份，第40份前为固定相溶剂，得到的结果绘制成溶出曲线，图15—6为朝鲜白参，图15—7为西洋参，图15—8为三七，图15—9为竹节人参，图15—10为狭叶竹节人参。从图上可见朝鲜白参主含Rb1，Rb2，Rc，Re，Rg1，而Rd及Rf含量很低。而购自新加坡或栽培于日本的西洋参中不含Rg1，但在靠近Rg1处有一个未知的峰。此可能是朝鲜

图15—6 图15—7 图15—8 图15—9 212

白参与西洋参效用不同之原因。三七所含的皂甙较为简单，其中Rb1及Rg1的含量高于其它同属植物。竹节人参的成分完全不同，其主要成分为竹节人参皂甙IV及V，为齐墩果酸及葡萄糖醛酸及其他糖形成的甙。狭叶竹节人参则含Rb1，Re，Rg1及竹节人参皂甙V。另外对蒸制的红参进行测定证明总皂甙含量及个别皂甙的比例无显著变化。同时人参根的外层比内层有较高含量的皂甙。

液滴逆流层折从创建到目前还不到10年，但在实际应用中确实证明了它是天然产物分离精制的有效方法之一。目前日本已有商品出售．如液滴逆流层析D．D．C—A型及D．D．C—S型。

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图15-10 213

第十六章 干柱层析

干柱层析是指用填充剂干装成的柱进行层析分离的方法。早在本世纪初人们就在干柱上发现层析现象。当时由于对吸附剂干装柱的益处并未认识，在实验技术上也遇到一些困难，因此在三十年代自吸附剂采用溶剂湿装柱法后，干装柱法则很少被人采用。

随着层析技术的不断发展，薄层层析已成为实验室的常规技术，并得到普遍应用。在长期的实践过程中，发现薄层层析的分离效果比湿装的柱层析高。因此，有些用柱层析难以分离的棍台物，采用制备性薄层来分离。但是，用薄层分离的样品量有限，往往仅限于几百毫克样品。为了寻找高效的制备性层析分离方法，经过长期探索终于在六十年代中期发现干柱层析的分离效果与薄层层析相当。并对其实验技术做了改进，进而使干柱层析得到复兴。干柱层析已广泛用于有机化合物的实验室制备性分离。它的优点是：

(1)分离效果比湿装枉高。

(2)分离条件可用薄层层析探索，并可把薄层的最佳分离条件直接套用到干柱层析。

(3)由于采用了塑料薄膜柱，对有荧光或颜色的物质，可在紫外光灯下将已分离的各层带分别切开，避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带交叉。

(4)适用于制备性分离。

(5)设备简单，消耗溶剂少，工时省。

其主要缺点是：样品容量比湿装柱小，因此，消耗填充剂量大。

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214

一、基本原理及分离条件的探索和选择

干柱层析的原理与薄层层析相同，尤其是不加粘合剂的干推板。它们都是以干填充剂装

填层析床，并借颗粒间的孔隙所产生的毛细作用而展层，因此，薄层的分离条件可以套用到干柱上，分离效果亦相同。由于干填充剂颗粒的深孔内充满空气，在展层过程中，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，其吸附与解吸附过程主要在填充剂颗粒的外部表面进行。这样，克服了样品分子由于进出填充剂颗粒深孔所造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。

1. 填充剂

填充剂是决定柱效的主要因素，它的颗粒直径越小，直径范围越窄，装成的柱的效能

就越高。分离的层带窄而整齐，分离度大，可使比移值差(△Rf)很小的化合物得到分离。因此，在装柱前应将填充剂严格过筛，选用一定直径范围的填充剂。颗粒太细展层速度较慢，但对干柱层析来说，这并不是一个严重问题。展开一个用300一400目氧化铝装的50厘米长的柱子，历时亦不过3—4小时。：

干柱多用于吸附层析，常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。在选用吸附剂时，应注意其生产

厂家并控制在适当活性。一般来讲，降活性的吸附剂分离效果好，氧化铝的活性在Ⅲ~V级，硅胶的活性在Ⅱ~Ⅲ级较好。降活性的吸附剂在薄层层析中呈现的斑点较圆，在干柱层析中则层带集中。降活性和活性级别的测定方法可参阅本篇第六章。活性级别的测定常采用快速而简便的毛细管法。

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干柱也可用于分配层析。其填充剂由担体和固定相组成。固定相涂层的厚度和均匀性对

