分子生物学实验设计
彭杰 2012141241104
摘 要：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein^GFP)是源F海洋生物多管水母属 (aequoia
victoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光激发卜一发岀绿色荧光, 能在活细胞
内稳左表达，本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒 纯化质粒，采用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好 的感受态细胞中，使得工程菌DH5a转化成具有抗氨节青霉素的大肠杆菌，并表达绿色荧光蛋 白，接种于加氨节青霉素的LB培养基上，筛选阳性克隆。
实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21 实验材料: (一)仪器
2、 恒温摇床 3、 恒温水浴 5、隔水式培养箱 7、台式高速离心机 9、高压灭菌锅 11>机
2、低温离心机 4、超净工作台
6、琼脂糖凝胶电泳仪系统 8、凝胶成像系统(Dark Reader)
10、10、100、1000 uL微量移液器各一支 12、恒温培养箱
13、 PCR热循环仪 14、漩涡混合器
(二) 材料
1、 少量含PEGFP-N3和pET・28a质粒的菌液 2、 酶 BamH I 51 - G^GATCC • 3’一 5' G
3'- CCTAG 个G -51 — 3' CCTAG
3、 酶 Not I
S'-GC^GGCCGC- S'^S^-GC GGCCGC-31 3'・・・CGCCGG 个 CG-bK-CGCCGG
4、 0. 2mL EP 管架 5、 1.5ml塑料离心管 6、 一次性手套
7、 大肠杆菌DH2a和BL21
8、 氯化钙 氢氧化钠 乙醇氯仿 蔗糖 硼酸 9、乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 三疑甲基氨基甲烷(Tris) 11、 氨节青霊素 22、浪酚蓝
13、 PCR产物快速胶回收试剂盒 14、 dNTP混合物 15、 引物对(正反向引物) 16、 Ex-Taq 酶 「DNA 连接酶 17、 酵母提取物 胰蛋白腺 氯化钠
18、 小指管.吸头、培养皿.三角瓶、试管等
CG …51 GATCC 31
G 51
(三) 试剂
• 1> LB 培养液:胰蛋白丿冻(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g, NaCl5g, 琼脂(固体培
养基)15g,用IN NaOH调pH 7.5。
2、溶液【:50mmol/L 匍萄糖，lOmmol/ EDTA-Na, 25mmol/L Tris-HCl (pH8・ 0) 作用：分散细
胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解
3、 溶液 II: 0.4mol/L NaOH , 2%SDS 临用前 1: 1 配制
作用：纽I胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性
4、 溶液III： 5mol/L醋酸钾60m 冰醋酸11. 5ml双蒸水28. 5ml
作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上淸液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS 复合物等发生沉淀
5、 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25： 24： 1 ）
作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是
DNA在上淸中。异戊醇防止抽提液起泡。
・6、Gold view （DNA染料） 0.5XTBE缓冲液
• 7、ddZO, lOxbuffer
8、5 X TBE （5倍体积的TEB贮存液）lOOOmL
上样缓冲液（6x）
Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA（Ph8.0） 20pL
9、RTE
将 RNA 酶溶于 lOnunol/L Tris-HCl （Ph7. 5）、15 mmol/L NaCl 中，配成 lOmg/Ml 的浓度，于100°C加热15min,缓慢冷却至室温，10000r/min禽心5min,上淸液于 —20«保存。
10x凝胶加样缓冲液（10x loading buffer）
浪酚蓝 0.4% 蔗糖60%
11、 2. 5mmol/L dNTP 混合物 lU/pLTaq 酶 10X PCR buffer（含镁离子）
12、 200mg/niL IPTG:取2gIPTG溶于8mL双蒸去离子水中，再用水补至10mL,用 0.22pm滤
膜过滤除菌，每份5L,贮存于一20。6
*IPTG作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用
实验步骤：
（-）质粒DNA的提取：（两种质粒分别在两个EP管中操作）
1、 将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌分别接种在液体培养基中（加氨节 青
恁素50pg/mL）, 37°C培养过夜。
2、 取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中,10000rpmx2min,弃上淸液 3、 加入lOOpiL溶液I,漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 mine
4、 加入200\"新配制的溶液1【，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放K5minu
5、 加入250从冰冷的溶液【II,加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰 上放置
15 mine
6、 lOOOOrpmx 5 min,取上淸液于另一干净的离心管中。
7、 向上淸液中加入等体积（约400|iL）酚/氯仿/异戊醇＜25:24:1, v/v）,振荡混匀, lOOOOrpm x 10 min,将上淸液转移至新的离心管中。
*、饱和酚（取下层）单独吸200\氯仿：异戊醇（24： 1）吸200从。
8、 加入等体积（约370RL）氯仿/异戊醇（24:1）,混匀，离心2min,取上淸液于新 离心
管中
9、 向上淸液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20吒放置lh
10、12000rpmx5min,倒去上淸液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11，加0.8mL70%乙醇，离心lmin,倒去上淸液，真空抽干或室温自然干燥30mino 12、加 30pL dcHO （或 20pL RTE 溶解 DNA）, -20°C 保存备用。
