干扰LYC-B基因番茄果实挥发性物质及主要品质性状

葚品科学

2016, Vol.37, No.21 195

干扰zrc-5基因番茄果实挥发性物质及

主要品质性状

吕洁，梁燕*赵菁菁，张静，吴浪，张颜，李云洲

(西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100)

摘要：构建含有番茄红素环化酶（lycopene ^-cyclase, LYC-B)基因中801 bp和301 bp两段保守序列的

RNA干扰植物表达载体，农杆菌果实注射法遗传转化紫色番茄果实，通过卡那霉素抗性筛选、聚合酶链式反应及 LTC-5基因表达量鉴定获得转基因植株，并对转基因植株成熟果实的挥发性物质及主要品质性状进行测定。结果表

明，干扰irc-5基因后番茄果实中检测到的挥发性物质主要为醇类、醛类、酮类、酯类和其他类。与野生型相比， 转基因植株中总挥发性物质种类增加了6种：醛类3种、酮类2种、酯类1种；醇类个数不变；其他类减少1种。 醛类物质相对含量不变，醇类物质相对含量减少，酮类、酯类和其他类相对含量增加。特征挥发性物质反-2-庚烯 醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水杨酸甲酯和2-异丁基噻唑等的相对含量增加。番茄红素的含量增加了16.78%，可溶性固 形物、抗坏血酸和总酸等含量增加，糸胡萝卜素和总糖含量变化显著。干扰LTC-5基因不仅影响了番茄果实的挥发 性物质，还增加了番茄红素、可溶性固形物、抗坏血酸、总酸等的含量。关键词：番茄红素；6-环化酶；挥发性物质；营养品质；RNA干扰；农杆菌果实注射

Down-Regulated Expression of LYC-B Gene by RNA Interference Regulates the Volatiles and

Main Quality Traits of Tomato Fruits

LU Jie, LIANG Yan*, ZHAO Jingjing, ZHANG Jing, WU Lang, ZHANG Yan, LI Yunzhou

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract: This work aimed to regulate the volatile components and major quality traits of tomato fruits by down-regulation of the expression of lycopene p-cyclase (LYC-B) gene using antisense RNA interference technique. Purple tomato fruits were transformed by injection of the plant expression vector containing two conserved sequences (801 and 301 bp, respectively) of LYC-B gene. The transgenic plants were obtained kanamycin resistance screening, polymerase chain reaction and quantification of LYC-B gene expression. The volatile substances and major quality traits of ripe tomato fruits were compared between the transgenic and wild-type (WT) plants. The results showed that alcohols, aldehydes, ketones, esters and other volatiles were detected in transgenic tomato fruits. Compared with the wild-type control, six new volatile compounds were identified from the transgenic fruits, consisting of three aldehydes, two ketones, and one ester, and one compound belonging to another chemical class was detected in the control rather than the transgenic fruits. In addition, the same relative content of aldehydes was observed between both fruits, but the transgenic fruits showed decreased relative content of alcohols and increased relative contents of ketones, esters and other compounds. The characteristic volatile compounds were also increased, such as (E) 2-heptenal, 6-methyl 5-hepten-2-one, methyl salicylate and 2-isobutylthiazole, and lycopene increase by 16.78% compared with the wild-type fruits. In addition, the contents of soluble solids, ascorbic acid and total acid were also increased. On the other hand, the contents of p-carotene and total sugar were identical to those of the WT fruits. Therefore, down-regulated expression of LYC-B gene by RNA interference can affect volatile substances and enhance the contents of lycopene, soluble solids, ascorbic acid and total acid, thereby improving the nutritional quality of tomato fruits.Key words: lycopene p-cyclase; volatile compounds; nutritional quality; RNA interference; Agrobacterium injection D0I:10.7506/spkx1002-6630-201621033

中图分类号：S1.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630 (2016) 21-0195-07

