维普资讯 http://www.cqvip.com 目 ２００７，Ｖｏ１．２４ Ｎｏ．７亿亏与生物互程 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｙｃｏｉｄｅｓ磷脂酶Ｃ部分特性研究 王常高 。刘彦昌 。干信 。陈 涛。 （１．湖北工业大学生物工程学院湖北省工业微生物重点实验室，湖北武汉４３００６８； ２．中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉４３００７１） 摘 要：对一种纯化自Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ９７０发酵上清液的磷脂酶ｃ的部分特性进行了研究。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表 明该纯化磷脂酶Ｃ由一条多肽链组成，分子量为７５、ｌ ｋＩ）ａ。热稳定性实验表明该纯化磷脂酶Ｃ对温度敏感，具有热不 稳定性。金属离子依赖性检测表明该纯化磷脂酶Ｃ属于金属磷脂酶Ｃ家族，Ｃａ”、Ｍｇ 、Ｚｎ”和Ｂａ 对该磷脂酶Ｃ催 化活性的发挥必不可少。血平板及卵黄平板检测表明该磷脂酶ｃ没有溶血活性和卵磷脂酶活性。 关键词：磷脂酶Ｃ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ；特性 中图分类号：Ｑ ５５６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２～５４２５（２００７）０７—００５２—０３ 磷脂酶Ｃ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ，ＰＬＣ）是一类水解甘 油磷脂甘油磷酸脂键的脂类水解酶ｌ１］。微生物、动物 及植物细胞都可合成ＰＩ Ｃ。微生物ＰＩ Ｃ的作用机制 得到了广泛深入的研究 ）。同时，微生物ＰＬＣ也被用 外可见分光光度计，恒温水浴锅，牛津杯。 １．２ ＰＬＣ活力的测定 采用ＮＰＰＣ法 。以ＮＰＰＣ作为ＰＩ Ｃ作用底 物，水解产物对硝基苯酚是一种黄色物质，在４１０ Ｄｍ 处有最大吸收。在ｐＨ值７．２、３７℃条件下，每分钟催 化１ ｎｍｏｌ ＮＰＰＣ水解的酶量定义为一个酶活单位。 １．３ ＰＬＣ分子量的测定 采用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ法。 １．４ ＰＬＣ热稳定性的测定 作探针用于细胞膜结构的研究 ］。此外，微生物ＰＬＣ 因其在结构上与动物ＰＩ Ｃ具有一定的相似性而常被 用作工具酶或模型以探讨动物ＰＩ Ｃ在细胞信号传导 及细胞代谢与中的重要作用 ］。目前，关于微生 物ＰＩ Ｃ在食品加工、油脂精炼、化妆品及药品生产等 的应用已引起广泛关注，但目前还没有商业化的工业 用ＰＬＣ制剂生产 ］。为研究开发微生物ＰＬＣ在不 同工业领域中的应用，作者从１０００多份土壤样品中筛 将纯化的ＰＩ Ｃ样品用ｐＨ值７．０、２０ ｍｍｏｌ・Ｉ 的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液稀释至４０ Ｕ・ｍＩ ，分别在不 同温度的水浴中处理５ ｍｉｎ，ＮＰＰＣ法检测各酶样保留 的酶活力。 选出了４株高产ＰＩ ｃ菌株，对其进行初步的分类鉴 定ｌ８州后，对其中一株高产ＰＩ Ｃ菌株——Ｂ吖 “ ｍｙ— ｃｏｉｄｅｓ９７０经过发酵所产ＰＩ （：的部分特性进行了研 究，从而为今后ＰＩ Ｃ的应用研究打下基础。 １．５ ＰＬＣ金属离子依赖性的检测 将纯化的ＰＩ Ｃ样品用ｐＨ值７．０、２０ ｍｍｏｌ・Ｉ Ｔｒｉｓ—ｔｆＣ１缓冲溶液稀释至４０ Ｕ・ｍＩ ，加入１ ｍｍｏ［ ・ｌ 实验 １．１材料、试剂及仪器 Ｉ 一ＥＤＴＡ，混匀处理５ ｍｉｎ，超滤，并用ｐＨ值７．０、 ２０ ｍｍｏｌ・Ｉ 的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液洗滤１～２次，以 除去ＥＤＴＡ及其金属离子螯合物。再分别加人１ ｍｍｏｌ・Ｉ 的不同金属阳离子，ＮＰＰＣ法检测各酶样 品所恢复的酶活力。 ＰＬＣ样品：从Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｌ＂ｄｅｓ９７０发酵上清液 中经过多步分离所得纯化样品，纯度经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检 测为一个条带，比活力为１５ ３７０ Ｕ・ｍｇ一。 ＥＤＴＡ、对硝基苯磷酸胆碱（ＮＰＰＣ）、ＰＩ Ｃ标准品 （ＴｙｐｅⅣｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＣｅＹ￣ＵＳ），Ｓｉｇｍａ公司。 １．６ ＰＬＣ溶血活性及卵磷脂酶活性的检测 溶血活性测定采用血平板（含有５ 洗涤人红细 胞的２ 琼脂平板）法。卵磷脂酶活性测定采用卵黄 平板（含有２ 卵黄液的２ 琼脂平板）法。分别取 １００ Ｌ ｐＨ值７．