Ｓ４ 中国抗生素杂志２０１２年３月第３７卷第３期 文章编号：１００１—８６８９（２０１２）０３—００Ｓ４—０４ 罗红霉素对ＢＡＬＢ／ｃｄ￣鼠肠道菌群的影响 李新莉 吴大畅 张翠丽 刘建均辛毅 ｆ大连医科大学生物技术系，大连１１６０４４） 摘要：目的 应用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术评价罗红霉素对ＢＡＬＢ／ｃｄ￣鼠肠道菌群的影响。方法 选用ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃｄ￣鼠，按 ５ｍｇ／０．１ｋｇ每天灌服水溶性罗红霉素１Ｏｄ，停药７ｄ。分别在实验的０ｄ、３ｄ、１０ｄ以及停药７ｄ收取每只小鼠粪便，提取基因组 ＤＮＡ，应用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ（聚合酶链式反应——变性梯度凝胶电泳）技术获得肠道菌群分子指纹图谱，进行相似性、多样性分析及 优势条带的序列分析。结果ＰＣＲ．ＤＧＧＥ可明确将实验０ｄ、３ｄ、１０ｄ以及停药７ｄ小鼠分为４个簇，且灌服罗红霉素的小鼠肠道 菌群结构多样性明显减少，序列分析表明灌药前后小鼠粪便标本中的拟杆菌和丁酸梭菌分别为优势菌型。结论 罗红霉素对 ＢＡＬＢ／ｃｔＪ￣鼠肠道菌群有显著影响。 关键词：罗红霉素；ＰＣＲ．ＤＧＧＥ；肠道菌群 中图分类号：Ｒ９７８．１ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ Ｌｉ Ｘｉｎ—ｌｉ，Ｗｕ Ｄａ—ｃｈａｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｃｕｉ—ｌｉ，Ｌｉｕ Ｊｉａｎ－ｊｕｎ ａｎｄ Ｘｉｎ Ｙｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ０ｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ １ １ ６０４４） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｅｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ，ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｗａｓ ｇｉｖｅｎ ｔｏ ｍｉｃｅ ， ａｔ ５ｍｇ／０．１ｋｇ Ｏｆ ｂＯｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｔｅｎ ｄａｙｓ，ａｎｄ ｓｔｏｐｐｉｎｇ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ７ｄａｙｓ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｆｅｃｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｔ ０ｄ，３ｄ，１０ｄａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ７ｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｆｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｆｅｃｅｓ．ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｖ ＤＧＧＥ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ＰＣＲ．ＤＧＧＥ （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｍｏｎｇ ｆｏｕｒ ｐｅｒｉｏｄｓ ｂｖ ＰＣＲ．ＤＧＧＥ ｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙ，ａｎｄ ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｃｈｎｅｓｓ ｉｎ ｇｉｖｅｎ ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；ＰＣＲ．ＤＧＧＥ：Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ 罗红霉素（ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，Ｒｏｘ），化学名为９Ｅ一［０． ［（２．甲氧基乙氧基） 甲基］肟］红霉素［ 】，是新一代大 环内酯类抗生素，其体外抗菌活性类似于母体红霉 素，体内抗菌作用比红霉素强１～４倍，通过抑制细 菌蛋白质合成而发挥抗菌作用［ｚ】。临床证明，该药 口服吸收好，酸性条件下稳定，血浆结合率高，半 衰期长，对呼吸道感染、泌尿生殖道感染等效果显 著［３］，但其不良反应也不容忽视，Ｅ１前文献报道主 收稿日期：２０１１－０６．２４ 作者简介：李新莉，女，３１Ｅ￣１９８１年，博士，主要从事肠道微生物分子生态学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｘｉｎｌｉ１１２４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｍｘｉｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ 罗红霉素对ＢＡＬＢ／ｃｄ￣鼠肠道菌群的影响 李新莉等 要表现为药物性皮炎、肝损伤、胃肠道疾病等。