收稿日期：2016-01-31

基金项目：陕西省科技统筹创新计划项目（2011KTCL02-03);西北农林科技大学农业科技推广基金项目（TGZX2012-02);时胜科研基金项目作者简介：吕洁（1990—），女，硕士研宄生，研宄方向为番茄果实品质性状。E-mail: lvjielj@163.com *通信作者：梁燕（1963—），女，教授，博士，研宄方向为番茄遗传育种与蔬菜种质资源。E-mail: liangyan@nwsuaf.edu.cn

196 2016, Vol.37, No.21

引文格式：

葚品科学

※生物工程

吕洁，梁燕，赵菁菁，等.干扰基因番茄果实挥发性物质及主要品质性状[J].食品科学，2016, 37(21): 195-201. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621033. http://www.spkx.net.cn

LU Jie, LIANG Yan, ZHAO Jingjing, et al. Down-regulated expression of LYC-^B gene by RNA interference regulates the volatiles and main quality traits of tomato fruits[J]. Food Science, 2016, 37(21): 195-201. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621033. http://www.spkx.net.cn

樱桃番茄（Lycope厂s/coh 以cw/e如wrn Mill. var.

Alef)是茄科番茄属的一个变种，果实外形娇

性引物。P1F和P1R克隆61〜861 bp的LYC-B1片段，P2F 和P2R克隆480〜781 bp的LYC-B2片段，LYC-B1反向和

LYC-B2正向连接能形成发卡结构。该表达载体具有卡那霉

艳、可口美味、富含营养物质且风味多样，深受消费者 的青睐[1]。番茄果实中挥发性物质的组成和含量决定着番 茄果实的风味品质[2]，番茄红素的含量影响着番茄的营养 品质。类胡萝卜素代谢一方面为一些重要挥发性物质合成 提供前体物质，另一方面番茄红素是类胡萝卜素代谢的直 接产物，番茄红素6-环化酶（lycopene yS^yclase，LYC-B)基 因LYC-B是类胡萝卜素代谢中的关键酶基因[3]。徐加新' 吴江敏[5]等先后用反义LYC-B基因对大果鲜食番茄进行遗 传转化，在转基因后代中获得了番茄红素含量和可溶性 固形物含量均显著增加的材料，同时发现可溶性固形物 在不同世代及单株之间表现不稳定，有些株系固形物含 量比对照有所降低。这些结果表明干扰LYC-B基因可以影 响果实番茄红素和可溶性固形物的含量，而LYC-B基因对 于挥发性物质及其他品质性状的研究甚少。

紫色樱桃番茄具有极强的抗氧化性等营养保健功能， 受到人们的青睐，但其独特感官风味却不为多数人所接 受[6]。为此，采用病毒诱导技术，研究LYC-B基因沉默对 紫色果实挥发性物质和主要色素的影响，取得了预期的结 果[7]。为了得到稳定遗传的转基因植株，本实验拟使用含 有LYC-B基因RNA干扰表达载体的工程农杆菌，对紫色番 茄果实进行遗传转化。对转基因果实挥发性物质和主要色 素以及可溶性固形物、抗坏血酸、总糖和总酸含量等主要 品质性状进行测定，分析LYC-B基因对番茄品质性状的影 响，为番茄转基因育种和品质性状的研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料、菌株与试剂

紫色番茄材料为黑樱桃（保存单位编号：

CI5004)，由西北农林科技大学园艺学院番茄种质资源

素抗性基因，通过卡那霉素抗性对阳性植株进行筛选。

农杆菌GV3101、pBI121质粒，由西北农林科技大学园 艺学院番茄种质资源课题组提供；内切酶、连接酶立陶 宛Fermentas公司；pMD®18-T Vector、反转录试剂盒、实 时荧光定量试剂盒大连宝生物工程公司；番茄红素标 品（色谱纯） 1.2

北京中科仪友化工公司；MS培养基等

其他常规试剂均为国产分析纯。

仪器与设备

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR) 扩增仪、IQ5实时荧光定量PCR扩增仪 美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统 色谱仪

