大同市云州区黄花菜资源调查与分析

Journal of Shanxi Agricultural Sciences

大同市云州区黄花菜资源调查与分析

1，21，2

王凌蔚 ，侯非凡 ，武

1，2

江 ，高

1，2

阳 ，张

1，2

伟 ，

1，21，2

王金耀 ，杨文静 ，李

1，21，2

森 ，邢国明

（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷030801；2.大同黄花产业发展研究院，山西 大同037004）

摘要：山西省大同云州区是我国黄花菜的主要生产基地，为了探清大同市云州区黄花菜产区的主要品种，为大

同市区域优良种质鉴定及选育提供理论依据，也为云州区黄花菜产区的品牌保护提供有力支持，试验采集大同市云州区33个村落的黄花菜种苗，采用形态学指标与山西农业大学黄花菜种质资源创新与利用课题组前期开发的43对高多态性EST-SSR分子标记对这些种苗进行遗传多样性分析、遗传结构分析与聚类分析。结果表明，根据花蕾性状的形态学指标进行聚类分析，可将大同地区黄花菜资源分为3个组群；筛选出18对EST-SSR标记能够很好地区分待测种质，18对EST-SSR标记对146份萱草属植物种质共扩增出8多态片段，平均每对引物扩增出4.条多态片段，引物多态性信息含量的平均值为0.298 2，大同市大部分黄花菜种质资源与参考种质大同黄花的遗传相似系数均为1.000 0。基于EST-SSR标记的聚类分析与遗传结构分析结果相差不大，能很好地对黄花菜种质进行分类，除了2个来自峰峪村和2个来自贺店村的黄花菜种质外，其余134份来自大同市云州区的黄花菜种质资源与大同黄花聚为一类。以上结果表明，除了来自峰峪村和贺店村的4个黄花菜种质外，其余134份来自大同市云州区的黄花菜种质资源全部为大同黄花。

关键词：黄花菜；EST-SSR；聚类分析；遗传多样性；大同市云州区

中图分类号：S4.3 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）06‒0663‒13

Investigation and Analysis on the Resources of Hemerocallis citrina in

Yunzhou District of Datong City

22222

WANG Lingwei1，，HOU Feifan1，，WU Jiang1，，GAO Yang1，，ZHANG Wei1，，

2222

WANG Jinyao1，，YANG Wenjing1，，LI Sen1，，XING Guoming1，

（1.College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；

2.Datong Huanghua Industrial Development Research Institute，Datong 037004，China）

Abstract：Yunzhou district, Datong, Shanxi province is the main production base of Hemerocallis citrina in China. In order to find out the main varieties of Hemerocallis citrina in Yunzhou district of Datong city and provide a theoretic basis for identification and breeding for the regional excellent varieties in Datong city, provide strong support for brand protection of the Hemerocallis citrina production area in Yunzhou district, in this experiment, Hemerocallis citrina seedlings from 33 villages in Yunzhou district of Datong city were collected, and morphological index and 43 pairs of highly polymorphic EST-SSR molecular markers previously developed by the research group on innovation and utilization of Hemerocallis citrina germplasm resources of Shanxi Agricultural University was used to conduct the genetic diversity analysis, genetic structure analysis, and cluster analysis of these seedlings. The results showed that the Hemerocallis citrina resources in Datong area could be divided into three groups by cluster analysis based on morphological index of flower bud traits.18 pairs of EST-SSR markers were screened out to be able to distinguish the tested germplasm. A total of 88 polymorphic fragments were amplified from 146 Hemerocallis citrina germplasm by these 18 pairs of EST-SSR markers, with an average of 4. polymorphic fragments amplified by each pair of primers. The average value of polymorphism information content(PIC) of primers was 0.298 2. The genetic similarity coefficient between most of the Hemerocallis citrina germplasm resources in Datong and the reference germplasm Datong Huanghua was 1.000 0. The results of cluster analysis and genetic structure analysis based on EST-SSR markers were similar, which could well classify the Hemerocallis citrina germplasm. Except for two Hemerocallis citrina germplasm from Fengyu village and two germplasm from Hedian village, the other 134 Hemerocallis citrina germplasm resources from Yunzhou district of Datong city

收稿日期：2022-10-26

基金项目：山西省农业重点研发计划重点项目（201903D211011-01）；山西农业大学青年拔尖创新人才支持计划（BJRC201601）；山西农业

大学科研项目生物育种工程项目（YZGC122）；山西省基础研究计划青年科学研究项目（20210302124023）

作者简介：王凌蔚（1997-），女，山西右玉人，在读硕士，研究方向：园艺植物功能物质挖掘与产品开发。通信作者：邢国明（1962-），男，山西定襄人，教授，博士生导师，主要从事园艺植物种质创新与利用研究工作。

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were clustered with Datong Huanghua. The above results showed that except for four Hemerocallis citrina germplasm from Fengyu village and Hedian village, the other 134 Hemerocallis citrina germplasm resources from Yunzhou district of Datong city were all Datong Huanghua.