本 研究将基于１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的ＰＣＲ—ＤＧＧＥ（聚合酶链 式反应——变性梯度凝胶电泳）技术应用到肠道微生 态学，对ＤＧＧＥ￣＇纹图谱，进行相似性、多样性分 酰胺凝胶，２５％～６５％［１００％变性梯度包含４０％（Ｖ／Ｖ）去 离子甲酰胺￣７ｍｏｌ／Ｌ尿素１变性梯度。电泳所用仪器 为Ｄ—Ｃｏｄｅ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ— Ｒｅｄ１，电泳温度为６０￣Ｃ，以２００Ｖ电压预电泳１０ｍｉｎ， ７０Ｖ电压电泳４ｈ。电泳完成后进行银染色【，］，采用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ．Ｒａｄ）软件进行相似性和多样性分析。 析以及优势条带的序列分析，旨在研究罗红霉素对 ＢＡＬＢ／＆］￣鼠肠道菌群的影响，为感染性疾病患者使 用罗红霉素提供参考。 １材料与方法 １．１实验动物 ＳＰＦ级、体重（２０ｉ２）ｇ的ＢＡＬＢ／ｃ雌性小鼠１０只（大 １．７ ＤＧＧＥ图谱中部分优势条带的序列分析 切下ＤＧＧＥ图谱中清晰且亮度高的优势条带，加 ／￣，２０ｇＬ无菌水、捣碎，４℃过夜、９０＂Ｃ浸泡１０ｍｉｎ， 取上清液做模板进行ＰＣＲ扩增，引物为去掉“ＧＣ 连医科大学实验动物中心提供１。 夹”的３４１ Ｄ５１８ｒ，ＰＣＲ反应体系和条件同１．５。ＰＣＲ 产物由宝生物工程（大连）有限公司测序，所得序列在 １．２罗红霉素溶液制备 按人鼠给药剂量换算公式【４］，将罗红霉素片（北 京康蒂尼药业有限公司）溶于无菌水，制成５ｍｇ／ｍＬ的 罗红霉素溶液。 ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行Ｂｌａｓｔ对比分析。 ２结果 ２．１ 不同给药周期小鼠肠道菌群ＤＧＧＥ图谱分析 灌服罗红霉素前、给药后３ｄ、１０ｄ以及停药７ｄ的 小鼠肠道菌群的ＤＧＧＥ图谱显示，其条带的数量和强 １．３标本采集 按５ｍｇ／０．１ ｋｇ，每天灌服水溶性罗红霉素， Ｏ．２ｍＬ／次／ｄ，灌服１０ｄ后停药，自然恢复７ｄ。分别在 实验的０ｄ、３ｄ、１０ｄ以及停药后７ｄ收取每只小鼠粪 便，于一８０℃保存备用。 度在每组样本泳道中呈现不同（图１）。 由图１可知，给药前和停药７ｄ的小鼠肠道菌群在 种类上和数量上有相似之处，而给药后的小鼠肠道 菌群的种类和数量明显减少，特别是菌Ａ在给药３ｄ后 几乎消失，菌Ｂ在给药前后变化不大。 １．４粪便细菌基因组ＤＮＡ提取 采用Ｅ．ｚ．Ｎ．Ａ⑧Ｓｔｏｏｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ），抽提粪 便细菌基因组ＤＮＡ，于一２０℃保存备用。 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ分析软件对其结果进行ＵＰＧＭＡ相 似性聚类分析ｆ图２和图３）。 由图２和图３可知，不同给药周期小鼠各聚成一 簇，表明给药周期相同的小鼠个体之间差异性很 小，给药前和停药７ｄ的小鼠肠道菌群结构相似，给 药３ｄ和给药１Ｏｄ的小鼠肠道菌群结构相似，但上述两 者之间存在显著差异。 １．５ ＰＣＲ扩增 细菌微生物区系的变化使用１６Ｓ ｒＲＮＡ基因Ｖ３可 变区作为靶标进行扩增。根据参考序列ｆ５］设计引物如 下：ＧＣ一３４１ｆ（５’ ＣＧＧＧＧＧＣＡＣ ＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ、 （引物５’端粗体部分为４０ｂｐ“ＧＣ夹”）和５ １ ８ｒ（５’一 ＡＴｒＡＣＣＧＣＧＣ￣ＴＧＣＴＧＧ），引物由宝生物工程ｆ大连）有 限公司合成。扩增体系（２５ｇＬ）为：ｌＯｘＥｘＴａｑ ｂ咖 ｐｌｕｓ）２．５ｇＬ，ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４ｇＬ，ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）２．５ｇＬ， ２．２ ＤＧＧＥ图谱中主要优势条带的序列分析 ２０￣ｔｍｏｌ／Ｌ的上下游引物各０．５ｇＬ，５Ｕ／ｇＬ ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚 合酶０．２５ｇＬ（ＴａＫａＲａ），３ ￣，ＤＮＡ作为模板，去离子 无菌水补充体系至２５ｇＬ。ＰＣＲ反应条件：预变性９４￣Ｃ ５ｍｉｎｉ变性９４℃３０ｓ，退火５４℃３０ｓ，延伸７２℃３０ｓ， ３０个循环；最终延伸７２℃７ｍｉｎ，４＂Ｃ保存。取５１ａＬＰＣＲ 产物用１％琼脂糖凝胶（含ＥＢ ０．５ｇ／ｍＬ）电泳检测后置 于一２０℃保存备用。 １．６ ＤＧＧＥ电泳及染色 参，￣，，Ｍｕｙｚｅｒｔ ］等方法，对１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的Ｖ３可 １￣２组：给药Ｏｄ组：３￣４组：给药３ｄ组；５～６：给药ｌＯｄ组；７￣８组：停 药７ｄ组 Ａ啼Ｂ 图１不同给药周期小鼠肠道菌群ＤＧＧＥ图谱 Ｆｉｇ．１ ＤＧＧＥ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ 变区的扩增产物进行ＤＧＧＥ分析。