英国Syngene公司；电泳仪

北京君意东方电泳设备有限公司；LC-20A高效液相

日本岛津公司；ISQ气相色谱-质谱联用仪

美国Thermo Fisher

(Xcalibur1.2数据处理系统）

Scientific公司；HP-INNOWAX弹性石英毛细管柱

(60 mX0.25 mm，0.25 pm)、恒温磁力搅拌器 美国

Troemner公司；100pmPDMS固相微萃取头、SPME手

动进样手柄美国Supelco公司；匀浆机美的集团；

UV-3802型紫外分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限

公司；PAL-1数显糖度计上海上天精密仪器有限公司。1.3 1.3.1

方法

果实注射法RNA干扰LYC-B基因的遗传转化 参照Yasmeen等[9]方法对果实进行注射处理。塑料大棚内选取成熟度和大小均匀一致的坚熟期[10]番茄果实， 用1 mL注射器吸取含有LYC-B基因干扰载体的工程农杆 菌菌液，从果顶处垂直插入果实中轴缓缓注射菌液， 当菌液从萼片处溢出时停止注射。注射后的果实挂牌 标记，同时标记未注射菌液的坚熟期果实野生型（wild

type，WT)为对照。植株在大棚中正常栽培管理，待果

课题组提供。2015年3月底定植于园艺学院试验农场塑料 大棚内，当植株第3花序第1、2朵花开放时挂牌标记开花 日期。

RNA干扰LYC-B基因表达载体由王巧丽等[8]构建。

实进入完熟期时摘取果实收种后进行后续筛选实验。1.3.1.1

卡那霉素筛选鉴定

分别选取注射菌液种子和对照处理的番茄种子，消 毒灭菌后播种在含有100 mg/L卡那霉素的1/2 MS培养基 上进行筛选，每瓶放25粒种子。放置在人工气候箱内 28 °C黑暗培养3d，移至组培间，光周期为16 h光照和8 h

根据美国国家生物技术信息中心（National Center for

Biotechnology Information，NCBI)上登录的番茄红素

6-环化酶（登录号为X852.1)基因序列设计两对特异

※生物工程

葚品科学

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黑暗交替，25 °C培养。培养45 d后，将存活幼苗进行炼 苗，移至灭菌基质中[11]。1.3.1.2

PCR 鉴定

高效液相色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX弹 性石英毛细管柱（60 mX0.25 mm，0.25 pm)，进样口 250 C;升温程序为40 C保持2.5 min，10 °C/mm升至 110 C，然后以 3.0 °C/mm 升温至 180 C，15.0 °C/mm 升温 至230 °C维持3 min;载气（He)流速1.0 mL/min，不分 流进样。

质谱条件：电子轰击（electron ionization，EI)离子 源；电子能量70 eV;离子源温度250 C; SM离子扫描， 质量扫描范围为m/z 35〜500。

定性定量分析：果实挥发性物质分析结果运用计算 机检索并与图谱库（NIST 2011)标准质谱图对照，并结 合有关文献对物质进行匹配分析[15-17]，统计检测出的化合 物，按照化合物官能团对物质进行归类分析。运用峰面积 归一法，即各成分峰面积与总峰面积比进行定量分析™。 1.3.2.2 其他品质性状测定

参照文献[19]对其他品质性状进行测定。高效液相色谱 法测定番茄红素及6-胡萝卜素的含量[20]。PAL-1数显糖度 计测量可溶性固形物含量；钼蓝比色法测定抗坏血酸含 量；硫酸蒽酮比色法测定总糖含量；酸度计测定总酸含 量。以上指标测定3次重复。

1.4 数据分析

用Excel 2013软件进行数据处理；用Origin 9.0软件进 行作图；用SPSS 20.0统计分析软件进行显著性检验。2 2.1 2.1.1

结果与分析

农杆菌果实注射法RNA干扰LTC-5基因的遗传转化卡那霉素筛选鉴定

待幼苗长至四叶一心时，CTAB法提取叶片基因组

DNA，用含有L7C-5目的基因和载体序列的引物P4 (目

的片段大小为476 bp)进行PCR鉴定。PCR反应条件为 95 °C预变性5 mm; 95 °C变性 1 mm，57 °C退火 1 mm， 72 °C延伸1 min，30个循环；最后72 °C延伸10 min。