Key words：Hemerocallis citrina; EST-SSR; cluster analysis; genetic diversity; Yunzhou district of Datong city

黄花菜（Hemerocallis citrina）又名忘忧草、金针菜，属阿福花科萱草属植物[1]，起源于我国东北部、日本及欧洲温暖地带，是一种常见的药食兼用型功能蔬菜[2]。我国黄花菜种质资源丰富,是黄花菜种植面积最大的国家[3]，其中，山西大同、陕西大荔、甘肃庆阳、湖南祁东是我国最具有代表性的几个黄花菜产区[2]。其中，大同市黄花菜产业历史悠久，发展迅猛，在脱贫攻坚道路上展现出了非凡的生命力。2020年**总在山西考察，作出“黄花也能做成大产业，有着很好的发展前景。要保护好、发展好这个产业，让黄花成为群众脱贫致富的‘摇钱草’”的重要指示，更加促进了大同市黄花产业的发展[4]。大同市是全国黄花菜主产区之首，种植面积稳定在1.77万hm2 [5]。近年来，云州区黄花菜种植面积扩大到1.13万hm2，占全国总面积的27.3%，种植面积和产量均居全国第2位[6]。“大同黄花”被评为中国百强农产品区域公用品牌，市场认可度越来越高，各类黄花产品直营效果好，品牌知名度高。

优异亲本资源的筛选和种质资源的准确鉴定是植物品种选育推广和遗传研究的必要基础。目前，我国萱草属植物分子水平上的种质资源鉴定和分类研究都还有待深入[7]。各类黄花菜在外形上极为相似，利用传统分类学的手段很难辨认，这给优质黄花菜种质的选育和研究都带来很大的困难[8]。而在分子层面，利用分子标记的多态性对黄花菜资源进行种质鉴定能够有效地解决这一问题，在国内外很多相关研究中已得到充分验证。较早出现的以PCR技术为核心的是RAPD分子标记技术。刘长命等[9]通过RAPD分子标记鉴定出秦岭南麓24份萱草属种质资源。之后出现的SSR分子标记技术具有丰富的多态性以及高度的可靠性[10-11]。朱华芳等[12]利用SSR分子标记技术对14个萱草园艺品种及6个原种或变种进行了聚类分析。还有一类分子标记是以DNA序列（mRNA或单核苷酸多态性）为核心的EST技术，其是20世纪90年代被研究出来的。近年来LI等[13]利用多态性EST-SSR标记对155份萱草属植物进行遗传多样性分析，这些SSR标记在萱草属植物材料间开花时间的关联分·6·

析中得到进一步应用。在这些分子标记中，EST-SSR标记因其开发便利、多态性好、可操作性高而得以广泛应用，在杜鹃[14]、扁穗雀麦[15]、文心兰[16]、茶树[17]、黍稷[18]等植物的研究中均有报道。

为了探清大同市云州区黄花菜产区的主要品种，本研究利用形态学指标对从山西省大同市云州区的33个不同村落中采集的黄花菜种质以及8个已知来源的萱草属植物进行表型性状调查与聚类，并基于LI等[13]开发的43对多态性EST-SSR标记进行遗传多样性与遗传结构分析，对大同市黄花菜种质进行鉴定筛选，旨在为大同市地区黄花菜优良种质鉴定及选育提供理论依据，为黄花菜产区提供品牌保护依据。

1　 材料和方法

1.1　试验材料

试验待鉴定的138份黄花菜种质来源于山西省大同市云州区的33个村落（图1），8个参考种质现保存于山西农业大学萱草属植物种质资源圃（表1）。每份种质选取长势良好、无病虫害的植株，采集其幼嫩叶片和成熟花蕾，设置3个生物学重复，置于-40 ℃冰箱中保存备用。

图1　大同市云州区33个村落的地理位置

Fig. 1　The geographical location of 33 villages

in Yunzhou district of Datong city

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表1 参考种质信息

Tab.1 Reference germplasm information

类别Type

黄花菜

Hemerocallis citrina

品种名Species大同黄花大荔黄花小黄花冲里花1号

萱草

Hemerocallis fulva

摇篮曲龙游红花海尔范儿童节萱草

来源地Origin山西大同陕西大荔甘肃庆阳湖南邵阳美国浙江龙游北京植物园河北旭东萱草繁育基地

经纬度

Longitude and latitude北纬40°02′24.58″东经113°36′43.81″北纬34°47′44.38″东经109°56′31.81″北纬35°43′50.23″东经107°39′4.10″北纬27°14′44.38″东经111°27′7.45″

-北纬29°01′41.77″东经119°10′20.10″北纬40°0′10.72″东经116°12′29.40″北纬39°21′52.81″东经115°21′19.47″

全年平均温度/℃

Annual average temperature

0~1510~215~1315~22-13~219~198~20

全年平均降水量/mmAnnual average pre⁃

cipitation

384514557.9545.4-1 602.48500

注：表中“-”表示未知。

Noto: \"-\" Indicated unknown in the table.

