不同方法检测鼠疫动物脏器的研究

中国地方病防治杂志２ＯＯ２年第ｌ７卷第１期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｔｒ［　ｄ…Ｄｉ　Ｖｏ【１７　Ｎ０　１　２１３０２　【实验研究】　不同方法检测鼠疫动物脏器的研究　张洪英，吴明寿，郭英，张丽云，董兴齐　【摘要】应用双重式聚台酶反应（Ｐｌａ—Ｆ１一ＰＣＲ）、常规细菌培养和反相血凝试验（ＰＪＨＡ），对９只实验感染鼠疫的动　物脏器（豚鼠６份，小白鼠３份），在４℃条件下保存不同时间后进行同步榆测。结果表明，保存９０ｄ和１８０ｄ后，ＰＣＲ与Ｒ１－　ＨＡ均为阳性，而细菌培养阳性率明显降低，ＰＣＲ和ＲＩＨＡ法敏感陛高于常规培养　提示对鼠疫或疑似鼠疫材料的检测陈　常规培养外应做ＰＣＲ和Ｒｌ｜ｎ，以防漏诊。　【关键词】鼠疫　动物脏器；ＰＣＲ；ＲＲＬ４．；培养　中图分类号：Ｒ　５１６．８　文献标识码：Ａ　文章编号：１Ｃ０１—１８８９（２００２）０１—００２．７—０２　Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｋｓ血　ｐｌａｇｕｅｉｎ　ｒａｔｓ廿ｓｓｕ　ＺＩ－ｋ４，ＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｙｉｎｇ，ＷＵ　Ｍｉｌ１ｇ—ｓｈｏｕ，Ｇｕｏ　Ｙｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ　ｆ　Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＥＶｉｄｅｒｎｉｃ　ｋｅ螂ｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＤａＥ，Ｙｕ删ｎｎ　６７１０００，Ｃｈ／阳）　【Ａｌ￣ｔｒａｅｔ】Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｐｆｉｆｌＢＸ￣（ｐｌａ—Ｆ１）ｐｃＲ，ｂａｃｔｅｒｉａ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄｔｈｅ　Ｌｒｔｄｉｃｃｔ　ｈｅａｍｇｇｌｕｔｉｎａｆｉｏｎｔｅｓｔ（ＲＩ—　）ｗｅ　￣ｐｈｅｄｉｎ９　ｎｍｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｏｆｐｌａｇｕｅ（６　ｇ　∞。ｐｉｇｓ．３　ｓｍａｌｌ￣ｈｉｔｅｔａｔｓｊｆｏｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｔｉｍｅｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ　ａｌｌ　ｓａｍｎｌｅｓ　ｗｅｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｒｌ｜ｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｓｅＢ＇ｉｎｇ　９０　ａｎｄ　１８０　ｄａｙｓ　ｕｎｄｅｒ　４　．