RNA干扰L7C-8基因表达载体质粒为阳性对照，WT植株 DNA作为阴性对照。PCR反应产物用质量浓度1 gA00 mL

琼脂糖凝胶电泳紫外下成像检测。

1.3.1.3 实时定量PCR鉴定

将PCR的阳性植株和WT植株移栽到西北农林科技 大学园艺学院试验农场塑料大棚内，管理条件相同。 果实成熟时用TRIZOL法提取果实的RNA，并反转录 为cDNA，以稀释后质量浓度为50〜60ng/pL的cDNA 为模板，利用实时定量-PCR进行L7C-8基因表达量分 析。实时定量-PCR反应体系为20^L: 2^L cDNA模 板，10 pL SYBR Premix Ex 7^ II，0.8 pL Forward Primer (10 ^mol/L)， 0.8 pL Reverse Primer (10 pmol/L)，

ddH2O补充至20 pL体系。反应程序为：95 C预变性

1 mm，并用3步法扩增40个循环（95 C变性10 s，55 C退 火10 s，72 C延伸20 s);之后是融解曲线的运行，从55 C 开始，每30 s增加0.5 C直至95 C，目的是检测扩增产物的 特异专一性。每个样品设3个技术重复，按照2_AAQ方法计算基因的相对表达量[12]。PCR引物序列见表1。

表1

Table 1

PCR引物序列

Primer sequences for PCR

基因

新霉素磷酸转移酶基因WPI

L7C-5 P4 片段q

引物序列（5^43。

TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC

GTCACCGACTTGAGCCATTTGGCCCTATGGTGTTTGGGTGGCAATTGCCCGGCTTTCTTGTGCTTCCTATGTATGACCCTTCACAATCTAACAAGTCCATAGCCTCA

GACAGGCGTTCAGGTAAGGCCAATGGAGGGTATTCAGC

非转化植株由于叶绿素合成受阻发生黄化，最终导 致细胞死亡，转化植株由于^7//基因的表达，具有卡 那霉素抗性可以存活下来。收获种子在卡那霉素培养基 上共播种261粒种子，在45 d时存活数为156株，存活率 达59.77%。炼苗5 d后，存活的幼苗锻炼后移栽到灭菌基 质中，共移出156株。待1周后，观察有52株成活，成活 率为33.33%。2.1.2

PCR 鉴定

LYC-B内参基因■EF/a

1.3.2 品质指标测定

鉴定出的转基因成熟果实用匀浆机打成匀浆，液氮

冷冻后保存在一 80 °C，用于后续品质测定。1.3.2.1

挥发性物质的测定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace

solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)联用技术测定番茄果

待移栽幼苗长至四叶一心时，提取DNA进行PCR验 证。由图1A可知，在检测的52株植株中，检测出1株阳 性植株，编号为乃-18。根据上文可知卡那霉素筛选时共 播种261粒种子，由此可推测出果实注射法得到阳性植株 的比率约为4%c。2.1.3

实时定量PCR鉴定

采取成熟时阳性和WT植株番茄果实（图1B)，实时 定量PCR检测Lrc-5基因的相对表达量。结果如图1C所 示，设定对照WT植株LTC-5基因的相对表达量为100%，

Tr18 L7C-5基因的相对表达量约降低了 50%。由此可

实挥发性物质。参照Viljanen[13]、常培培[14]等的方法。

样品制备：称取果肉匀浆约14 g，加入3 g NaCl， 于40 mL顶空瓶中。将顶空瓶置于50 C恒温磁力搅拌 器上，平衡10 min，顶空吸附40 min，进样口处解吸 3 mm，进行GC-MS分析。每个处理重复3次取平均值。

知，阳性植株Tr18中L7C-5基因的相对表达量显著低于

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续表2序号

化合物名称反-2-庚烯醛 2-heptenal, (£)■反-2-辛烯醛 2-octenal, E反-2,4■庚二烯醛 2,4-heptadienal, (E，£)-苯甲醛 benzaldehyde