分离效果影响较大。涂层越薄，越均匀，传质越快，分离效果越高。

2．展开剂

多采用混合溶剂。在吸附层析中必须注意溶剂解混的产生。 216

当极性相差很大的两种或多种溶剂混合展层时（如石油醚—乙醇或氯钫—甲醇），极性大的溶剂优先吸附在吸附剂上。随着溶剂的展开，前沿的溶剂含极性成分越来越少，而吸附剂中离前沿越远则吸附极性溶剂成分越多。当达到一定程度时，则溶剂解混而形成第二个溶剂前沿(见图16—1)。这种现象在薄层层析中常常观察到，尤其是含水分较多的薄层板中，样品中两种或多种成分的斑点往往随第二个溶剂前沿无分离或很小分离地移动。溶剂解混后严重地影响干柱的分离效果。但在湿装柱中因吸附剂予先以溶剂浸泡则不会产生溶剂解棍。克服溶剂解混的有效方法是搭配极性相差适当的溶剂。如：石油醚—乙醚和氯仿—乙醇则不象石油醚—乙醇和氯仿—甲醇那样容易产生解混。适当提高吸附剂的活性也有助于克服溶剂解混。

含有苯、苯酚等不透过紫外光的溶剂对紫外光灯检出层带有影响。 图16—1

3．分离条件的探索

欲提高分离效果，除提高柱本身的效能之外，还需选择适当的固定相和移动相。所谓分

离条件的探索和选择，即探索和选择对某样品分离度最大的填充剂和展层剂。

干柱层析的分离条件可用薄层层析探索，其方法是将各种填充剂干推铺成板，分

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别以不

同溶剂展层后，以显色剂显色或紫外光灯观察。然后选择各斑点问比移值差大、斑点圆、分离点数最多的分离条件(最佳分离条件)作为干柱层析的条件。如果采用与薄层最佳分离条件完全相同的展层剂和填充剂进行干柱层析，就可得到与薄层相同的分离结果。但所用填充剂必须与薄层完全相同，即必须是同一工厂生产的一起降活性的同种填亢剂。否则干柱与薄层的分离结果是不能一致的。 217

4．样品容量

在干柱层析过程中，由于样品只能与吸附剂的外部表面接触其表面积未能完全利用，它的样品容量与湿柱相比是小的。样品量与填充剂量之比，一般为1：100至1：300。柱的样品容量由样品的复杂程度及样品中各成分的分离度所决定。样品成分越复杂，各成分的分离度越大，其样品容量就越大。

二、实验技术

1．柱的制备

柱的长度由样品约分离难易而定，一般常用50厘米的柱。若 图16—2 218

样品之各成分的分离度很小，样品容量很低，可采用70～100厘米长的柱。柱的样品容量决定之后，可根据样品量、吸附剂量及所需柱长，从图16—2中选择适当直径(或周长)的柱子。

用于干柱层析的柱有玻璃柱和聚乙烯薄膜柱(常称塑料薄膜柱)。玻璃柱的优点是容易装柱，装成的柱较均匀。但是，不易分割，并且因玻璃不透过紫外光，各层带在

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柱上的位置不能用紫外光灯确定。聚乙烯薄膜柱可以克服上述玻璃柱的缺点，但是，装柱较难。

装柱技术很重要，它是影响干柱分离的重要操作技术之一。方法如下： 、 剪取一定直径和长度的袋状聚乙烯薄膜，将一端封闭(见图6—3)。从另一端充入空气，并用橡皮筋扎紧。于80一90℃水浴上把袋状薄膜的两条折边烫平(如图16—4)，因两条折边与填充剂之间有较大的空隙，展层剂的移动速度比柱的其他部分快，而造成展带不整齐。解下橡皮筋，由开口端把一团棉花塞入底端。然后，将需要量的填充剂分数次倒入。每次倒入后，往硬表面上轻轻地礅紧(见图16—5)，直至手握上去觉得很坚硬为止(在礅紧过程中，

不要使柱子弯曲太大，这样容易使填充剂分段，且松紧不均匀)。用手轻拍柱顶，使填充剂顶端平整。将柱子吊在夹子上(见图16—6)，封闭端用大头针打若干个孔，待用。

玻璃柱的制备与上类似。取一定长度的玻璃管(柱)(两端平 图16—3 图16—4 219 图16—5 图16—6

楚)，一端盖一块滤纸并用橡皮筋扎紧。从另—开口端分数次加入填充剂，每次加入后在木头表面上礅紧，方法同上。但柱子装好后，因滤纸能透气，勿需打孔。

活性较低的吸附剂在装柱前勿需用展层剂饱和。若硅胶活性高至Ⅱ级，氧化铝活性高至Ⅲ级，应予先加10%展层剂饱和，方法同吸附剂降活性。否则展层过程中，溶

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剂前沿不易整齐，影响层带分离。

2．加祥和层层

加样技术与装柱技术同样重要。如果加样操作不当，可使层带倾斜或出现犬齿状，致使层带交叉。

加样有两种方法：溶液加样和拌样加样。其中以溶液加样较好。因为该法使样品分子均匀地吸附在吸附剂外部表面而形成分子薄层。在展层过程中，样品分子勿需进出吸附剂的深孔，传质速率快。但样品必须溶于展层剂。对于展层剂不溶的样品，可采用拌样加样。