1.2　试验方法

1.2.1　表型性状调查　对8份参考种质以及138份待鉴定种质进行花蕾表型性状调查。花蕾长度、花蕾直径、花蕾鲜质量、花蕾干质量调查方法及测量标准参照熊雄等[19]定义的标准。每份种质进行3个生物学重复、3个技术重复。

1.2.2　EST-SSR检测　利用侯非凡[2]调整改良的CTAB法提取146份萱草属种质的DNA，其浓度及纯度采用Nano Drop Spectrometer进行检测。本试验所用的43对多态性EST-SSR引物序列来自山西农业大学黄花菜种质资源创新与利用课题组的大同黄花（Hemerocallis citrina cv. ‘Datong Huanghua’）转录组测序数据[13]，SSR标记扩增PCR采用10 μL扩增体系，Touchdown反应程序，采用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，电泳结束后经银染显色拍照记录检测结果[20]。1.3　数据分析

1.3.1　表型性状数据分析　使用Microsoft Excel 2010对每个表型性状的数据进行统计，计算每个性状的最大值、最小值、极差、平均值（x）、标准差（σ）及变异系数。并利用Shannon’s多样性指数（H'）评价各表型性状的遗传多样性，将各性状数据分为10级，第1级为（Xi<（x-2σ）），第10级为（Xi>（x+2σ）），每0.5σ为1级。

H'=-∑（Pi）ln（Pi）

（1）　

式中，Pi表示每个性状第i级内材料的数量占

总材料数量的比例。

使用NTSYSpc 2.10软件，采用欧氏距离以及UPGMA方法对146份萱草属种质性状进行聚类分析，并绘制聚类树状图。

1.3.2　EST-SSR标记遗传多样性分析　根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，构建“0,1”序列矩阵。使用PopGene 32软件计算多态位点百分率与观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon’s信息指数（I）等；利用PowerMarker V 3.25软件计算每一个引物的多态性信息含量PIC值；使用NT⁃SYSpc 2.10软件，采用UPGMA方法对8个参考种质与138个待鉴定种质进行聚类分析。

1.3.3　遗传结构分析　利用STRUCTURE 2.3.4软件中的贝叶斯聚类方法对146份种质的遗传结构进行分析[21]。设置群体分组范围，即K值为1~5，设定不作数迭代（Length of burn-in period）为50 000，不作数迭代后的马尔科夫链MCMC（Mar⁃kov’s Chain Monte Carlo）为100 000，各20次重复计算[22]。将得到的计算结果压缩为zip格式上传至Structure Harvester服务器的网址（http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）进行计算[23]，综合文献[22，24]的最佳K值判断方法得到最佳K值。

2　 结果与分析

2.1　大同市栽培黄花菜种质表型分析

由表2可知，萱草的花蕾长度均值为8.74 cm，

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花蕾直径均值为16.19 mm，黄花菜的花蕾长度均值为12.69 cm，花蕾直径均值为10.30 mm。黄花菜和萱草相比，其花蕾长度更长，但是花蕾直径较短；但是黄花菜与萱草花蕾的鲜质量和干质量差异不明显，萱草的花蕾鲜质量均值为4.02 g，花蕾干质量均值为0.45 g，黄花菜的花蕾鲜质量均值为3.76 g，花蕾干质量均值为0.37 g。

来自大同市云州区的黄花菜种质中，邢庄村的种质花蕾长度最大，可达14.43 cm，东骆驼坊的种质花蕾长度最小，只有9.54 cm；花蕾直径最大的种

质来自徐家堡村，为11.99 mm，花蕾直径最小的种质来自东骆驼坊，为8.52 mm；花蕾鲜质量最大的种质为5.09 g，来自大坊城村，鲜质量最小的种质为2.38 g，来自东骆驼坊；花蕾干质量最大的种质为0.56 g，来自小蒲村与南栋庄，干质量最小的种质为0.17 g，来自下泉村。通过整理表中数据可以看出，来自郭家窑头村的黄花菜种质花蕾长度、花蕾直径、花蕾鲜质量与花蕾干质量都比较大，在138份地方栽培种中各项性状较为优良；而来自东骆驼坊的黄花菜种质各项性状较差。

表2 各村落栽培种花蕾表型性状统计

Tab.2 Statistical analysis of flower bud phenotypic traits of cultivated species in each village

编号IDRef1Ref2Ref4Ref5

品种名Species大同黄花小黄花

来源Origin山西大同甘肃庆阳湖南邵阳陕西大荔美国河北旭东萱草繁育基地北京植物园浙江龙游独树村任家小村东骆驼坊西骆驼坊营坊沟郭家窑头村峰峪村峰峪村杨庄徐家堡村徐家堡村徐家堡村西骆驼坊东骆驼坊唐家堡村唐家堡村瓜园村水头村东水地村小蒲村南栋庄东安家堡吉家庄吉家庄利仁皂村

类别Type黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜萱草萱草萱草萱草黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜

花蕾长度/cmFlower bud length12.88±0.08ghi12.69±1.79abcdefghi11.76±2.27ghi13.54±0.61fghi6.28±0.63l7.75±0.15l8.86±1.48k12.06±1.04efghi12.28±1.42bcdefghi13.16±0.39abcdefgh9.54±0.36jk12.14±0.21cdefghi13.28±1.94abcdefgh14.02±0.38abc14.12±0.46ab14.00±1.25abcd12.20±1.69bcdefghi12.83±0.23abcdefgh12.40±0.72bcdefghi13.53±0.55abcdefg11.53±0.81hi10.80±0.70ij12.83±1.07abcdefgh12.40±1.00bcdefghi13.07±0.35abcdefgh11.63±0.90ghi11.63±1.46ghi13.77±0.15abcdef12.67±0.29abcdefghi12.67±0.06abcdefghi12.10±0.44cdefghi13.37±0.12abcdefgh12.85±0.35abcdefgh

花蕾直径/mmFlower bud width10.92±0.31cdefghijk8.75±0.24opq6.97±0.21r10.72±0.56cdefghijkl18.92±0.67a15.25±2.19b15.18±1.07b15.42±2.30b9.63±0.53klmnopq11.00±0.46cdefghij8.52±0.33q8.65±0.38pq10.92±1.07cdefghijk11.85±0.27cd11.65±0.45cde11.24±0.82cdefghi11.29±0.61cdefgh11.39±0.40cdefg11.99±0.94c11.55±0.40cdef9.45±0.75lmnopq9.16±0.50mnopq11.24±1.43cdefghi10.51±0.08efghijkl10.51±0.47efghijkl9.49±0.58lmnopq10.73±1.62cdefghijkl10.59±0.12defghijkl9.94±0.31ijklmno9.44±0.20lmnopq8.96±0.41nopq10.08±0.09hijklmn11.39±0.03cdefg

花蕾鲜质量/gFresh weight4.04±0.69bcdefghijkl3.11±0.71klmnopqr2.47±0.75qr4.08±0.55bcdefghijk4.48±0.28abcdef3.33 ±0.13ijklmnopqr3.11±0.66klmnopqr5.17±0.72a2.59±0.42pqr4.26±0.47abcdefghij2.38±0.19r3.22±0.28klmnopqr4.43±0.abcdef4.57±0.31abcd4.75±0.44abc4.44±1.28abcdef3.27±0.jklmnopqr3.40±0.35hijklmnopq2.98±0.16nopqr3.52±0.28efghijklmnop3.02±0.43mnopqr2.86±0.29opqr4.55±1.41abcd3.66±0.46defghijklmno3.72±0.33defghijklmno3.03±0.35mnopqr4.32±0.26abcdefghi3.88±0.25cdefghijklmn3.71±0.14defghijklmno3.27±0.29jklmnopqr4.06±0.12bcdefghijkl3.52±0.23efghijklmnop

花蕾干质量/gDry weight0.52±0.10ab0.34±0.05fghijk0.33±0.06fghijk0.53±0.07ab0.50±0.06abc0.39±0.02defghi0.37±0.07defghij0.52±0.02ab0.37±0.03defghij0.50±0.06abc0.31±0.02hijk0.37±0.03defghij0.52±0.07ab0.53±0.02ab0.45±0.06bcd0.41±0.08cdefgh0.37±0.05defghij0.40±0.03defgh0.39±0.01defghi0.41±0.03cdefg0.40±0.05defgh0.36±0.03defghij0.55±0.16a0.42±0.07cdef0.45±0.05bcd0.37±0.04defghij0.56±0.07a0.56±0.09a0.21±0.00lmn0.26±0.04klmn0.28±0.02jklm0.22±0.04mn

Ref3冲里花1号

大荔黄花摇篮曲

Ref6儿童节萱草Ref7Ref8123456710111213141516171819202122232425

海尔范龙游红花地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种

3.84±0.69cdefghijklmno0.46±0.03bcd

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续表2 各村落栽培种花蕾表型性状统计

Tab.2（Continued） Statistical analysis of flower bud phenotypic traits of cultivated species in each village

编号

ID262728293031323334353637383940

品种名Species地方栽培种地方栽培种地方栽培种

来源Origin下泉村三十里铺驾遇造村（周七庄镇）路家庄罗卜庄村下高庄村贺店村康店村小坊城村坨坊村大坊城村官堡村马连庄邢庄村党留庄村

类别Type黄花菜黄花菜黄花菜

花蕾长度/cmFlower bud length12.13±0.32cdefghi11.93±0.60efghi12.07±0.47defghi12.80±0.20abcdefgh13.30±0.10abcdefgh13.53±0.81abcdefg13.33±0.67abcdefgh11.67±0.35ghi11.50±1.01hi13.10±0.66abcdefgh13.87±0.40abcde12.57±0.85abcdefghi13.53±1.31abcdefg14.43±0.70a13.07±1.19abcdefgh

花蕾直径/mmFlower bud width9.60±0.30lmnopq9.69±0.65klmnopq10.14±0.36ghijklmn10.39±0.58efghijklm10.60±0.32defghijkl10.92±0.31cdefghijk9.84±0.96jklmnop9.21±0.15mnopq9.96±0.53ijklmno10.27±0.39fghijklm11.19±0.19cdefghi10.01±0.23hijklmno11.45±1.04cdef10.93±0.26cdefghijk10.42±0.13efghijklm