匹保留时间/正

分子式min配度

ca2〇

※生物工程

对照。表明了通过果实注射农杆菌法对紫色番茄果实进 行遗传转化，成功获得了转基因植株。

A

反匹

配度

■量/%相对含Ti-18WT

5.33 ±0.051.02 ±0.033.22±0.061.78±0.040.59±0.060.28±0.050.91±0.021.15±0.030.37±0.020.04±0.01

--

15161718

10.954868

92138028314800875194694985088518098138672854854928869848818877819867824924933887830

916868

9359269169359148599199069569498871904852880884915879880931883954870617871925935922840

13.3

4.71C7H10O115.31wwwcmww

15.5117.6518.3819.3820.024.3211.31

w

500 bp

400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 50 bp

1920212223

2-壬烯醛 2-nonenal, (2)-反-2■癸烯醛 2-decenal, (£)■

2■羟基苯甲醛 benzaldehyde, 2-hydroxy-2■羟基苯甲醛—2,4-癸二烯醛 2,4-decadienal

酮类ketone

1.38±0.051.60±0.06

0.14±0.030.09±0.030.36±0.04

-

B

241-戊烯-3-酮 1-penten-3-onew256-甲基-5-庚烯-2-酮 5-hepten-2-one, 6-methyl-w26272829303132333435

Ti-18

WT

36

1-辛烯-3-酮 1-octen-3-ol

对羟基苯乙酮 acetophenone, 4'-hydroxy-

0.79±0.020.70±0.04

6.38±0.095.36±0.051.58±0.041.05±0.020.06±0.030.03±0.010.03±0.01-0.54±0.03-0.92±0.081.77 ±0.031.26±0.040.93±0.02

0.51±0.05-0.19±0.02-0.16±0.060.11±0.0310.14±0.077.14±0.060.63±0.03

-0.41±0.030.56±0.02

0.28±0.02-1.40±0.020.77 ±0.040.06±0.02-0.08±0.030.08±0.03

0.07±0.020.05±0.012.71±0.041.93±0.036.73±0.065.13±0.06-0.33±0.030.15±0.0291.7793.480.08±0.01

-

13.81w

C8H8O220.65wcmw

22.972.516.56

/5-紫罗酮 beta-ionone

酯类ester乙酸乙酯ethyl acetate烯丙基乙烯酯 1-propene, 3-(ethenyloxy)-二碳酸二叔丁酯 di-tert-butyl dicarbonate

.38C10H18O57

己酸甲酯 hexanoic acid, methyl ester.76CAA73-己烯酸甲酯 3-hexenoic acid, methyl esterCAA9.51

乙酸己酯 acetic acid, hexyl ester甲酸庚酯 formic aci4 heptyl ester水杨酸甲酯 methyl salicylate

其他类others

.77CM9

3.91CM1

c8h8o320.18

A.阳性植株PCR鉴定结果，M.DL500Marker;泳道1.阳性质

粒；泳道2.阴性对照WT;泳道3.阳性植株Ti-18; B.成熟阳 性和WT植株番茄果实对比结果，a.WT植株果实；b.阳性植 株Ti-18果实；C. RNA干扰果实中L7C-5基因表达分析结果。图1

农杆菌果实注射法RNA干扰zrc』基因的遗传转化

37水杨酸乙酯 benzoic acid, 2-hydroxy-, ethyl ester C9H10O3 20.7738

3940414243444547

二甲醚 dimethyl ether

2-乙基呋喃 furan, 2-ethyl-2-异丁基噻唑 2-isobutylthiazole

乙酸 acetic acid

丙基丙二酸 propanedioic acid, propyl-

Fig. 1 Antisense RNA interference of the lycopene ^-cyclase (LYC-B) gene by Agrobacterium injection method in tomato fruits

