一种荧光染色液及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112461630 A(43)申请公布日 2021.03.09

(21)申请号 202011241676.1(22)申请日 2020.11.09

(71)申请人 深圳市梓健生物科技有限公司

地址 518000 广东省深圳市南山区西丽街

道塘朗同富裕工业城6号厂房601(72)发明人 马力敏　杨海芳　赵起卿　(74)专利代理机构 北京维正专利代理有限公司

11508

代理人 任志龙(51)Int.Cl.

G01N 1/30(2006.01)G01N 1/28(2006.01)

权利要求书1页 说明书9页 附图2页

(54)发明名称

一种荧光染色液及其应用(57)摘要

本申请涉及荧光染色技术领域，具体公开了一种荧光染色液及其应用。其中，荧光染色液由以下原料制成：荧光剂、缓冲溶液、防腐剂、水。本申请的荧光染色液可用于对人体分泌物或体液的上皮细胞、白细胞、细菌、真菌、寄生虫进行染色，其具有提高微生物检出率，降低漏诊率和误诊率的优点。

CN 112461630 ACN 112461630 A

权　利　要　求　书

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1.一种荧光染色液，其特征在于，所述荧光染色液由以下原料制成：荧光剂、缓冲溶液、防腐剂、水。

2.根据权利要求1所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液由以下原料制成：

荧光剂   1.8-2.7g/L缓冲溶液 9-11g/L防腐剂   0.2-0.5 mL/L；还包括水。

3.根据权利要求2所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液由以下原料制成：

荧光剂   2.1-2.4g/L缓冲溶液 9.7-10.5g/L防腐剂   0.2-0.4mL/L；还包括水。

4.根据权利要求1所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光剂包括SYBR Green I、碘化丙啶、吖啶黄、光神霉素、派若宁Y、奎纳克林芥子、赫斯特33258、沉香磷化氢、硫代黄素T和樱草素中的一种或多种的组合物。

5.根据权利要求4所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液还包括甲基绿、果绿和亮绿中的一种或多种的组合物。

6.根据权利要求5所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液由以下原料制成：

SYBR Green I 1-1.5g/L碘化丙啶     0.8-1.2g/L缓冲溶液     9-11g/L防腐剂       0.2-0.5mL/L甲基绿       0.2-0.5mL/L；还包括水。

7.根据权利要求1所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液应用于人体分泌物或体液。

8.根据权利要求7所述的一种荧光染色液，其特征在于：所述荧光染色液用于对上皮细胞、白细胞、细菌、真菌、寄生虫进行染色。

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一种荧光染色液及其应用

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技术领域

[0001]本申请涉及荧光染色技术领域，更具体地说，它涉及一种荧光染色液及其应用。背景技术[0002]病原微生物是一类可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，也称病原体。病原体的家族非常庞大，包括细菌、真菌、寄生虫、病毒等等。

[0003]不同的病原微生物侵犯并感染人体后容易引起不同的疾病，比如致泻性大肠杆菌容易扰乱人体肠道平衡，引起腹泻；沙门氏菌侵入人体上皮细胞后，会使人体出现恶心、呕吐的症状，引起肠炎；溶血性链球菌在人体呼吸道大量的繁殖会造成人体咽痛、发热而罹患扁桃体炎；假丝酵母菌和滴虫是人体阴道易感致病菌，容易寄生于人体阴道内，导致阴道菌群失调，从而引起阴道炎；隐孢子虫可寄生在人体呼吸道、肺脏等多个器官，使人体出现腹痛、腹胀的症状，造成人体腹泻。可见，病原微生的存在会对人体身体健康造成一定影响，存在安全隐患，因此检测病原微生物、及时发现病原微生物很重要。[0004]传统的病原微生物检测方法包括直接涂片法，其通过将微生物固定在载玻片上，然后将载玻片放置在显微镜下进行观察，来检测微生物。[0005]针对上述中的相关技术，发明人认为传统的直接涂片法的放大倍数相对较低，而霉菌芽生孢子等的体积很小，容易误认，并且当玻片不洁时，微生物更加难以辨认，于是导致微生物检测时容易漏诊或误诊。