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｉｔｖｅ　ｒａｔｅ，ｏｆ　ｔｈｅ　ｈａｃｔｅ—　ｒｉａ　１１１１￣ｐｅｅｔ　ｐｌ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　Ｔｈｅ　ＰｃＲ　ａｎｄ　ＲＩＦＬｅ，ｍｅｔｈｏｄｓ［１ｌｏｒ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｙ　ｔｈａｎ　ｏｖｗｔｈ　Ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎ，ｗｔ　ｎ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　ｐｌ￣ｕｅ　０ｒ　ｓｕｓ—　，ｃ　ａｒ－ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＩＩＤ，ｍｅｔｈｏｄｓ　ｂｅｓｉｄｅｓ　ｈ　ｔｈｅ　ｇｒｍＣｄｌ　ｔｏ　ａｖｏｉｄ　ｔｈｅ　ｄｉａ￣ｏｓｆｉｅｓ　ｍｉｓｔａｋｅ　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｐｌａｇｕｅ；Ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ；ＰＣＲ；Ｒ１ＨＡ；Ｇｒｏｗｔｈ　近年来，随着分子生物学的飞速发展，聚合酶链反　应（ＰＣＲ）以其高度特异和敏感的特点，被广泛应用于　微生物学领域。同时也应用于鼠疫的快速诊断和科学　研究。本文应用双重式ＰＣＲ检验技术与常规方法对　上海生工合成供给。　１．４双重式ＰＣＲ　于２５　ｌ反应液中含有２．５　１０×缓冲液、４×　ｄＮＴＰ　２　（华美生物工程公司提供）和Ｐｌａ—ｌ、Ｐｌａ一２、　ＦＩ—ｌ、ＦＩ一２引物各１　，加人５　模板，煮沸８ｔ￣ｌｉｎ，冰　凉ｌ　ｍｉｎ，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心Ｏ．５　ｒａｉｎ，加人Ｏ．５｛　ｌ（１．５　鼠疫感染动物阳性脏器进行ｆ　４℃条件下不同保存时　间的检测。　１材料与方法　１．１　鼠疫感染动物脏器的制备与保存　用镇源６５号家鼠鼠疫强毒株攻击豚鼠６只（ＴＩ～　Ｕ）Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（３　Ｕ／ＩＡ），补无ＤＮＡ水至２５　ｌ，再　加消毒液体石蜡油１滴，覆盖液面，置Ⅲ一１６０型基因　扩增仪（美国基因公司）上：按９４℃１　ｒａｉｎ，５２℃ｌ　ｍｉｎ，　７，℃ｍｉｎ，循环３ｏ次，７２℃延伸５　ｍｉｎ。　１　５　ＰＣＲ扩增产物分析　Ｔ６），小白鼠３只（Ｂ１　Ｉ３３），鼠死剖检，取肝脾组织　置４℃冰箱保存，间隔不同时间（１～３　ｄ、９０　ｄ、１８０　ｄ）　对每份材料进行常规细菌培养及ＲＩＨＡ试验，同时自　脏器悬液中用移液器吸出１００　ｌ移人１．５ｍｌ微量离心　管中待进行ＰＣＲ实验。　１．２模板制备　取８　扩增产物，经１．Ｏ％琼脂糖凝胶（含５　ｍｇ／ｌ　溴化乙锭）电泳（４　ｖ／ｅｒａ）３０～４５　ｍｉｎ，以ＰＣＲ—Ｍａｒｋｅｒ　为标准分子量，用全自动凝胶成像仪观察并照相。　１．６细菌培养和ＲＩＨＡ试验　按文献［２］方法进行。　２结果　采用煮沸法，将上述１００　脏器悬液的微量离心　管，煮沸１５　ｍｉｎ，离心１０　ｍｉｎ（１２　０００　ｒ／ｒａｉｎ），上清液即　为ＰＣＲ待扩增模板，置一２Ｏ℃冰箱保存备用。　１．３引物　研究结果表明，ＰＣＲ与ＲＩＨＡ阳性率１～１　８Ｏ　ｄ内　均为１００％，细菌培养阳性率较低，且随着时间的推移　有逐渐下降的趋势，见表ｌ。　３结论　从上述结果可以看出，无论１～３　ｄ、或４　０ｃ下保存　按文献［１］报道选择引物Ｐｌａ和Ｆ１基因片段，由　基盘项吕：云南省应用基础研究项目资助课题（９８Ｃ１１０Ｍ　作者单位：云南省流｛　病防治研究所（太理６７１０００｝　作者简舟：张洪英０９６４一）．女，副主任医师．学士。　维普资讯 http://www.cqvip.com