2.98

.24C6H8〇3

C7H11NS12.79

3.99cm1W9.59W410.84w〇321.5CAA2cmCM

21.7523.424.83

2-硝基苯酚 phenol, 2-nitro-己酸 hexanoic acid愈创木酚 phenol, 2-methoxy-

2.2 RNA干扰L7C-6基因对番茄果实挥发性物质的影响

表2

Table 2

RNA干扰LYCB基因番茄果实挥发性物质的相对含量 The relative contents of volatile compounds in transgenic

tomato fruits

4-己烯酸 4-hexenoic acid

辛酸 octanoic acid

合计

注：一.该物质未检测出。

反匹

配度

量/%相对含

序号化合物名称醇类 alcohol

匹保留时间/正

分子式min配度

T,-18WT如表2所示，Ti-18和WT果实共检测出正反匹配度大 于800的物质有47种，总挥发性物质均占色谱流出组分总 含量的90%以上。

2.2.1 RNA干扰L7C-5基因对番茄果实挥发性物质种类的影响

T「18果实检测出了40种挥发性物质，包括醇

1234

5671011121314

1•戊醇 1-pentanol

顺-2■戊烯-1■醇2-penten-1-ol，⑵-正己醇1-hexanol顺-3-己烯醇 3-hexen-1-ol环己醇 cyclohexanol

W

W

9.4511.02

9228512902

845906830814842931873802910934

9228712908

862916834887869944887957911935

3.83 ±0.046.08±0.06-1.60±0.04

7.70 ±0.0913.27±0.098.62±0.0811.09±0.07

0.44±0.050.95±0.050.32±0.030.34±0.030.12±0.020.50±0.03

--0.05±0.02

1.8CAP1

c^o12.48C^O12.C8H18O13.1615.83W

7.19C8H16〇18.16cm1W

22.05

M■辛醇 2-octanol肩-芳樟醇linalool反式-2■辛烯-1■醇 2-octen-1-ol, (E)-

类8种、醛类12种、酮类5种、酯类7种和其他类8种。

WT中检测到了35种挥发性物质，为醇类8种、醛类

3■呋喃甲醇3-fbr疆ethanol

苯甲醇 benzylalcohol酸 aldehyde

-0.31±0.010.63±0.03-2.56±0.04

9种、酮类3种、酯类6种和其他类9种。从表2结果可 以看出，1-18转基因果实中检测到的挥发性物质总种类 高于WT，醛类物质比WT多检测出了丁二醛、2-壬烯醛、 反-2-癸烯醛和2,4-癸二烯醛这4种醛类物质，2-甲基丁醛只 在WT中检测出；酮类多检测出对羟基苯乙酮和失紫罗酮 两种物质；酯类多检测出1种，醇类个数相同；其他类少

2■甲基丁醛 butanal, 2-methyl-丁二醛 succindialdehyde

己醛 hexanal反-2-己烯醛 2-hexenal, E

3.61W

3.63cmca2o5.48

c”

0.60±0.02-15.55±0.0819.23±0.086.63 ±0.055.48±0.07

8.57

※生物工程

葚品科学

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检测出1种。结果表明，沉默基因后，总体上增加 了果实中挥发性物质的种类，使果实风味多样化。2.2.2

RNA干扰LTC-5基因对番茄果实挥发性物质相对

20.99%、4.22 倍、19.03%、42.02%和81.8%，还检 测到了 WT对照中没有出现的厂紫罗酮，这些特征效 应化合物为果实提供了丰富的青香、花香和果香等香 气[22-24]。结果表明，1-18转基因果实中大部分特征效应 化合物含量的增加，丰富了果实的香味，提高了果实的 风味品质。2.3 影响

表4

RNA干扰iyC-B基因对番茄果实主要品质性状的影响Table 4

Quality traits in transgenic tomato fruits

Ti-18

WT

含量的影响

RNA干扰L7C-5基因对番茄果实主要品质性状的

品质指标

*.差异显著（户<0.05，Tukey检验）。

番茄红素含量/ (mg/100 g)胡萝卜素含量/ (mg/100 g)抗坏血酸含量/ (mg/100 g)

可溶性固形物含量/%

总糖含量/%总酸含量/%

6.62±0.75a1.29±0.3324.63 ±0.53a5.90±0.10a5.06±0.28a0.66±0.05a

5.67±0.53b1.30±0.3721.27±0.50b5.10±0.05b5.06±0.28a0.60±0.01b

图2 RNA干扰基因对番茄果实各类挥发性物质相对含量的影响

The relative contents of volatile compounds belonging to different chemical classes in transgenic tomato fruits

