维普资讯 http://www.cqvip.com 工作研究 现代农业科技｝２００８年第４期 转基因植物中安全标记基因的研究进展 刘广金 姚晓林 蒋家平。张玉梅 （’安徽农业大学理学院，安徽合肥２３００３６； 安徽荃银禾丰种业有限公司） 摘要介绍了几种安全标记基因．包括６－磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因、绿色荧光蛋白基因、葡糖醛酸酶基因、甜菜碱醛脱 氢酶基因和谷氨酸一１一半醛转氨酶基因，分析了其应用范围和工作机理，认为可代替传统的抗性标记基因，实现植物转化无害化。 关键词转基因植物；选择标记；安全标记基因 中图分类号￥１８８ 文献标识码Ａ 文章编号 １００７—５７３９（２００８）０４—０２０８—０１ 标记基因在植物的遗传转化过程中用以区分转化和非 转化细胞．需与目的基因共同导入转化细胞，目前广泛应用 的标记基因为除草剂抗性标记基因和抗生素抗性标记基 因。随着转基因植物的商品化种植，人们担心：①抗生素抗 性基因转移到微生物中，使病原菌获得抗性，从而导致目前 临床使用的抗生素失效；②标记基因传播到野生亲缘种中， 使杂草获得这种抗性，变成现有除草剂无法杀灭的“超级杂 草”；③具有抗生素或除草剂抗性的标记基因的应用，会导 致生态平衡被破坏。目前通常采用回避或剔除策略来对待 标记基因的安全性问题。回避策略．即在转化阶段不使用标 记基因或采用安全标记基因筛选转基因植株；剔除策略是 先利用通常的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用 转基因植株后代遗传重组使选择标记与目的基因分离，或 利用位点特异性酶将标记基因切除而获得无选择标记的 转基因植株。不使用标记基因直接筛选法。由于转化植株的 筛选工作量巨大，成功的可能性小，直到最近才在马铃薯研 究中见到相关报道ｆ”。标记基因的剔除技术仍处于探索阶 段，到目前为止还没有建立起一套高效的标记基因消除系 统，并且标记基因的消除存在着诸如选择效率低，步骤繁琐 等问题。难以为一般分子生物学实验室所利用。目前，人们 普遍认为最为有效的办法就是利用安全标记基因，这些标 记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生物是安全 的。因此，被称为安全标记基因。以下对几种安全标记基因 在植物转化中的研究进展作一综述。 １ ６一磷酸甘露糖异构酶（ｐｍｉ）基因 １９７６年Ｍａｌｃａ等就发现在以甘露糖为碳源的培养基上 培养的所有细胞都不能正常生长分化。这是由于在含甘露 糖的培养基上，植物内源己糖激酶催化甘露糖磷酸化为６一 磷酸甘露糖．６一磷酸甘露糖不仅不能被细胞进一步代谢利 用，而且当其积累到一定浓度时就会对细胞的正常生长代 谢产生抑制作用。Ｗｅｉｓｓｅｒ等将大肠杆菌的ｐｍｉ基因构建到 ｐＺＹ５０７质粒，并转化到Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ中，成功地表达 了磷酸甘露糖异构酶。在该酶的催化下，６一磷酸甘露糖转变 成细胞能够利用的６一磷酸果糖。避免了６一磷酸甘露糖的大 量积累，且反应产生的ＡＴＰ为细胞的正常代谢提供了能量， 作者简介刘广金（／９７９－），男，助理实验师，主要从事化学生物学方 面的研究。 收稿日期２００８—０１—０７ ２０８ 使重组细胞能够在以甘露糖为碳源的培养基上正常生长。 非转化细胞因缺乏磷酸甘露糖异构酶而造成６一磷酸甘露 糖积累，并大量消耗ＡＴＰ，从而被淘汰掉。ｐｍｉ基因的表达， 使甘露糖能够作为细胞生长的碳源，从而成为一种新的选 择标记基因。目前，来源于大肠杆菌的ｐｍｉ基因已被广泛用 于甜菜、玉米、水稻和小麦的遗传转化。 ２木糖异构酶（ｘｙｌＡ）基因 马铃薯、烟草和西红柿等许多植物的培养细胞可利用 Ｄ一木酮糖但不能以用Ｄ一木糖作为主要碳源。标记基因 ｘｙｌＡ编码的木糖异构酶催化Ｄ一木糖转变成木酮糖，然后再 经过磷酸戊糖途径分解代谢，为细胞生长所利用。在添加Ｄ一 木糖的筛选培养基上。整合有外源ｘｙｌＡ基因的转化细胞因 能利用Ｄ一木糖作为碳源而获得优势生长，非转化细胞因碳 源供应不足而使其生长受到抑制。据此可区分转化细胞和 非转化细胞。Ｈａｌ＆ｕｐ等闭将木糖异构酶基因（ｘｙｌＡ）分别转到 马铃薯、烟草和西红柿愈伤组织中，然后将愈伤组织置于含 有木糖的培养基上进行筛选，得到了能够在该培养基上正 常生长的转基因植株。 ３绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ。ＧＦＰ）基因 ＧＦＰ基因编码的荧光素蛋白是一种单体蛋白．它在３９５ Ｉ１ｎ１的远紫外光或４９０ｎｍ的蓝光下便可激发出绿色荧光。把 编码该蛋白的基因与目的基因一起导入植物细胞。不需要 添加任何底物或辅助因子。不使用同位素，也不需要测定酶 的活性，用专门的仪器检测（如ＦＡＣＳ），就能分离转化细胞 和非转化细胞。