匿地方病踌精杂志２Ｏ０２年第１７　９０　ｄ、１８０　ｄ的材料，ＰＥＲ检测阳性率与ＲＩＨＡ试验　测约２．５万个菌／ｍｌ　，但此方法的应用有一定的局限　性，对那些缺乏ＦＩ抗原的菌株，会出现ＲＩＨＡ试验阴性　而漏诊。ＰＣＲ是最新的分子生物学检测手段，它从分　致，均为１００％，而传统的细菌培养方法明显地较二者　表１不同方法检测鼠疫动物脏器结果　子水平对鼠疫菌特异的核苷酸片段进行体外扩增，尤　其可使用多重引物进行检测，这对缺失某种特殊毒力　因子的鼠疫菌的检测提高ｒ检出率，高度特异敏感是　该方法的优点，可检菌达ｌＯ个ｃｆｕ［３　Ｊ，其敏感性是ＲＩ—　ＨＡ试验的２　５ＯＯ倍，全部试验３～４　ｈ完成，能达到快　速诊断的目的。保存１８０　ｄ后，阳性率仍高达１００％，　不受保存时问的影响，建议有条件的地方可开展此项　工作。综上所述，笔者认为对疑似鼠疫材料的检测除　采用常规细菌培养外、还应开展ＲＩＩ－Ｌ￣ｔ试验和ＰＣＲ实　验，可达到简便、快速的目的，同时也防止漏掉阳性材　低，且随着保存时间的延长，检菌阳性率有逐渐下降的　趋势，其原因一方面可能是脏器在４℃冰箱保存的过　料的检出　参考文献　［１］吴明寿，张丽云，张洪英用双重式聚合酶链反应技术检　测鼠疫菌的实验研究［Ｊ］．中国媒舟生物学及控制杂志，　１９９９，１０（１）：５５　程中，逐渐从新鲜变成，致使鼠疫菌被其他杂菌所　抑制，导致培养阳性率降低；另一方面随着时问的推　移，鼠疫菌逐步死亡，活菌数减少，致使培养阳性率降　低，但保存１８０　ｄ后仍有４４　４％的细菌培养阳性率，可　以问接证明鼠疫脏器在４℃低温条件下保存有效，对　现场检验条件较差的地方，或将材料保存于４℃冰箱　一［２］纪树立鼠疫［Ｍ］．人民卫生出版社，１９８８，２９８．　［３　张景林，李宏伟，王洪喜．鼠疫菌ＰＣＲ检测方法的研究　［Ｊ］中国地方病防治杂志，１９９５，１０（１）：ｌ７　（收稿日期：２００１—０９—２６）　段时问，不影响鼠疫菌的分离　传统培养方法具有分离纯鼠疫菌的优点，是诊断　鼠疫最强有力的依据。ＲＩＩ￣４．试验是目前应用最广泛　的鼠疫诊断方法之一，其特异、敏感、简便、快速，可检　（编辑宝建喜）　海尔福口服液对砷中毒小鼠免疫功能的影响　韦启后，覃淑云，张树臻，覃志坚　【摘要】　目的观察砷中毒对小鼠免疫功能的影响及海尔福口服液对砷中毒小鼠的免疫功能作用。方法建立砷　中毒小鼠模型，并用海尔福口服液对砷中毒小鼠进行治疗，检测砷中毒组、砷中毒海尔福口服醯治疗组、正常小鼠组的补　体ｃ３成份、ＩｇＧ、Ｉ　Ｉ含量等免疫指标。结果到治疗砷中毒的作用。　砷中毒小鼠免疫功能各指标显著低于正常组和治疗组（Ｐ＜０　０５）；砷中毒　海尔福口服醯能提高小鼠免疫功能以达　海尔福口服液治疗组与正常对照组免疫功能指标无差异性（Ｐ＞０　０５）。结论【关键词】海尔福Ｅｌ服液；砷中毒；免疫功能；治疗　中图分类号：Ｏ　６１３．６３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１—１８８９（２００２）０１—００２８—０２　砷作为一种微量元素，其毒性已被人们所认识，而　砷化物被广泛应用于工业、农业、医学等领域，其对环　境的污染问题也已引起人们的格外关注。许多学者在　砷对生长发育、血、尿系列化指标、心脏、肝脏、肾脏等　的影响方面做了大量研究工作［’，　。而目前对砷中毒　作者单位：右江民旗医学院（广西日色５３３０（］０）　的药物治疗、预防还缺乏有效的措施。为此，从免疫功　能人手，研究了砷中毒后小鼠免疫功能的变化及海尔　福口服液对砷中毒的治疗作用。　１材料与方法　１．１试剂及口服液　亚砷酸钠，国产分析纯。朴体Ｃ３、　等试剂盒