０、２Ｏ ｍｍｏｌ・Ｌ 的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶 Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ一１５型超滤离心管（ＭＷＣＯ １０ ０００， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ），Ｉ Ｄ５－１０型离心机，ＵＮＩＣ０ ＵＶ－２Ｏ０Ｏ型紫 基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（２００４ＡＢＡ２３３），湖北省教育厅项目（Ｂ２００５１４００６），湖北工业大学科技项目（ＺＺ２００３０３） 收稿日期：２００７—０３—３０ 作者简介：王常高（１９７１一），男。湖北监利人，副教授，主要从事酶制剂的制备及应用研究。Ｎ－ｍａｉｌ：ｗｃｇＴ１４１ ５＠１６３．ｃｏｉｎ。 维普资讯 http://www.cqvip.com 王常高等：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｙｃｏｉｄｅｓ磷脂酶ｃ部分特性研究／２００７年一７阻 国 液、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ９７０发酵上清液、ＰＬＣ纯化浓缩 样品，尤其是浓度低时，具有热不稳定性。 样品（２０００ Ｕ・ｍＬ ）和ＰＬＣ标准品加入到放置在血 平板或卵黄平板上的牛津杯中，３７℃孵育２０ ｈ。卵黄 ＼ 平板上乳白色晕圈的大小表示卵磷脂酶活性的高低， 血平板上透明圈的大小表示溶血活性的强弱。 翅 谧 霞 熏 翌 ２结果与分析 ２．１ ＰＬＣ的分子量 ０ ２０ ４０ ６０ Ｕ ｌＵＵ 将ＰＬＣ纯化样品与蛋白质Ｍａｒｋｅｒ在同一条件下 温度ＦＣ 进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，结果见图１。根据蛋白质Ｍａｒｋｅｒ中 图３温度对ＰＬＣ酶活力的影响 各标准蛋白对溴酚蓝的相对迁移率与各标准蛋白分子 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＰＬＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ 量的对数绘制标准曲线，结果见图２。根据ＰＬＣ纯化 ２．３ ＰＬＣ的金属离子依赖性 样品对溴酚蓝的相对迁移率，利用标准曲线即可推算 纯化的ＰＬＣ样品用ＥＤＴＡ处理，经过洗滤后分 出该纯化ＰＬＣ样品的分子量为７５．１ ｋＤａ。 别加入不同的金属离子，酶液所恢复的酶活力见表１。 ｐＴ Ｍａｒｋｅ ９７ ４００Ｄａ 表１ ＰＬＣ的金属离子依赖性／％ ６６ ２００Ｄａ Ｔａｂ．１ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ＰＬＣ ｏｎ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ／％ ４３ ０００Ｄａ 处理 相对酶活力 处理 相对酶活力 ＣｏｎｔｒｏＩ １Ｏ０ ＭｎＳＯ４ ４６．４ ＥＤＴＡ ０ ＳｎＣ１２ １．４ ＣａＣ１２ ７７．７ ＣｕＳＯ４ ４．５ ２Ｏ１００Ｄａ ＭｇＣ１２ ７９．５ ＦｅＣｌ３ ３．８ １４ ４００Ｄａ ＺｎＣ１２ ８１．５ ＡｌＣｌ３ ２．４ ＢａＣ１２ ８０．３ 浓缩胶：３ ，ｐＨ值６．８；分离胶：ｌ０ ，ｐＨ值８．９ 样品采用２～巯基 乙醇进行还原，同时在沸水浴中煮沸５ ｒａｉｎ；蛋白条带采用考马斯亮 从表１可以看出，当酶液中加入ＥＤＴＡ后检测不 蓝Ｒ一２５０染色。 到任何的ＰＬＣ活力，表明该纯化的ＰＩ Ｃ属于金属磷 图１ ＰＬＣ样品的ＳＤｓ．ＰＡＧＥ图谱 脂酶Ｃ家族，其催化活力的发挥有赖于金属离子的存 Ｆｉｇ．１ ＳＤ ＰＡＧＥ ｏｆ ＰＬＣ ｓａｍｐｌｅ 在，而不同的金属离子对该ＰＬＣ活性发挥的作用也不 一样。Ｃａ抖、Ｍｇ 、Ｚｎ 和Ｂａ抖对该ＰＬＣ催化活性 的发挥必不可少，Ｆｅ”、Ｓｎ抖、Ｃｕ抖和Ａｌ”不能使该 ＰＬＣ发挥催化活性，而Ｍｎ抖可使该ＰＬＣ表现出部分 的催化活性。 ２，４ ＰＬＣ的溶血活性及卵磷脂酶活性（图４） 图２分子量与相对迁移率标准曲线 Ｆｉｇ．２ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ２．２ ＰＬＣ的热稳定性 卵黄平板 血平板 纯化的ＰＬＣ样品在不同温度下处理５ ｍｉｎ后保 １号样品为Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ９７０的发酵上清液，２号样品为ｐＨ值 留的酶活力见图３。从图３可以看出，当温度低于 ７．０、２Ｏｍｍｏｌ・Ｉ 的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液，３号样品为纯化的ＰＩ Ｃ，４ ４０℃时，ＰＬＣ酶活基本不受温度的影响。但当温度高 号样品为ＰＩ Ｃ标准品 图４ 溶血活性及卵磷脂酶活性检测结果 于４０℃时，酶活力随温度的上升逐渐下降。当温度达 Ｆｉｇ．４ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｄ ｌｅｃｉｔｈｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ 到７０℃时，酶已全部失去活性。