花蕾鲜质量/gFresh weight3.10±0.32klmnopqr

花蕾干质量/gDry weight0.17±0.01n

3.80±0.54cdefghijklmno0.25±0.04klmn3.83±0.20cdefghijklmno0.26±0.03klm4.32±0.24abcdefgh4.43±0.12abcdef4.62±0.31abcd3.42±1.09ghijklmnopq3.08±0.07lmnopqr3.49±0.58fghijklmnop3.98±0.38cdefghijklm5.09±0.47a

3.50±0.15efghijklmnop4.49±1.03abcde4.99±0.45ab4.39±0.59abcdefg

0.35±0.08efghijk0.32±0.06ghijk0.44±0.02bcde0.32±0.06ghijk0.32±0.03ghijk0.30±0.03ijkl0.30±0.05ijkl0.34±0.06fghijk0.34±0.06fghijk0.29±0.02jklm0.28±0.01jklm0.26±0.05klmn

地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种地方栽培种

黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜黄花菜

注：表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同小写字母表示0.05水平上差异显著。

Note: The data in the table are mean±SD. Different lowercase letters after the data indicated significant differences at the 0.05 level.

对4个花蕾表型性状进行分析，结果显示（表3），变异系数最大的性状是花蕾干质量（28.63%）；其次是花蕾鲜质量（22.16%），之后是花蕾直径（10.32%）；花蕾长度的变异系数最小（10.04%），表

明它们在来自大同云州区的138份黄花菜种质间变异较小。这4个性状的多样性指数变化范围为2.03~2.07，彼此相差不大。

表3 花蕾表型性状变异统计

Tab.3 Statistics of variation of flower bud phenotypic trait

性状Character花蕾长度/cmFlower bud length花蕾直径/mmFlower bud width花蕾鲜质量/gFresh weight花蕾干质量/gDry weight

最大值Maximum15.3013.076.170.73

最小值Minimum9.108.111.920.16

极差Range6.204.9.250.57

平均值Average12.7010.423.790.38

标准差变异系数/%多样性指数Standard deviationCoefficient of variationDiversity index

1.271.080.840.11

10.0410.3222.1628.63

2.062.072.032.04

采用NTSYSpc 2.10软件对146份萱草属种质材料的花蕾长度、花蕾直径、花蕾鲜质量和花蕾干质量4个性状进行聚类分析，结果如图2所示，参考种质摇篮曲（5号）、儿童节（6号）和海尔范（7号）聚类为一组；另一组包括其余5个参考种质和138份来自山西大同的黄花菜种质资源，这138份来自大同的黄花菜种质资源可以分为3组，第1组为来自徐家堡村的53号、来自东骆驼坊的59号、来自南栋庄的81号和参考种质龙游红花（8号）成为一类；第2组

是来自驾遇造村的102号和来自路家庄的103号、104号；第3组为其余132份来自大同的黄花菜种质资源和参考种质大同黄花（1号）、小黄花（2号）、冲里花1号（3号）和大荔黄花（4号）聚类在一起。

通过比较可以发现，来自大同市云州区的黄花菜种质的各项表型性状都与来自山西大同黄花十分相似，所以，只通过表型观测无法对其品种进行分辨，需要通过分子标记技术对黄花菜种质资源进行进一步鉴定。

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图2　146份萱草属种质的形态学聚类

Fig.2　Morphological cluster diagram of 146 Hemerocallis germplasm

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2.2　EST-SSR分析

经Nano Drop检测DNA浓度及纯度，其OD260/280均在1.8~2.0，OD260/230均在1.8~2.0，DNA质量符合分子标记检测要求。使用43对多态性EST-SSR标记对146份种质进行扩增，所有标记均在8份参考种质中表现出多态性，而在大同地方

栽培种中表现出多态性的标记有18对。EST-SSR在部分种质中的扩增情况如图3所示，其中三碱基重复类型以上的标记有15对，SAU00010、SAU00029、SAU00097为二碱基重复，这18对EST-SSR标记的详细信息如表4所示。

M.600 bp标准Marker；1.大同黄花；2.小黄花；3.冲里花1号；4.大荔黄花；5.摇篮曲；6.儿童节；7.海尔范；8.龙游红花；40、47、121、

122为部分地方栽培种

M. 600 bp standard Marker; 1. Datong Huanghua; 2. Minor mill.; 3. Chonglihua 1; 4. Dali Huanghua; 5. Lullaby baby; 6. Children's Festival; 7. Frans Hals; 8. Longyou Honghua; 40, 47, 121 and 122 were cultivated in some places

图3　SAU00102在部分种质中的扩增情况Fig.3　Amplification of SAU00102 in some lines表4 多态性EST-SSR标记信息