ＤＧＧＥ采用８％丙烯 Ｓ６ 中国抗生素杂志２０１２年３月第３７卷第３期 通过对ＤＧＧＥ图谱中的主要优势条带进行序列分 析，所得测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中用Ｂｌａｓｔ进行 检索和同源性比较，对比结果如表１所示。 由表１可知，菌Ａ与拟杆菌属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）的相似 性为９６％，菌Ｂ与丁酸梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）的 相似性为９７％。对于同样灌服罗红霉素的不同周期 的粪便标本，其优势菌型也有变化，给药Ｏｄ￣ｔｌ停药 ７ｄ的粪便标本中拟杆菌属是优势菌型，给药３ｄ和给 药１０ｄ的粪便标本中丁酸梭菌成为优势菌型，拟杆菌 减少直至消失。 ３讨论 抗生素是临床治疗感染性疾病的主要药物，但 长期大量使用抗生素治疗的患者，会导致肠道微生 态失调，造成临床伴发性腹泻，引起二重感染症 状，给治疗带来困难。 罗红霉素在临床治疗感染性疾病上应用较为广 泛，但不良反应也不容忽视。本研究根据ＤＧＧＥ能分 离长度相同而序列不同的ＤＮＡ的原理，每一个条带 大致与小鼠肠道中的优势菌群相对应，条带越多说 明菌群多样性越丰富，染色后条带的强度强则说明 该细菌的数量越多，从而反映小鼠肠道菌群的种类 和数量，针对使用罗红霉素时常出现腹痛、腹泻、 便秘等不良反应，研究其对ＢＡＬＢ／ｃ，＇Ｊ＂鼠肠道菌群的 影响，使用基于１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的ＰＣＲ ＤＧＧＥ［８，９］技 术，分析灌服罗红霉素不同周期的小鼠肠道菌群结 构的相似性和多样性，进一步对优势条带序列加以 鉴定，推断对于同样灌服罗红霉素的不同周期的粪 便标本，其优势菌型的改变是引起罗红霉素导致肠 道不良反应的主要因素。 拟杆菌具有益生作用，很多学者从不同方面进 行了大量的研究，它在帮助宿主分解多糖提高营养 利用率［加】、加快肠粘膜的血管形成［１１】、维持肠道微 生态平衡［１２。 】等方面均有重要作用。由此可推测，灌 服罗红霉素导致小鼠肠道拟杆菌消失是罗红霉素引 起肠道不良反应的主要因素。 丁酸梭菌是革兰阳性厌氧芽孢菌，其芽孢对外 界不利因素的抵抗力较强，对多种抗生素有较强的 表１ ＤＧＧＥ优势条带对应的细菌１６Ｓ ｒＤＮＡＶ３区测序结果及其与ＧｅｎＢａｎｋ＠参与序列的相似性 Ｔａｂ．１ Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＶ３ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｘｃｉｓｅｄ ｒｏｍ ｆＤＧＧＥ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｔｉｔｙ 罗红霉素对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠肠道菌群的影响 李新莉等 Ｓ７ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ［８］ ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ Ｌ，Ｌａｗｅｓ Ｊ，Ｂｅｌｌ耐药性，．能够促进肠道有益菌群的增殖和发育，抑制 肠道有害菌和菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群 紊乱，减少肠毒素的发生。其生态制剂临床上能够 治疗病原菌所致腹泻【１４】、肠道易激综合征腹泻［ｔｓ】以 Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎ）ｗｅｎｙｏｎｉｉ ｂｙ １ ６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，１ １ ７（２—４）：２９２—２９６． —Ｓｏｕｎｄ Ｗ Ａ，Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ 【９】 Ａｐｏｓｔｏｌｏｖ Ｅ，ＡＩｐｙｌｏｒｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ 及抗生素相关腹泻［１６】等。本研究中，灌服罗红霉素 不同周期的小鼠肠道丁酸梭菌变化不大，因此停药 后，由于其对有益菌的刺激，菌群失调症状可以自 然恢复，此结果与以往研究［Ｉ７。ｓ１一致。 本研究表明，罗红霉素抑制甚至杀灭了肠道中 ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ】．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００５，４０（１）：９６—１０２． 的拟杆菌，导致肠道菌群失调，停药后，由于丁酸 梭菌的刺激，失调症状可自然恢复，因此使用罗红 霉素时应尽量缩短疗程，也可以改变给药途径来减 少它对肠道的副作用。 参考文献 ［１】 宋晴．论罗红霉素少见的不良反应［Ｊ］．黑龙江医药，２００８， ２１（６）：９２—９２． 【２】 何东．罗红霉素的不良反应［Ｊ］．抗感染药学，２００５，２（２）： ９５．９５． ［３】 孙宏，徐秀梅，邢开宇，等．罗红霉素不良反应分析［Ｊ］．中 国医药指南，２０１１，９（１１）：３２—３２． 【４］ 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