Fig. 2

由图2可知，Ti-18与WT中醇类和醛类为主要的挥发 性物质，酮类、酯类和其他类的相对含量较低。Ti-18与

WT相比，除醇类相对含量降低了 35.79%、醛类相对含量

注：同行上角标不同字母表示差异显著（P< 0.05, Tukey检验）

番茄红素、，胡萝卜素、可溶性固形物、抗坏血 酸、总糖和总酸等主要品质性状变化情况如表4所示。乙7C-5基因RNA干扰转基因植株T「18中，番茄红素的 含量为6.62 mg/100 g，比WT对照增加了 16.78%;失胡 萝卜素含量与WT间差异不显著；可溶性固形物含量 为5.90%，比WT对照增加了 15.69%;抗坏血酸含量为 24.63 mgA00 g，与WT对照相比增加了 15.8%。总糖含量 为5.06%，与WT对照差异不显著；总酸含量为0.66%，与

WT对照相比增加了10.0%。结果表明，

没有显著变化外，酮类相对含量增加了 24.16%，酯类相 对含量增加了39.33%，其他类相对含量增加了30.93%。 结果表明，RNA干扰L7C-5基因显著地降低了醇类物质 含量，增加了酮类、酯类和其他类物质的相对含量，对 果实挥发性物质的成分有一定影响。2.2.3 影响

表3

RNA干扰iyc』基因番茄果实主要特征香气成分及含量分析

Characteristic aroma compounds and contents in

transgenic tomato fruits

相对含量/%

序号

413141524252830

RNA干扰LTC-5基因对番茄果实主要特征香气的

基因表达

Table 3

受阻后，可以增加果实番茄红素、可溶性固形物、抗坏 血酸和总酸的含量，番茄果实类胡萝卜素代谢间接地影 响果实的营养品质。

化合物名称顺-3-己烯醇 3-hexen-1-ol

己醛 hexanal

反-2-己烯醛 2-hexenal，(£)-反-2-庚烯醛 2-heptenal,体)-1-戊烯-3-酮 1-penten-3-one

6-甲基-5-庚烯-2-酮 5-hepten-2-one，6-methyl-f-紫罗酮 beta-ionone

T「188.62±0.0815.55±0.086.63±0.055.33±0.050.79±0.026.38±0.090.03±0.0110.14±0.071.40±0.02

WT11.09±0.0719.23±0.085.48±0.071.02±0.030.70±0.045.36±0.05

-7.14±0.060.77±0.04

香气特征青香青草味清新气息青草香气刺鼻气味青香、花香特殊香味冬青特殊气味番茄香气

3 讨论

农杆菌果实注射遗传转化法是一种新的基因转化方

法，与传统的叶盘法遗传转化相比耗时少，操作简便[11]。

Yasmeen等[9]用此方法注射番茄果实，发现坚熟期的转化 效率比绿熟期高。本研究在坚熟期进行注射，收获种子 卡那霉素筛选鉴定，在45 d时幼苗存活率为59.77%，炼 苗后移栽幼苗到基质中，PCR鉴定阳性植株，实时定量

PCR测定阳性植株Tr18 L7C-5基因的相对表达量为WT对

水杨酸甲酯 methyl salicylate

2-异丁基噻哇 2-isobutylthiazole

番茄果实中有16种物质对风味的贡献较大，是番茄 独有的功能性关键挥发性物质，被称为“特征效应化合

物”，这些物质为番茄果实提供独特的香气[21]。在Tr18 转基因和WT果实中，共检测出了 9种特征效应化合物 (表3)。T「18转基因果实中，除了顺-3-己烯醇和己醛 的含量低于WT对照，1-戊烯-3-酮含量与WT差别不大 外，反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、 水杨酸甲酯和2-异丁基噻唑类物质的含量分别增加了

