第一节蛋白质的提取和分离
一、蛋白质分离提纯技术
常用的蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。
二、电泳技术分离蛋白质的原理
1．蛋白质中含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。
2．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。
3．蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，移动越快。
三、结果分析
不同蛋白质的混合溶液经过同一电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹，每种带纹可能就是一种蛋白质。
四、“血清蛋白的提取和分离”活动程序
1．点样：取新制血清5微升、质量浓度为0.4克/毫升的蔗糖溶液和质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混匀后，用微量加样器吸取5 μL样品加到电泳样品槽的胶面上。
2．电泳。
3．染色：用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色。
4．脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液对凝胶板进行浸泡漂洗，至底色脱净。
5．制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3 h～4 h后，放在两层透气的玻璃纸中间自然干燥。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中 问题1 问题2 问题3 问题4
一、蛋白质分离提纯的方法
1．蛋白质分离的基本过程
破碎细胞―→抽提(粗制品)―→纯化蛋白质
2．破碎细胞的方法
在分离与纯化蛋白质之前，必须采用适当的方法使蛋白质呈溶解状态释放出来：通常先将生物组织进行机械破碎，再根据细胞的特点，选择不同的破碎细胞方法(常用的有研磨法、超声波法、酶解法)。
3．抽提
细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，再根据蛋白质的不同性质，选择不同的溶剂进行抽提。
4．纯化
(1)原理：纯化主要是指根据蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度大小、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在的差异进行的。
(2)方法：①透析法——分子大小
②离心沉淀法——分子大小、密度大小
③电泳——所带电荷多少
二、“血清蛋白质的分离”实验中应注意的问题
1．由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。
2.将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝R250染色液中染色30 min后，多次更换脱色液至背景清晰。脱色后，可将凝胶浸于保存液中，长期封装在塑料袋内使其不会降低染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
如图为某些氨基酸在pH为6时进行电泳的结果，请回答：
(1)由图示可知，带正电荷的氨基酸是________，带负电荷的氨基酸是________。请说明理由_____________________________________。
(2)假设谷氨酸和赖氨酸所带电荷数相同，它们到达两极的速度一样吗？为什么？
(3)若把氨基酸换成蛋白质，会出现什么现象？
【审题导析】 解答此题应准确把握以下几点：(1)氨基酸的带电情况，(2)影响电泳速度的因素，(3)可用电泳法分离的物质。
【精讲精析】 氨基酸是一种两性电解质，在一定pH条件下带电荷，作为带电粒子，氨基酸向与其自身所带电荷相反的电极运动，即向正极运动的氨基酸带负电荷，向负极运动的氨基酸带正电荷，在原点不动的氨基酸，所带正电荷和负电荷相等。蛋白质也是一种两性电解质。
【答案】 (1)赖氨酸 谷氨酸 氨基酸是一种两性电解质，在一定pH条件下带电荷，作为带电粒子，在进行电泳时氨基酸向与其自身所带电荷相反的电极方向运动
(2)不一样。进行电泳时，若氨基酸带相同的电荷数，分子量越小，则移动越快。两者分子量不相等，因此，到达两极的速度不同。
(3)蛋白质同氨基酸一样，在一定pH条件下带电荷，也会向与其自身所带电荷相反的电极方向运动。
在电场作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。许多重要的生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸等都具有可解离基团，都能够对其利用电泳技术分离、鉴定和提纯。
根据血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图判断，所带负电荷最少的球蛋白是( )
A．α1－球蛋白 B．α2－球蛋白
C．β－球蛋白 D．γ－球蛋白
【解析】 根据电泳的原理进行分析。带电粒子在电场中向与其电性相反的电极泳动的现象称为电泳。因此，移动越快的，所带负电荷就越多(点样是在负极)，移动越慢的，所带负电荷就越少。所以γ－球蛋白所带负电荷最少。
【答案】 D
1．关于电泳，下列叙述不正确的是( )
A．蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快
B．蛋白质所带的电荷数越少，移动得越快
C．电荷数相同时，分子量越大，移动越慢
D．电荷数相同时，分子量越小，移动越快
【解析】 电泳时蛋白质移动的速度与所带电荷，蛋白质分子量大小有关，电荷越多、分子量越小、移动越快。
【答案】 B
2．下列有关电泳现象的叙述，错误的是( )
A．相同蛋白质的溶液，经过同一个电场电泳后，会在支持物凝胶上形成相同的带纹
B．不同蛋白质的混合溶液，经过同一个电场电泳后，在支持物凝胶上形成不同的带纹
C．每一种带纹可能就是一种蛋白质
D．每一种带纹一定不是一种蛋白质
【解析】 不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。不同的蛋白质可以在同一带纹中，同一种蛋白质一定存在于同一带纹中。
【答案】 D
3．关于血清蛋白的提取和分离过程中点样的叙述，正确的是( )
A．只用新制血清5 μL点样
B．只用质量浓度为0.4 g/mL的蔗糖溶液点样
C．只用质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂点样
D．用5 μL新制血清、质量浓度为0.4 g/mL的蔗糖溶液和质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混匀液点样
【解析】 用新制血清5 μL、质量浓度为0.4 g/mL的蔗糖溶液和质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混匀液点样。
【答案】 D