同时ＧＦＰ生色基团的形成无种属特异性，在 原核和真核细胞中都能表达，其表达产物对细胞基本上没 有毒害作用，并且不影响细胞的正常生长和功能。ＧＦＰ基因 已被用于转化甜橙原生质体、云杉花粉、水稻胚性愈伤组织、 甘薯叶肉细胞原生质体和叶片组织。Ｚｈａｎｇ等［３１在用ＧＦＰ作 标记转化甜菜后发现，ＧＦＰ不仅可以作为一种重要的无毒 害的选择标记，而且还有望用于培育无选择标记的转基因 甜菜。 ４葡糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因 外植体的芽再生往往需要外源细胞素。在培养基 中加入细胞素无活性的葡糖苷酸衍生物。转化细胞可 以表达ＧＵＳ基因来将其转变为有活性细胞素，从而促 进芽的分化，那些没有转化的细胞则不能再生ｏＪｏｅｒｓｂｏ和 （下转第２１０页） 维普资讯 http://www.cqvip.com 《现代农业科技》２Ｏ０８年第４期 ３．１问题 （１）方便登记注册。凡具有规范名称、组织章程和固定 我县农民专业合作社的发展虽已有一定基础，但总体 场所、有一定数量的成员和注册资金的群体，均可依法登记 上尚处于起步阶段．还存在不少问题。集中表现为：一是发 成立农民专业合作社。 展速度不够快，乡镇间发展不平衡；二是发展的活力不足， （２）依法落实税收减免。对已登记成立的农民专业 根据调查，全县各类专业合作经济组织中，组织紧密、制度 合作社，为农户提供农业生产技术或劳务服务所取得的收 健全、运作正常、作用明显的只占少数；三是内部管理不够 入，暂免征收企业所得税：从事农业机械作业、排灌、植保、 规范；四是带动作用不强，多数合作组织带动范围仅限于本 家畜配种和疾病防治等服务所取得的收入，免征营业税；销 村或邻村，合作组织的优越性没有充分显现出来。 售通过分等分级、整理包装、加贴品牌商标等简单加工的自 ３．２原因 产农产品，免征。 一是扶持不到位；二是辅导培训机制不健全。目前 （３）加大资金扶持。县乡财政每年都要安排专项资金， 大部分专业合作社运行不够规范、活力不足的重要原因之 扶持农民专业合作社进行标准化生产、无公害基地建设、农 一，就是缺乏专业的、及时的、有效的辅导和培训。 产品市场营销及引进新品种、新技术和开展试验、示范、培 ４发展农民专业合作社的思路 训等。 农民专业合作社是农业产业化的重要主体，发展农业产 （４）创造宽松环境。农民专业合作社根据自身发展的需 业化就必须大力发展农民专业合作组织。今后一段时间我 要，在国家没有禁止或性规定的领域内，可以自主选择 县发展农民专业合作社的工作思路是：以提高农民组织化 农产品和农业生产资料经营范围。各级各部门要从土地、电 程度、提高农业产业化经营水平、促进农民增收、构建扶 价等方面给予优惠。鼓励农民专业合作社注册商品商标，申 持农业、农民的新载体为宗旨，突出抓好以下几个方面。 报无公害农产品和绿色食品质量认证。 （上接第２０８页） 物合成就可以正常进行。到目前为止，已经分离出了许多抗 Ｏｋｋｅｌｓ利用该基因为选择标记，用细胞素６一ＢＡ的葡糖 Ｇａｂａｃｕｌｉｎｅ的突变体，其中有一个被命名为ＧＲ６的突变体 苷酸衍生物作选择剂转化植物细胞，比用卡那霉素标记基 携带有ｈｅｍＬ基因。Ｇｏｕｇｈ等嘲用ｈｅｍＬ基因转化烟草，然后 因的转化效率高２倍嗍。 用Ｇａｂａｃｕｌｉｎｅ进行筛选，分子检测表明，携带有标记基因 ５甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因 ｈｅｍＬ的都为绿苗，缺乏标记基因ｈｅｍＬ的都为白化苗，显示 甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）能催化有毒的甜菜碱醛转变 了用ｈｅｍＬ作为标记基因的应用前景。 成无毒的甜菜碱．只要在培养基中添加适量的甜菜碱醛提 安全标记基因由于大多数来自植物本身，因而不必担 供筛选压即可，无须其他辅助设备。ＢＡＤＨ基因在安全标记 心由于“基因逃逸”而产生的临床抗生素失效和“超级杂草” 基因方面具有很大的优势：①基因来源于藜科高等植物并 的产生，不会破坏生态平衡，从而避免了转基因而引起的安 且产物安全；②催化形成的终产物甜菜碱是高等植物天然 全争议。大量的文献也报道了这类安全标记基因的转化效 的渗透调节物质，可提高植物的抗渗透胁迫能力。Ｄａｎｉｅｌｌ等嘲 率显著高于传统的抗性标记基因，并且其转化的程序类似 在转化烟草叶绿体基因组时，以ＢＡＤＨ基因作为标记基 于传统的抗性标记．程序简单，技术成熟，应用范围广泛，同 因，与其他抗性基因相比，不仅得苗快、转化频率高，而且 时个别标记基因还可作为目的基因而存在。因而应用安全 ＢＡＤＨ基因稳定整合到转基因烟草植株的全部叶绿体基因 标记基因对植物的转化意义更大，实现了转化１次转移２ 组中．得到了同质化，转基因植株中的ＢＡＤＨ酶活性比对 个基因的目的。 照提高了１５－１８倍。这表明．ＢＡＤＨ基因确实可作为植物转 ７参考文献 化的安全标记基因。 …ＤＥ Ｖ Ｎ，ＷＯＬＴＥＲＳ Ａ Ｍ，ＲＡＥＭＡＫＥＲＳ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ６谷氨酸一１一半醛转氨酶（ＧＳＡＡＴ）基因 ｍｅ￣ｏｄ ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ——ｆｒｅｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ａｃｒｏｓｓ——ｐｏｌｌｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｐａｇａｔｅｄ ｃｒｏｐＵ】．ＮａｍｒｅＢｉｏｔｅｃｈ，２００３（２１）：４３９—４４２． 叶绿素是植物光合作用的物质基础．如果植物中缺少 ｆ２］ＨＡＬＤＲＵＰ Ａ，ＰＥＴＥＲＳＥＮ Ｓ Ｇ，ＯＫＫＥＬＳ Ｆ Ｔ．Ｐｏｓｉｉｔｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ａ 叶绿素，植物将失绿黄化．不能正常进行光合作用，从而影 ｐｌａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ 响植株的正常生长发育，甚至导致植物死亡。植物体内叶 ｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ田．ＰｌａｎｔＣｅｌ／Ｒｅｐ，１９９８（１８）：７６—８１． ［３］ＺＨＡＮＧ Ｃ Ｌ，ＣＨＥＮ Ｄ Ｆ，ＭＣＯＲＭＡＡ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ＧＦＰ 绿素生物合成途径现已经清楚，只要该途径的任何一步中 ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓ ａ ｖｉｔａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ 断，都会影响叶绿素的正常合成。最近，利用该途径中的一 ｓｕｇａｒｂｅｅｔ（ＢｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓＬ．）Ｉｌ１．ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１，１７（２）：１０９—１１７． ［４］ＪＯＥＲＳＢＯ Ｍ，ＯＫＫＥＬＳ Ｆ Ｔ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ 个关键酶ｈｅｍＬ基因发展了一种基于叶绿素合成的生物安 ｐｌａｎｔ ｃｅＵｓ：Ｐｏｓｉｉｔｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎＵ】．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰ ｅｐ，１９９６（１６）：２１９—２２１． 全标记。３一氨基－２．３一二氢苯甲酸（３一ａｍｉｎｏ一２，３一 ［５］ＤＡＮＬＥＬＬ Ｈ，ＭＵＴＨＵＫＵＭＡＲ Ｂ，ＬＥＥ Ｓ Ｂ．Ｍａｋｅｒ ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｄｉｈｙｄｒｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，Ｇａｂａｃｕｌｉｎｅ）是一种植物毒素．它能强烈地 ｐｌａｎｔｓ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌｍｔ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎＵ】．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２００１，３９（２）：１０９—１１ 抑制谷氨酸－１－半醛转氨酶（ＧＳＡＡＴ）的活ｈ生，使８一氨基一 一 ［６］ＧＯＵＧＨ Ｋ Ｃ，ＨＡＷＥＳ Ｗ Ｓ，ＫＩＬＰＡＴＲＩＣＫ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｌａ 酮戊酸（ａｍｉｎｏ ｌａｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＬＡ）不能合成，从而导致叶绿 ＧＲ６ ｇｌｕｔａｍａｔｅ １ ｓｅｍｉｌａｄｅｈｙｄｅ￣ｌｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｚｙｍｅ ｂａｓｅｄ 素的生物合成中断；而在培养基中加入ＡＬＡ，则叶绿素的生 ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｕ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２００１，２０ （４）：２９６－３００． ２１０