这说明纯化的ＰＩ Ｃ 维普资讯 http://www.cqvip.com 圈 王常高等：Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｙｃｏｉｄｅｓ磷脂酶Ｃ部分特性研究／２００７年一７啊 从图４可以看出，作为对照的ＰＬＣ标准品具有明 显的溶血活性和卵磷脂酶活性。而该纯化的ＰＬＣ既没 有溶血活性，也未表现出卵磷脂酶活性。但Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ９７０的发酵上清液却表现出一定的溶血活性和 卵磷脂酶活性，表明Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ９７０至少可以分 泌两种不同的ＰＬＣ至胞外培养液中。一种ＰＩ Ｃ具有溶 血活性和卵磷脂酶活性，另一种ＰＬＣ没有溶血活性，同 时也没有卵磷脂水解活性。该纯化的ＰＬＣ属于后者。 ３ 结论 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表明该纯化的ＰＬＣ由一条多肽 链组成，这与其它微生物ＰＬＣ的组成一致。其分子量 与其它芽孢ＰＬＣ的分子量明显不同，但与铜绿假单胞 板上定 一 清性的 沁 。应弩 Ⅲ 嘲 嘲 啪 嘲 嗍 菌ＰＬＣ的分子量非常接近。热稳定性实验表明该纯 化的ＰＩ Ｃ对温度较敏感，其热稳定性除了受温度的影 响外，还与ｐＨ值、离子组成、浓度及纯度等因素有关。 金属离子依赖性实验表明该纯化的ＰＬＣ属于金属磷 脂酶Ｃ家族。除Ｚｎ抖被认为是绝大多数金属磷脂酶 Ｃ发挥催化活性所必不可少的之外，Ｃａ 、Ｍｇ。 和 Ｂａ抖也可激活该ＰＩ Ｃ的催化活性。 ＮＰＰＣ是磷脂酰胆碱（卵磷脂）的结构类似物。该 纯化ＰＩ Ｃ样品具有非常高的ＮＰＰＣ水解活性，但却未 表现出任何卵磷脂水解活性，说明ＰＬＣ不仅仅是靠磷 酸极性头部来识别作用底物，碳氢链疏水尾部对于 ＰＬＣ底物的识别同样具有不可或缺的作用。 溶血实验表明该纯化ＰＩ 样品不具有溶血活性。 尽管有许多微生物ＰＬＣ表现出明显的溶血活性，但关 于ＰＬＣ的溶血机制目前尚无定论。一种假说认为是 外源性ＰＬＣ先作用于红细胞表面膜，作用产物激活了 红细胞自身的ＰＬＣ及其它的酶类，使红细胞自溶而表 现出溶血活性。实验中发现牛津杯中的发酵上清液和 ＰＬＣ标准品溶液已全部渗入平板中或蒸发掉，但血平 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｓｏｍｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰｈＯｓｐｈ０ｌｉｐａｓｅ Ｃ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｇａｏ ，ＬＩＵ Ｙａｎ—ｃｈａｎｇ ，ＧＡＮ Ｘｉｎ ，ＣＨＥＮ Ｔａ （１．Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂ ｏＰ”ｇ ”ｅＰｒ ”ｇ，Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００６８，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｗｕｈａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００７１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ（ＰＬＣ）ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ９７０ ａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｔｈｅ ＰＬＣ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｐｅｐｆｉｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｉｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ７５．１ ｋＤａ ｂｙ ｔｈｅ ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ ＰＩ Ｃ ｉｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｓ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ．Ｔｈｅ ＰＬＣ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｈｏｓｐｈｏ— ｌｉｐａｓｅ Ｃ ａｎｄ Ｚｎ ．Ｃａ ．Ｍｇ ａｎｄ Ｂａ。 ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｔｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｓ ｎｏ ｌｅｃｉ— ｔｈｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｇａｒ ａｎｄ ｎｏ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ；ｐｒｏｐｅｒｔｙ