Tab.4 Information of polymorphism EST-SSR marker

SSR名称SSR name

SSR基序SSR Motif

上游序列

Forward primer sequence

退火温度/℃Tm58.759.859.759.560.160.160.059.660.260.060.059.760.060.160.059.960.059.9

下游序列

Reverse primer sequence

R：ATGTCATCTCCATCAAGGGCR：GAAGATTCCCCCGTTGATCTR：GGGGAGGTTATGGACGAGTTR：TGCACAAAACAATTGCATCAR：CCAGCTTTCAAATGGACGATR：CCTTCTCTCTCGTCTCCCCTR：CCAGTCCATCAAAACGTCCTR：TCAATCATTCAGTTGGGCTGR：ATGAGCTTCACCAGGGTTTGR：GTCAAATTGAGCGGTTGGATR：ACCGAAACCCTCGGTAAGTTR：CTCCTCAGCTTGCTTCGTCTR：TCCCGAATAGCGTGTCCATAR：CCGAGACACAAAACTCACGAR：TCTGTGATGCTGCTTGGTTCR：GTTTGGAGATTGGAGGGGTTR：GTCGGGGTACAATTCGAAGAR：AAGTCGCAGACCAATTCGAT

扩增片段

退火温

大小/bp

度/℃

Amplicon

Tm

Size59.960.360.259.760.159.96059.660.159.959.959.961.459.96060.259.959.7

2412202431831751831511071228192181206112130221150206

SAU00006（TAG）CCAAGTAAGAGGGTGCATCA5…（GAG）F：

5…（AGG）6SAU00010（CA）9…（AC）7SAU00029（AT）7SAU00042（AAC）6SAU00045（AAG）5SAU00047（GCC）5SAU00048（AGT）5SAU00052（CTC）5SAU00059（CCA）5SAU00063（AGA）6SAU000（ATCG）5SAU00080（AGAT）5SAU00096（AAAGCC）5SAU00097（T）10（TG）8SAU00102（TGAAAC）5SAU00104（CTGTG）5SAU00120（TATT）5SAU00121（GTCA）5

F：ATACAAGCCATTGGCAAACCF：TCACTGCAACCAAATGAAGGF：GGGATGAAAGAAACGCAATCF：GGTGGAGGTGAGGTTCTCAAF：AGAAGGTTGTGGATTGCTGGF：CTCTTCGGCAGGAGTAGTGGF：TGGTCTAATCATTGTCCCCCF：CCTCTTCTCTTCCCCTCACCF：TTGTATACGGTTTCCTCGCCF：GCTTCTTCTTGTCAGCACCCF：TTCTCCGCCTTGGTGTACTTF：ACCACATGTCCTCCTATCGCF：ATCGCATATAGCGGACCTTGF：CTCCAGTGACAGTCAGCCAAF：TGAATCAAACTCCACCACCAF：CCTTCCTCAATCCAACCTCAF：TTTGCATGCCTAGTCCTGTG

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2.3　遗传多样性分析

遗传多样性分析结果表明（表5），18对EST-SSR标记在146份萱草属植物材料测得88个等位基因，平均每个位点等位基因数（Na）4.888 9个，有效等位基因数（Ne）1.761 4个。Shannon’s信息指数（I）的变化范围为0.023 4~0.853 7，平均值为0.606 0，最小位点为SAU000,最大位点为SAU00059。多态性信息含量（PIC）的变化范围为0.007 0~0.440 0，平均值为0.298 2，SAU00045的多态性最高，SAU000的多态性最低。观测杂合

度（Obs_Het）的范围为0.000 0~1.000 0，平均为0.659 1，期望杂合度（Exp_Het）的范围为0.007 0~0.546 5，平均为0.375 6。Nei基因多样性指数的变化范围为0.007 0~0.544 6，平均值为0.374 3。各个种质间的遗传相似系数平均为0.960 4（0.443 0~1.000 0），来自徐家堡村的59号栽培黄花菜与参考萱草种质龙游红花之间的遗传相似性系数最小，为0.443 0，它们之间的亲缘关系最远。大同地区的黄花菜种质资源大部分与参考种质大同黄花的遗传相似系数均为1.000 0。

表5 146份萱草属植物种质的遗传多样性分析

Tab.5 Analysis of genetic diversity of 146 germplasms of Hemerocallis

引物名称Primer nameSAU00006SAU00010SAU00029SAU00042SAU00045SAU00047SAU00048SAU00052SAU00059SAU00063SAU000SAU00080SAU00096SAU00097SAU00102SAU00104SAU00120SAU00121平均　Mean

Na/个6.000 07.000 06.000 05.000 03.000 04.000 03.000 05.000 09.000 04.000 02.000 07.000 06.000 06.000 04.000 04.000 05.000 02.000 04.888 9

Ne/个2.099 42.115 82.114 31.119 82.195 71.154 22.053 02.076 62.115 32.027 21.007 12.100 32.113 61.065 22.081 51.065 32.110 91.090 71.761 4

I0.821 00.843 10.830 60.283 10.852 90.307 80.755 80.796 00.853 70.734 00.023 40.828 30.835 50.183 70.788 20.161 30.830 00.178 80.606 0

Obs_Hom0.000 00.000 00.000 00.993 10.069 01.000 00.048 30.041 70.000 00.006 80.993 00.000 00.042 30.958 30.020 70.958 00.034 70.971 00.340 9