发明内容

[0006]为了提高微生物的检出率，本申请提供一种荧光染色液及其应用。[0007]第一方面，本申请提供一种荧光染色液，采用如下的技术方案：

一种荧光染色液，所述荧光染色液由以下原料制成：荧光剂、缓冲溶液、防腐剂、水。[0008]通过采用上述技术方案，本申请的荧光染色液通过荧光基团结合细胞和微生物的DNA和RNA，使染色剂对细胞和微生物进行特殊染色，然后利用荧光显微镜，使细胞和微生物在特定波长的激发光下显示出颜色，从而达到观察微生物、检测微生物的目的。相比传统的直接涂片法，本申请的荧光染色液通过荧光将微生物与背景区分开，使微生物清晰可见，更加容易辨认，方便观察与评价，具有提高检出率，降低漏诊率和误诊率的效果。此外，本申请的荧光染色液的使用步骤简洁，耗时短，操作便捷，微生物的检测过程更加简化。[0009]优选的，所述荧光染色液由以下原料制成：

荧光剂   1.8-2.7g/L缓冲溶液 9-11g/L防腐剂   0.2-0.5 mL/L；还包括水。

[0010]通过采用上述技术方案，经测试，当荧光剂、缓冲溶液、防腐剂的用量控制在上述范围内时，背景更弱，荧光强度更好，染色更清晰，并且无非特异性着色，镜下细胞和微生物

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更加明显，因此微生物的观察更加方便。[0011]优选的，所述荧光染色液由以下原料制成：

荧光剂   2.1-2.4g/L缓冲溶液 9.7-10.5g/L防腐剂   0.2-0.4mL/L；还包括水。[0012]优选的，所述荧光剂包括SYBR Green I、碘化丙啶、吖啶黄、光神霉素、派若宁Y、奎纳克林芥子、赫斯特、沉香磷化氢、硫代黄素T和樱草素中的一种或多种的组合物。[0013]通过采用上述技术方案，上述荧光剂均为常见的核酸荧光染料，与DNA、RNA有强的亲和性，能够嵌入核酸分子内，从而对核酸分子进行标记，实现对DNA、RNA的特殊染色。同时，上述核酸荧光染料染色效果好，获取容易，使用方便，均适用于对细胞和微生物进行染色。

[0014]优选的，所述荧光染色液还包括甲基绿、果绿和亮绿中的一种或多种的组合物。[0015]通过采用上述技术方案，甲基绿、果绿、亮绿具有染色的作用，通过在荧光染色液中添加甲基绿、果绿、亮绿，能够增强细胞的显色效果，使得细胞结构的染色更清晰。[0016]优选的，所述荧光染色液由以下原料制成：

SYBR Green I 1-1.5g/L碘化丙啶     0.8-1.2g/L缓冲溶液     9-11g/L防腐剂       0.2-0.5mL/L甲基绿       0.2-0.5mL/L；还包括水。[0017]第二方面，本申请提供一种荧光染色液的应用，采用如下的技术方案：

上述方案中所述的一种荧光染色液，所述荧光染色液应用于人体分泌物或体液。[0018]通过采用上述技术方案，将荧光染色液应用于人体分泌物或体液，使荧光染色液能够适用于人体宫颈脱落细胞、阴道分泌物、唾液、痰液等各种分泌物或体液样本，适用范围更广。

[0019]优选的，所述荧光染色液用于对上皮细胞、白细胞、细菌、真菌、寄生虫进行染色。[0020]通过采用上述技术方案，本申请的荧光染色液能够同时检测细菌、真菌、寄生虫等多种微生物，检测效率更高，实用性更高，并且检测结果清晰，检出率更高。[0021]综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请的荧光染色液通过荧光基团结合细胞和微生物的DNA和RNA，使染色剂对细胞和微生物进行特殊染色，然后利用荧光显微镜，使细胞和微生物在特定波长的激发光下显示出颜色，从而达到观察微生物、检测微生物的目的。相比传统的直接涂片法，本申请的荧光染色液通过荧光将微生物与背景区分开，使微生物清晰可见，更加容易辨认，方便观察与评价，具有提高检出率，降低漏诊率和误诊率的效果。[0022]2、本申请的荧光染色液的使用步骤简洁，耗时短，操作便捷，微生物的检测过程更加简化。[0023]3、本申请的荧光染色液利用较少的原料，通过控制原料的用量，使原料间相互配