照的50% (图1C)，表明成功得到了 1株转基因植株。幼 苗移栽至基质中的成活率只有33.33%，这就造成了转化 的阳性率大大降低，因此为移栽幼苗创造适宜的温度、 湿度和光照条件是提高果实注射法阳性率的关键所在。番茄果实因其营养丰富、风味独特深受消费者喜

爱。本研究检测到的47种挥发性物质中，突变型植株 和WT植株共有物质有28种，挥发性物质种类影响了番

200 2016, Vol.37，No.21

葚品科学

※生物工程

法。转基因植株果实的挥发性物质及主要品质性状测定 结果表明，L7C-5基因表达量降低后，紫色番茄果实中 反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水杨酸甲酯和2-异 丁基噻唑等挥发性物质的相对含量增加，番茄红素、 可溶性固形物、抗坏血酸和总酸等含量增加，，胡萝 卜素和总糖含量变化不大。综上所述，irc-5基因表达 不仅影响番茄果实类胡萝卜素代谢，也影响果实 挥发性物质和其他品质指标的构成。番茄各个品质性 状间是密切联系的。参考文献：

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茄果实的风味品质。挥发性物质主要分为醇类、醛类、 酮类、酯类和其他类等物质，相对含量最多的物质是醇

类和醛类。A-18转基因果实中，醇类物质相对含量显 著下降，酮类、酯类和其他类物质的相对含量增加。在 衡量某种挥发性组分的作用时，除了考虑该物质的实际 含量浓度外，还要考虑该物质的阈值浓度，阈值浓度为 一种成分可以被嗅觉感知到的最低浓度。对数阈值单位 为待测物中某种成分的浓度和其阈值的比值，用来表示 芳香物质的实际作用效果，为正值时，表示对风味的 贡献较大，相反为负值时，贡献较小[21]。在番茄常见的 400种挥发性物质中，有16种物质的对数阈值单位大于 0, Baldwin等[10]认定它们为特征效应化合物。在检测到的 9种特征效应化合物中，Ti-18转基因果实中反-2-己烯醛、 反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水杨酸甲酯和2-异丁基 噻唑等物质的相对含量增加。反-2-庚烯醛的相对含量增加 最大，它与番茄甜味物质有关，呈现脂肪气味、青草香； 6-甲基-5-庚烯-2-酮为类胡萝卜素代谢途径中番茄红素的降 解产物[25]，当转基因果实中番茄红素的含量升高时，它的 释放量也增加。2-异丁基噻唑是较为重要的体现番茄特 征气味的化合物[22]，具有番茄香味、葡萄酒味。失紫罗 兰酮为萜类物质，是乃-18中检测到的特有物质，也是番 茄红素降解的产物，具有特殊香气[26-27]。其他一些挥发性 物质为番茄风味辅助香气物质[25]，这些物质相互作用， 构成番茄特有的风味。在乃-18转基因植株中挥发性物质 成分和含量发生了变化，影响了番茄果实的风味特性。

在番茄果实类胡萝卜素代谢中作用于番茄红 素，阻止其向下游转化为失胡萝卜素，促进果实番茄红 素的积累[27]。本研究中RNA干扰L7C-8基因后Tr18转基 因植株中番茄红素含量比WT对照增加了16.78%。这与 徐加新等[4]通过叶盘法遗传转化反义irc-5基因表达基 因果实番茄红素含量升高结果相同。吴江敏等[5]对反义

LTC-5转基因果实品质性状测定，发现除了番茄红素含量

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升高外，大多数后代可溶性固形物含量均升高了。本研 究对果实其他品质性状测定发现，LTC-5基因表达受阻后

T1-18转基因果实中，可溶性固形物、抗坏血酸和总酸的

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含量增加，表明果实的各个品质指标在一定程度上是有 关联的，但是各个性状间通过怎样的关系联结，具体原 因还需要深入研究。4

结论

利用农杆菌果实注射法，对紫色番茄果实进行L7C-5 基因RNA干扰的遗传转化，通过收获种子的卡那霉素 抗性筛选、PCR鉴定及实时定量检测L7C-8基因相对表 达量，鉴定出了1株转基因植株。通过果实注射法得到 转基因植株，为番茄遗传转化提供了一种有效快速的方

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