Obs_Het1.000 01.000 01.000 00.006 90.931 00.000 00.951 70.958 31.000 00.993 20.007 01.000 00.957 70.041 70.979 30.042 00.965 30.029 00.659 1

Exp_Hom0.474 50.470 80.471 10.2 60.453 50.865 80.485 30.479 70.470 90.491 60.993 00.474 30.471 30.938 50.478 60.938 50.471 90.916 50.624 4

Exp_Het0.525 50.529 20.528 90.107 40.546 50.134 20.514 70.520 30.529 10.508 40.007 00.525 70.528 70.061 50.521 40.061 50.528 10.083 50.375 6

Nei0.523 70.527 40.527 00.107 00.544 60.133 60.512 90.518 40.527 20.506 70.007 00.523 90.526 90.061 20.519 60.061 30.526 30.083 20.374 3

Ave_Het0.523 70.527 40.527 00.107 00.544 60.133 60.512 90.518 40.527 20.506 70.007 00.523 90.526 90.061 20.519 60.061 30.526 30.083 20.374 3

PIC0.410 10.415 60.415 00.105 10.440 00.128 50.394 80.404 30.415 50.385 10.007 00.410 50.415 40.060 70.404 60.060 20.414 70.079 70.298 2

2.4　Structure遗传结构分析

2.4.1　最佳K值判断　基于Structure的计算结果显示，在K值为1~4时，对数似然函数值随着K值的增大而减小（图4）。Rosenberg的方法表示，当对数似然函数值变化趋于缓慢的那个拐点就是最佳K值，即检测分组值与真实K值接近，那么K值为2时与真实K值相接近。

而Evanno的方法是判断对数值的变化率Delta K是否发生了骤变，当K值为2时，其Delta K值较高；而K值为3时，Delta K值骤降，所以K值为2接近于真实K值（图5）。

综合2种方法，K值为2是最佳K值。·670·

图4　对数似然函数值随K值的变化

Fig.4　Change of logarithmic likelihood function

value with K value

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2.4.2　K值为2、3、4时的遗传结构分析　结果显示（图6），当K=2时，146份种质资源可以分为2个类群，以大同黄花（1号）与大荔黄花（4号）为代表的黄花菜类群（红色部分）及以摇篮曲（5号）、儿童节（6号）、海尔范（7号）和龙游红花（8号）为代表的萱草类群（绿色部分）。其中，小黄花（2号）、冲里花1号（3号）以及来自峰峪村的47号、来自贺店村的121号、122号这些种质本属于黄花菜，但是在分群时却偏向于萱草类群， 这可能是因为当K值为2时

图5　Delta K 随K值的变化

Fig.5　The corresponding Delta K for each K value

多态性标记的数量不足，无法对这几个种质进行区分，所以还需要对更高的K值进行分析。

图6　当K值为2、3、4时的STRUCTURE分析结果

Fig.6　STRUCTURE analyses on EST-SSR dataset（K=2，K=3，K=4）

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当K值为3时，与K值为2时的结果相比，小黄花（2号）和冲里花1号（3号）有了明显的区分，以及来自峰峪村的47号、来自贺店村的121号和122号种质资源明显属于以小黄花（2号）为代表的黄花菜类群，但是冲里花1号（3号）在分群时还是更偏向于萱草类群，还需要对更高的K值进行分析。当K值为4时，小黄花（2号）和冲里花1号（3号）与萱草类群有了明显区分。

结合以上3个K值的结果表明，来自峰峪村的

47号、来自贺店村的121号和122号种质资源与小黄花（2号）的遗传结构相似，除这3份种质资源比较特殊外，其余来自大同市云州区的135份种质资源都与大同黄花（1号）在一个类群。2.5　146份萱草属种质的聚类分析

根据18对EST-SSR标记的扩增数据，通过软件计算出146份萱草属种质的遗传相似性系数，并使用UPGMA方法对其进行聚类分析，结果如图7所示。

图7　146份萱草属种质材料的聚类分析

Fig.7　Cluster analysis of 146 germplasm materials of Hemerocallis·672·

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为了检验聚类结果的好坏，用Cophenetic相关性进行分析，结果表明，相关性系数为0.980 97，聚类结果可靠。这146份种质材料在遗传相似系数为0.980 97处可分为黄花菜与萱草两大类群，来源于山西省大同市云州区的138份种质资源全部属于黄花菜类群。包含来自独树村的9号、来自邢庄村的142号等134份大同市云州区的黄花菜种质资源与参考种质大同黄花（1号）聚类在一起；而来自峰峪村的40号和47号以及来自贺店村的121号和122号4份黄花菜种质与参考种质小黄花（2号）聚类在一起（图7）。