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合，达到好的显色效果，使检测结果更加准确，检出率更高。[0024]4、本申请的荧光染色液能够适用于人体宫颈脱落细胞、阴道分泌物、唾液、痰液等各种分泌物或体液样本，并且能够同时检测细菌、真菌、寄生虫等多种微生物，适用范围更广，检测效率更高，实用性更高。附图说明

[0025]图1是本申请实施例1的细菌检测试验中金黄色葡萄球菌在荧光显微镜下放大40倍的检测结果图。

[0026]图2是本申请实施例3的细菌检测试验中白色念珠菌在荧光显微镜下放大40倍的检测结果图。

[0027]图3是本申请实施例3的滴虫检测试验中滴虫在荧光显微镜下放大100倍的检测结果图。

[0028]图4是本申请实施例6的临床试验中滴虫、鳞状上皮细胞和球菌在荧光显微镜下放大40倍的检测结果图。

具体实施方式

[0029]以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。[0030]病原微生物的存在威胁人体健康，因此检测病原微生物、及时发现病原微生物很有必要。直接涂片法是一种传统的病原微生物检测方法。然而，传统的直接涂片法放大倍数相对较低，微生物不易被辨认，导致微生物检测时容易漏诊或误诊，从而给微生物的检测带来障碍。

[0031]为了解决该问题，本申请人对微生物的检测进行了大量研究，结果发现染色液的原料对检出率具有一定影响。[0032]基于该发现，本申请人对染色液的原料进行了大量研究，以图找到能够提高微生物检出率的方法。结果，本申请人发现，使用荧光染色液进行检测微生物，就能够对微生物进行染色，将微生物与背景区分开，使微生物更加容易辨认，提高检出率，从而成功解决了本申请所要解决的技术问题。此外，通过控制原料的用量，以及添加甲基绿等能够进一步增强显色效果，使检测效果更好。本申请正是基于上述发现做出的。[0033]以具体实施例作具体说明，选用原料由市场购买获得或用常规方法制得，其中：

Sybr Green I选自Sigma，CAS号：163795-75-3，纯度：10000×in DMSO；碘化丙啶选自Sigma，CAS号：25535-16-4，分子量：668.39，纯度：≥94.0%(HPLC)；乙酸选自国药集团化学试剂有限公司，CAS号：-19-7，分子量：60.05，纯度（AR）：≥99.5%；

乙酸钠选自国药集团化学试剂有限公司，CAS号：127-09-3，分子量：82.02，纯度（AR）：≥99.0%；

Proclin300选自Sigma，pH值：4.1在100g/L；甲基绿选自麦克林，CAS号：7114-03-6；分子量：653.24；纯度（AR）：85%。

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实施例

实施例1

实施例1公开一种荧光染色液，由以下原料制成：荧光剂、缓冲溶液、防腐剂，其各原料的种类如表1所示，原料的配比如表2所示。荧光染色液还包括纯化水，加纯化水至体系为1L。其中，缓冲溶液包括8.2g乙酸，其余为乙酸钠，防腐剂为Proclin 300。[0035]按照配比称取上述各原料，将各原料加入水中，搅拌混匀，即得荧光染色液。[0036]实施例2-5

实施例2-5公开一种荧光染色液，其原料的种类与实施例1相同，不同之处在于原料的配比，具体配比见表2。[0037]实施例6-12

实施例6-12公开一种荧光染色液，其原料的种类见表1，原料的配比见表2。[0038]表1 实施例1-12的荧光染色液的原料配比

[0034]

表2 实施例1-12的荧光染色液的原料种类

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对比例对比例1

对比例1公开一种荧光染色液，包括A液和B液。A液包括SYBR Green I 2.5mL、PerCP 2.5mg、甲基绿10mg、乙酸60g、乙酸钠2.5g、Proclin 300 1g，还包括纯化水，加纯化水至体系为1L。B液包括无水磷酸二氢钠10g、十二水合磷酸氢二钠30g、氢氧化钠1g、甘油10g、Proclin 300 1g，还包括纯化水，加纯化水至体系为1L。[0039]荧光染色液的制备方法为：