*制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II和II 以避
免机械剪切力对DNA的断裂作用。
（二）质粒DNA的琼脂凝胶电泳
1、 制备琼脂糖凝胶
称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL0.5XTBE缓冲液，微波炉加热直至 琼脂糖溶解。待胶液冷却到65°C （不烫手为宜）,加入1RL Gold view混匀,搅拌器 上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。 静置
30min左右，轻轻晃动拔出梳子 2、 加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入0.5XTBE缓冲液淹没过胶板1mm, 用取液器将提取的质粒DNA5|iL与lpL Loading Buffer （ 6x ）混匀,加入胶板的样 品小槽内。
3、 电泳
将电泳槽与电泳仪接通，调肖电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动 到距离胶板边沿约l~2cm处，停止电泳。
4、 观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调肖位置居中，波长为254nm的紫外 灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。 （三）DNA性内切酶酶切
1、 分别去两支0.2mlEP管做上记号：如①② 2、 两个EP管中分别配置下列的30 M体系 ®EP 管
BSA3pL lOxbuffer 3pL EP 管
BSA3pL
Bam^ I 2pL
Not I 2pL
pET-28a 20pL
②
lOxbuffer 3pL Bam^ I 2pL Not I 2pL pEGFP-N3 20pL
3、 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37°C酶切3h。
4、 取5uL ®②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳 检测酶切
结果。
5、 按照回收试剂盒步骤切胶回收所需酶切产物片段。
（四） 质粒DNA的连接
1、 在EP管中分别配置下列的体系0. 2ml
10xbuffer2pL 酶切后的 pET-28a X|iL 酶切后的 EGFP YpL T4DNA 连接酶 2\" X:Y=l:3~i:10,用
水补足 20pL
2、 EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱16°C反应过夜后，-20°C下保存用于 转化。
（五） 感受态的细胞制备
1、 从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落于3mlLB试管中，37°C振荡培养过夜。 2、 取400』菌液转接到40mlLB液体培养基中，37。振荡培养2h~3h。（此时,Aeoo 应在0.4-0.5之间，细胞数务必V 108/ml,此为感受态细胞制备成功的关键）。 3、 将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。 4、 4°C 离心 10min（4000/min）o
5、 倒岀培养液，将管口倒置以便培养液流尽。
6、 用冰冷的0. lmol/L CaCl 10mL悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min。 7、 4°C 离心 10min（4000/min）o
8、 倒出上淸液，用冰冷的0. lmol/L CaCl 2mL悬浮细胞（务必放在冰上）。 9、 分装细胞，每200RL -份。此细胞为感受态细胞。
（六） 重组DNA的转化
1、取出感受态细胞DH5a让苴在冰上自然解冻，每200|iL解冻的感受态细胞加入整 管
连接产物，混匀后冰浴30minu
2、 42叱热冲击60秒,立即置于冰浴5mino
3、 再在感受态细胞混合物中加入0.8mL的LB培养基，于37。（2摇床中培养 4、 lh后，6000r/min离心3min,去掉上淸（约留200PL的培养液），摇匀菌块。 5、 用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固体培养基上，正宜培养皿半小时
后，37七培养箱中倒宜培养皿过夜。
6、 第二天早上观察结果。
（七） 重组子的鉴定
1、 从固体培养基上挑取重组单菌接入含kana的LB液体培养基中，37°C振荡培养过
夜。
2、 按实验一的方法提取质粒DNA, 20pL RTE溶解DNA沉淀。 3、 双斷切质粒DNA,同实验三。
4、 1%琼脂糖凝胶电泳监测重组质粒和它的酚切产物。
（八） 菌落PCR技术扩增目的基因片段
1、 在0. 2mL EP管内配制25 nL PCR反应体系1个：
ddH：0 18. 5 uL 10 XBuffer 2. 5 u L MgCl： 1. 5 u L Taq 酶 o. 5uL 4XdNTP luL 引物1
3、 放入PCR仪中，设置反应程序：
©94 °C 预变性 5min：
0.5uL引物2 0.5 u L 菌落挑一个
2、 用灭菌头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心。
② 94 °C变性30S： ③ 55 °C退火30S： ④ 72 °C延伸60S； ⑤ 重复步骤②~@>30次： ⑥ 72 °C 延伸 lOmino
4、 取9 UL反应液加1 uL10 X loading Buffer做电泳检测，分析所得目的片段 的大小。
（九） 阳性重组质粒转化表达菌株BL21
1、 感受态细胞BL21的获取，同实验五。
2、 取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200 uL解冻的感受态细胞加入 5uL
pET-28a-EGFP 质粒，混匀后冰浴 30min。 3、 42°C热冲击90秒,立即置于冰浴5mino
4、 再将感受态细胞混合物转入0.8mL的LB培养基，于37°C摇床中培养lh。期间将 200 UL的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用。
5、 lh后，6000r/min离心5min,去掉上淸（约留200 uL的培养液），摇匀菌块。 用玻璃
涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养 皿半小时后，37°C培养箱中倒置培养皿过夜。
6、 第二天早上观察结果。
参考资料：
1、 曲萍隋延仿叶苦张秀敏增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白
纯化 临床研究2006. 10
生命科学
1999. 4
2、 张峰任燕陆长徳 绿色荧光蛋白及其用
3、 唐金宝吉爱国梁浩朱鹏金建玲赵越卢雪梅高培基 蛋白A—增强型绿色
荧光蛋白融合基因的构建、表达生物技术与糖工程
4、 魏群分子生物学实验指导第二版
2005