SSR分子标记技术与传统的SSR分子标记技术相比，具有开发简单、测序数据范围较广、通用性较好等优点[29]，目前已经被大规模应用在植物基因组的研究中，如种质资源遗传多样性的分析、遗传图谱的构建和功能基因组学研究等[30]。冀芳芳[31]使用EST-SSR分子标记研究了萱草属植物的种质资源遗传多样性，其观测等位基因数、多态性信息含量平均值分别为9.209 3和0.606 4。本试验收集了从大同市云州区33个村落中采集的黄花菜种质以及8个已知来源的萱草属植物，并使用山西农业大学黄花菜种质资源创新与利用课题组前期开发的43对多态性EST-SSR分子标记对其进行扩增，EST-SSR标记表现出了较好的多态性，筛选出的18对EST-SSR标记能够很好地区分待测种质，对146份萱草属植物种质共扩增出8多态片段，平均每对引物扩增出4.条多态片段，多态性信息含量的平均值为0.298 2，这是由于大同地区黄花菜的遗传背景相似，材料遗传变异小，结合基于遗传相似系数矩阵的聚类分析，本试验所收集的134份大同地区黄花菜种质与参考种质大同黄花聚类在一起，证明了这一点。本研究中，分子标记聚类将146份种质资源分为两大类群，每个种质间的遗传相似系数平均值为0.960 4（0.443 0~1.000 0），大同大部分地区的黄花菜种质资源与参考种质大同黄花的遗传相似系数均为1.000 0。黄花菜类群中，134份来自大同市云州区的黄花菜种质资源与参考种质大同黄花聚类在一起，小黄花与2个来自峰峪村和2个来自贺店村的种质聚类在一起；萱草类群中只包含摇篮曲、海尔范、儿童节萱草、龙游红花4个参考种质。小黄花和冲里花1号的遗传相似系数均为0.691 4，4个萱草参考种质之间的遗传相似系数为0.474 4~0.658 5，它们的亲缘关系较远，所以聚在了不同的组中。2009年，黎海利等[3]利用AFLP标记对35份萱草野生种和栽培品种进行了亲缘关系研究，结果显示，同一产地的品种基本可以聚类在一起，与本研究的聚类结果相同，再次表明黄花菜的亲缘关系与其来源地有很大关系。

由遗传结构分析可知，除了峰峪村和贺店村的黄花菜种质与小黄花亲缘关系较近以外，来自大同市云州区的135份种质资源都与大同黄花在一个类群。大同黄花与大荔黄花亲缘关系较近，与小黄花和冲里花1号的亲缘关系较远，这与LI等[13]对于155份萱草属植物的聚类分析结果一致。在K值为2时，小黄花和冲里花1号与萱草类群的遗传结构

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3　 结论与讨论

形态学指标利用表型性状可以最直观、快速地对物种间进行分类和鉴定，是最简单的方法。但是这种方法也存在很大的不足之处，只能区别外形具有明显差异性的植物，且应用范围较小，无法说明真实的遗传变异情况[25]。若某一品种的数量较多或者外形相似度较高时，使用这种方法就难以对其进行区分，容易出现误差。本研究中，由于黄花菜种质之间外形非常相近，所以通过对其表型性状的观测并不能将这些黄花菜种质进行区分，需要通过分子标记技术进行进一步的鉴定分析。根据花蕾的表型性状进行聚类分析，可将大同地区黄花菜资源分为3个组群，形态学聚类与分子标记聚类结果差异较大，造成这种结果的原因可能是由于形态学性状容易受环境影响，并不能对种质材料进行很好地分类。熊雄等[19]曾对大同黄花花蕾的表型性状进行了研究,其花蕾长度的变异系数为5.07%，花蕾宽度的变异系数为7.49%，花蕾鲜质量的变异系数为13.55%。本研究中这3个性状的变异系数均比其高。说明表型性状除了受遗传的影响，环境因素也会发生作用，例如土壤、水肥、气候等。

近年来，随着分子生物学的快速发展，分子标记在萱草属植物中的应用研究逐渐增多。陈志峰[26]用SRAP分子标记技术对17种黄花菜进行了亲缘关系鉴定，多态性条带占总扩增条带数的49.3%，将它们分成了2类5组；郑家祯等[27]借助SCoT分子标记技术将31份黄花菜资源进行了遗传多样性分析并将其分为2类；任阳[28]用形态学性状、SSR分子标记、ISSR分子标记对50份萱草属植物材料进行分类研究，发现2种分子标记技术平均标记的数量与多态性百分比不同，且对这50份材料的聚类结果也有差异。基于转录组测序的EST-

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相似，无法进行区分，这可能是由标记的数量不足而导致。当K值增大后，小黄花和冲里花1号有了明显的区分，这与后边的聚类结果一致。冀芳芳[32]利用EST-SSR分子标记与群体结构分析，在K值为2时，将141份萱草属种质材料分为2个类群。史青青[33]对155份萱草种质材料进行遗传结构分析，在K值为2时将155份萱草种质材料分为黄花菜和萱草两大类群，与本研究聚类结果一致。

结合遗传多样性分析、遗传结构分析和聚类分析结果，可知除了来自峰峪村的40号和47号以及来自贺店村的121号和122号这4份黄花菜种质外，其余134份来自大同市云州区的黄花菜种质资源全部为大同黄花。本研究结果为大同市区域优良种质鉴定及选育提供了理论依据，也为云州区黄花菜产区的品牌保护提供了有力支持。

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