精密分析天平称取配方量的乙酸钠，加入配方中所述质量纯化水溶解。溶解后加入配方量的乙酸溶液，混合均匀。依次加入配方量的甲基绿、Sybr Green I、PerCP、Proclin 300。所以试剂加入完毕后，将混合溶液持续搅拌至完全溶解，分装至干净容器中避光保存，得到A液。

[0040]精密分析天平称取配方量的十二水合磷酸氢二钠，加入配方中所述质量纯化水溶解。溶解后加入配方量的无水磷酸二氢钠，混合均匀。依次加入配方量的氢氧化钠、甘油、

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Proclin 300。所有试剂加入完毕后，将混合溶液持续搅拌至完全溶解，分装至干净容器中保存，得到B液。[0041]对比例2

对比例2公开一种荧光染色液，包括荧光增白剂28 1mg、异硫氰酸荧光素异构体I 2mg、PerCP 1mg、磷酸二氢钠0.3g、磷酸氢二钠1.5g、丙三醇5mL、Proclin 300 0.3g，还包括纯化水，加纯化水至体系为1L。

[0042]荧光染色液的制备方法为：向烧杯中加入500ml纯化水，分别加入精密分析天平称取配方量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搅拌溶解。溶解后依次加入配方量的荧光增白剂、异硫氰酸荧光素和多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，混合均匀。然后依次加入配方量的丙三醇和Proclin 300。所有试剂加入完毕后，将混合溶液持续搅拌至完全溶解，将溶液倒入容量瓶后清洗烧杯并回收清洗液3次，用纯化水定容至1L。[0043]对比例3

对比例3公开一种荧光染色液，其原料的种类与实施例6相同，不同之处在于，荧光剂包括1g SYBR Green I和0.5g碘化丙啶。[0044]对比例4

对比例4公开一种荧光染色液，其原料的种类与实施例6相同，不同之处在于，荧光剂包括2g SYBR Green I和1.5g碘化丙啶。[0045]细菌检测试验

准备25个载玻片，每个载玻片上涂5uL金黄色葡萄球菌悬液（菌液浓度为106cfu/mL）成直径约1厘米的薄层，并加热固定。分别在载玻片上滴加一滴实施例1-5的荧光染色液（染色液以覆盖或淹没整个样品为准），每个实施例重复5次检测。加盖盖玻片，将载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察，检测结果见表3。[0046]准备25个载玻片，每个载玻片上涂5uL白色念珠菌悬液（菌液浓度为106cfu/mL）成直径约1厘米的薄层，并加热固定。分别在载玻片上滴加一滴实施例1-5的荧光染色液（染色液以覆盖或淹没整个样品为准），每个实施例重复5次检测。加盖盖玻片，将载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察，检测结果见表3。[0047]准备25个质控细胞片（每张质控片细胞量计数量范围为300～800个），分别在载玻片上滴加一滴实施例1-5的荧光染色液（染色液以覆盖或淹没整个样品为准），每个实施例重复5次检测。加盖盖玻片，将载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察，检测结果见表3。[0048]表3 实施例1-5荧光染色液的细菌检测结果

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从表3可以看出，经过实施例1-5的荧光染色液处理后的载玻片在荧光显微镜下均能够明显的观察到荧光的存在，说明荧光染色液对微生物或者细胞进行了染色，而且染色效果较好。参见图1，金黄色葡萄球菌在450-500nm激发光下呈现橙红色荧光，参见图2，白色念珠菌在450-500nm激发光下呈现橙红或橙黄色荧光，质控细胞在450-500nm激发光下呈现绿色或黄绿色荧光。荧光染色液将微生物和细胞染色，而背景相对干净，因此能够方便、快捷的通过荧光来判断微生物是否存在，从而达到检测微生物的目的。本申请的荧光染色液不具有特异性，在临床上应用荧光染色液时，当样本中含有不同微生物时，将不同微生物染色后结合形态学分析，即可鉴定样本中微生物的类别。

[0049]本申请还使用实施例1-5的荧光染色液分别对滴虫进行了检测试验，结果如图3所示，滴虫在荧光显微镜下呈现橙色荧光，结构明显、清晰。[0050]真菌检测试验