(1)溶液加样法：将样品以适量展层剂溶解(样品太浓，加样后使填充剂结块。样品太稀，则加样带太宽，影响分离效果)。置于分液漏斗中，打开活塞迅速全部加于柱顶，使样品溶液立刻盖满柱顶(否则，加样带中的样品吸着不均匀)。立即用手轻拍柱顶，使

220

柱顶平移并赶走气泡（若气袍很难赶走，可用手轻捏加样带把气泡挤出）。待样品溶液全部吸入填充剂中，加少量展层剂洗2次。然后加展层剂展层。整个加样及展层过程中，必须保持柱顶平整，否则影响层带的整齐。

(2)拌样加样法：取适量样品易溶的低沸点溶剂把样品溶解。将5倍样品量的填充剂倒入样品溶液中（必须使全部填充剂湿润，若溶剂太少可继续加入)，拌匀，空气凉干或低温下减压抽干，呈粉状，加于柱顶。其他同溶液加样法。

(3)展层方法：将适量展层剂置于分液漏斗中，用塞子塞紧。把分液漏斗的下端插入柱顶上方5厘米处，打开下端的活塞使溶剂流入柱顶，待流至液面淹没分液漏斗的下端时， 自动停止。这样，展层可自动进行(见图16—6)。一般展层至柱底即告结

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束。如欲分离比移值较低的成分，可继续冲洗适当体积。

在展层过程中，溶剂前沿必须保持整齐。如不整齐，说明装柱不均匀或加样操作不当，可使层带交叉。因此，溶剂前沿整齐与否，可检验操作技术的好坏。

3．层带的定位及分割

层层完毕，有色物质的层带位置是显而易见的。对于无色化合物，在紫外灯下产生荧光或颜色的物质，可采用塑料薄膜柱，在紫外灯下确定其层带位置。若在紫外灯下既无荧光又无颜色的物质，可用荧光硅胶或荧光氧化铝作填充剂。如应用非荧光填充剂，可将柱子按一定长度分成若干段(见实例2)，或根据薄层的比移值推算层带位置（见实例1)。用50或100厘米长的柱子便于推算。如干柱与薄层的层析条件完全相同，推算结果与实际位置基本相符。为了防止因分割不当而使层带交叉，可将一个层带分成头、中、尾三段。这样，即使有交叉也只能在头、尾两段。

聚乙烯薄膜柱可用刀片切成段。玻璃柱可用刮刀将各段刮出，分别置于玻璃垂熔漏斗中以适当溶液洗脱。将各段洗脱液浓缩，再用薄层或其他方法检查各段洗脱液中所含成分及纯度。然后，把成分相同的段合并，以适当溶剂结晶。

221

三、干柱层析的应用

干柱层析已广泛用于制备性分离，包括人工合成的混合物和自然界中存在的复杂混合物，如：中草药化学成分、抗生素和有机合成药物等的分离与纯化。现以我们应用的几个实例说明之。其中例1可作为常规的干柱层析方法。象例2那样难分离的情况是不常见的，但它表明干柱层析的分离效果是如此之高，甚至可将化学结构非常近似的立体异构物分开。另外，我们应用聚酰胺干柱层析分离黄酮体也取得满意的结果，实例3即是一例。

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四、干柱层析操作实例

1．五味子酯丁的分离

在华中五味子Schisandra Sphenanthera Rehd．et Wils降血清谷丙转氨酶有效成分的研究中，某部位经氧化铝薄层检查有三点(见图16—7)。利用薄层条件进行干柱层析，得到五味子酯丁。方法如下：

图16—7

取层析用酸性氧化铝(120一200目，Ⅲ～Ⅳ级)240克，装于直径2.5厘米的聚乙烯薄膜柱中(操作见柱的制备)，柱长40厘米。将样品1.4克溶于10毫升苯—醋酸乙酯(6：1)中。加样，并以同样溶剂展层(操作见加样及展层)。展层至柱底，按薄层的比移值推算，三个成分在柱上的位置分别在离柱顶11.2~l7.6；17.6～27.2；27.2～33.2厘米处(见图16—8)。为了避免中间层带与上下两个层带交叉，将17.6～27.2厘米区段切成四段，上下两个层带也分成适当段数，则全柱切成10段(见图16—8)。每段置于垂熔漏斗中以醋酸乙酯洗脱，分别浓缩，以薄层检查各段的成分及纯度，结果如图16—8。

图16—8 222

第3段(10.5~16厘米处)为Rf较低成分的纯品，第5、6段(19.5～25厘米处)为Rf居中成分的纯品。其中4~6段以甲醇结晶，得五味子酯丁(图16—9a)。