准备40个载玻片，每个载玻片上涂5uL霉菌悬液（菌液浓度为106cfu/mL）成直径约1厘米的薄层，并加热固定。分别在载玻片上滴加一滴实施例3、实施例6-12的荧光染色液（染色液以覆盖或淹没整个样品为准），每个实施例重复5次检测。加盖盖玻片，将载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察。[0051]准备40个质控细胞片（每张质控片细胞量计数量范围为300～800个），分别在载玻片上滴加一滴实施例3、实施例6-12的荧光染色液（染色液以覆盖或淹没整个样品为准），每个实施例重复5次检测。加盖盖玻片，将载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察。

[0052]检测结果显示，载玻片上的霉菌或细胞均带有荧光，并且孢子和假菌丝均着色清晰、形态典型，表明实施例6-12的荧光染色液均能够对霉菌进行有效的染色，将霉菌、细胞与背景很好的区分开，对霉菌的检测具有较高的准确性，有助于降低漏诊率和误诊率。[0053]对比实施例3与实施例6-7，实施例6添加了甲基绿，实施例7添加了果绿和亮绿，甲

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基绿、果绿和亮绿对细胞的染色均起到辅助的作用，结合甲基绿、果绿和亮绿的染色作用使得细胞结构的染色更清晰，因此实施例6-7的荧光强度更好，细胞更好辨别。[0054]实施例8-12使用了不同的荧光剂或者荧光剂组合，相应的，霉菌和细胞在荧光显微镜下观察到的颜色不同，但是仍然能够将霉菌与背景区分开，达到检测霉菌的目的。[0055]临床试验

准备100例被确诊为滴虫性阴道炎的阴道分泌物样本，样本选自2020年6月至2020年8月期间广东省深圳市多家医院妇科门诊收集的临床样本。[0056]准备载玻片，将附有样本的棉拭子在载玻片上轻轻涂片，按照上述真菌检测试验的方法，分别用实施例6、对比例1-4的荧光染色液对100例样本进行滴虫检测。其中对比例2的荧光染色液先滴加一滴A液，待稍干燥后再滴加一滴B液。将滴加实施例6、对比例1、对比例3-4的荧光染色液的载玻片置于激发光波长450-500nm的荧光显微镜下进行观察，将滴加对比例2的荧光染色液的载玻片置于激发光波长350-400nm的荧光显微镜下进行观察，检测结果见表4。

[0057]同时用直接涂片法对100例样本在荧光显微镜下进行滴虫检测，检测结果见表4。[0058]表4 实施例6、对比例1-4、直接涂片法的滴虫检测结果

注：*表示和实施例6相比，P<0.05，差异显著；**表示和实施例6相比，P<0.01，差异极显著。

从表4和图4可以看出，实施例6的荧光染色液处理后的载玻片在荧光显微镜下能够清楚的观察到两种不同荧光颜色的染色物，两种染色物均结构清晰可辨，容易检出，其中一种可以辨别为鳞状上皮细胞，另一种通过形态学分析得知其主要为滴虫和球菌，表明实施例6的荧光染色液在临床上对滴虫性阴道炎具有良好的检出效果，其滴虫的阳性率高达71%。

[0060]对比例1与对比例2 均为现有的荧光染色液，通过对比实施例6、对比例1-2和直接涂片法可以发现，对比例1和对比例2的阳性率相当，并均低于实施例6的阳性率，表明通过对比例1和对比例2的荧光染色液检测滴虫的效果差不多，并均差于实施例6的检测效果，但均显著比直接涂片法好，以此证明了本申请的荧光染色液相对于现有的荧光染色液和直接涂片法检测结果更加准确，漏诊率和误诊率更低。[0061]对比例3的荧光剂量不足，对比例4的荧光剂过量，通过观察实施例6、对比例3-4的检测结果，显然对比例3和对比例4的检出率下降了。荧光剂不足或者不足容易影响滴虫的荧光强度或者背景，使滴虫结构不清晰，从而影响对滴虫的观察。经过验证可知，当荧光剂、缓冲溶液和抑菌剂之间的配比为（1.8-2.7）：（9-11）：（0.2-0.5）时，滴虫的检出率最高，检测效果最好。

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[0059]

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本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的，本领域技术人

员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

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图2

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图3

图4

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