2．五味子酯乙和酯丙的分离

五味子酯乙和酯丙（图16—9b）的混合结晶，用高速液相层析检查(固定相：聚乙二醇400；担体：Zipax；移动相：正庚烷)发现为两种成分的混合物，其化学结构非常相近。于是，模仿高速液相层析条件，用干柱分配层析进行制备性分离。方法如

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下：

图16—9 223

取国产硅球(青岛海洋化工厂产品，150～200目)置于圆底瓶中，加聚乙二醇200浸没硅球。于油浴上200℃加热2～3小时。滤出硅球，以丙酮洗至洗液蒸干后极少残渣，60℃烘干，备用。

取上述制备之与聚乙二醇结合的硅球215克，装于内径2．9厘米的玻璃柱中(操作见前)。酯乙和酯丙的混合结晶1克，以乙醚8毫升溶解，将5克聚乙二醇硅球倒入其中，拌匀，置空气中凉干。加于柱顶(柱高50厘米)，以石油醚展层。展层至柱底后继续冲洗1.5立升。然后按一定长度自上而下分成14段。每段以刮刀整齐地刮出，分别以氯仿洗脱，然后以高速液相层析检查，结果如图16~10所示。其中第l~4段和第14段得量极微。第11~13段为较纯的酯乙，第7段为较纯的酯丙，以甲醇—水结晶，分别得五昧子酯乙和五味子酯丙。

图16~10

3．染料木素与山崇素的分离

槐Sophora japonica L. 角的酒精提取物，以酸水解，析出沉淀物。该沉淀物以乙醚提取，乙醚提取物经聚酰胺薄膜检查(氯仿—甲醇，3：1)主要有两点。因此，模仿聚酰胺薄膜的层析条件,用聚酰胺粉进行干柱制备分离。方法如下： ，

取聚酰胺粉(60一120目)110克，装入周长l0厘米的聚乙烯薄膜柱中(操作见柱的制备)。取样品5克以丙酮溶解，拌入10克聚酰胺粉中，减压抽干，磨细，装于柱顶，全柱长50厘米。然后以

224

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氯仿—甲醇(3：1)展层至柱底。全柱有两个主要的黄色层带，一个在离柱底17~21厘米区段(带Ⅰ)，另一个在离柱底27~34厘米区段（带Ⅱ)。切取这两个层带，分别以乙醇洗脱。带I洗脱物以甲醉—水结晶，得黄色针晶，熔点为294~296℃，经鉴定为染料木尝(Genistein)。带Ⅱ洗脱物以氯仿—丙酮结晶两次，得黄色细针晶，熔点为274~276℃，经鉴定为山柰素(Kaempferol)。 225

三、填 充 剂

3．化学键合相

为了解决液液分配层析机械涂复填充剂的缺点，发展出化学键合相填充剂，化学键合相填充剂即是将各种不同极性的有机化合物，以化学键合的方式结到担体表面上。化学键合的形式有二种，单分子键合和聚合键合。如Durapak，它是由Porasil作担体，与各种醇如氰乙醇、聚乙二醇酯化形成Si—O—C型硅酸酯，这类填充剂因Si—O—C键容易断裂，对热和水解较不稳定，一般只能适用于极性小的溶剂(如烷烃、或氯仿／烷烃)作移动相。适宜于分离极性强的样品。

聚合键合填充剂是由氯硅烷与硅胶表面羟基作用，并聚合形成交联网状结构。如Permephase ODS，是将十八烷基三氯硅烷化学键合于Zipax担体上，在硅胶表面上形成了Si—O—Si—C键的交联聚合网状结构。它适用于分离极性小的样品，用强极性的移动相 (水、醇)作反相层析。对于极性大的样品，可以应用脂肪醚聚合键合填充剂（Permaphase ETH）和氰乙基聚合键合填充剂(Permaphase Nitrile)，这类填充剂具有很好的耐热性和化学稳定性，可以适用于各种不同极性的溶液作正、反相层析。目前还可将各种不同极性的有机化合物键合到全多孔微粒硅胶上制成各种不同选择性的填充剂，如Vydac TP类型和国产YWG—CH等即属此种。

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化学键合填充剂虽有很多优点，但它在分离效能上要比机械涂复的填充剂差一倍左右。有关化学键合相填充剂的层析机理，目前还有所争论，一般认为单分子键合的填充剂是以吸附作用为主，聚合键合的填充剂则以分配作用为主。表17—3为几种常用的化学键合相填充剂。

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1、积金遗于子孙，子孙未必能守；积书于子孙，子孙未必能读。不如积阴德于冥冥之中，此乃万世传家之宝训也。

2、积德为产业，强胜于美宅良田。

3、能付出爱心就是福，能消除烦恼就是慧。

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